Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Регенерация скелетной мышечной ткани и методы ее стимуляции 16
1.2. Оптимизация регенерации сердечной мышечной ткани 33
1.3. Регенерация гладкой мускулатуры .55
1.4. Теоретические предпосылки использования биологического материала Аллоплант в качестве индуктора регенерации мышечных тканей .66
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 70
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 81
3.1. Результаты исследования заживления дефекта в скелетной мышечной ткани (контрольная группа) 81
3.2. Результаты исследования регенерации скелетной мышечной ткани после имплантации губчатого биоматериала Аллоплант (опытная группа) . 89
3.3. Обсуждение результатов исследования регенерации скелетной мышечной ткани .123
3.4. Динамика патоморфологических преобразований в миокарде кролика после воспроизведения острой ишемии (контрольная группа) 134
3.5. Морфология миокарда кроликов после введения диспергированного биоматериала Аллоплант при экспериментальной острой ишемии (опытная группа) . 152
3.6. Обсуждение полученных результатов регенерации сердечной мышечной ткани 187
3.7. Результаты исследования заживления миометрия рога матки самок кроликов 203
3.8. Результаты исследования заживления дефекта миометрия рога матки самок кроликов после ушивания (контрольная группа) .204
3.9. Результаты исследования заживления дефекта миометрия рога матки самок кроликов после применения объемно-волокнистого биоматериала Аллоплант (опытная группа) 206
3.10. Обсуждение результатов исследования заживления миометрия рога матки кроликов 220
3.11. Заключение 229
Практические рекомендации 232
Выводы 233
Список сокращений 235
Библиографический список
- Оптимизация регенерации сердечной мышечной ткани
- Результаты исследования регенерации скелетной мышечной ткани после имплантации губчатого биоматериала Аллоплант (опытная группа) .
- Морфология миокарда кроликов после введения диспергированного биоматериала Аллоплант при экспериментальной острой ишемии (опытная группа) .
- Результаты исследования заживления дефекта миометрия рога матки самок кроликов после применения объемно-волокнистого биоматериала Аллоплант (опытная группа)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема репаративного гистогенеза мышечных тканей является наиболее интенсивно разрабатываемой комплексной задачей современной биологической науки и клинической медицины (Клишов А.А., 1984; Данилов Р.К., 2008). Реституция тканей млекопитающих животных и человека происходит, как правило, только в эмбриональный период, а не в условиях взрослого организма (Тельцов Л.П. с соавт., 2006). Это различие можно объяснить относительно большей пропорцией стволовых и прогениторных клеток в тканях плода по сравнению с тканями взрослого, и тем более, стареющего организма ( H. et al., 2010; Raveh-Amit H., et al., 2013).
Заживление посттравматического повреждения скелетной мышечной ткани, заканчивается формированием грубоволокнистого фиброзного рубца, несмотря на большой потенциал для самовосстановления за счет миосателлитоцитов (Данилов Р.К., 2008; , et al., 2010).
Восстановление сердечной мышечной ткани после перенесенного
инфаркта миокарда всегда сопровождается образованием аваскулярной
плотной волокнистой соединительной ткани, приводящей к развитию
сердечной недостаточности. Сердце является терминально
дифференцированным органом и не обладает пластическими свойствами (Саркисов Д.С., 1979; Румянцев П.П., 1982; Kim W. H. et al., 1998;. Байдюк Е.В. с соавт., 2015). Однако, в последние годы в миокарде определен репарационный клеточный резерв, но он не возмещает дефицит функционально активных кардиомиоцитов (Beltrami A.P. et al., 2001; et al., 2005; еt al., 2006).
Ушивание дефектов матки, возникающих после хирургического иссечения доброкачественных опухолей яичников и миомы матки, в большинстве случаев приводит к грубым нарушениям анатомии и кровоснабжения органа (Базанов П.А., Волков Н.И., 2002; Сухих Г.Т. с соавт., 2010). Удовлетворительным результатом операции считается субституция, наличие которой повышает риск осложнений при последующей беременности и родах (Кулаков В.И., Шмаков Г.С., 2001; Адамян Л.В., Ткаченко Э.Р., 2003; Краснопольскии В.И., Логутова Л.С., Буянова С.Н., 2013). Обеспечение условия для адекватного функционирования миоцитов является злободневной задачей.
Актуальной проблемой является идентификация механизмов регуляции
формирования регенерата различных видов мышечной ткани на тканево-
клеточном уровне. Анализ паренхиматозно-стромальных взаимоотношений
отражает процессы межклеточных взаимодействий и является
основополагающим звеном структурного гомеостаза ткани. Понимание этих механизмов необходимо для развития тканевой и органной инженерии.
Экспериментальные и клинические исследования основываются на
применении различных методов: аутопластика, аллопластика, ксенопластика,
применение факторов роста, методах клеточной и генной терапии и т.д.
Большинство существующих технологий являются трудоемкими,
травматичными и сопряжены с осложнениями (Булякова Н.В., Азарова В.С.
2013 а,б). Одним из направлений регенеративной медицины является
использование биодеградируемых трансплантатов различного
происхождения с целью замещения дефекта, возникшего в связи с
иссечением патологически измененной ткани или деструктивно-
дистрофическим повреждением органа. Для этого используются материалы синтетического или биологического происхождения как самостоятельно, так и в качестве клеточных носителей (Зорин В.Л. с соавт., 2010 S.B. et al., 2010; J.D., C.M., B.D., 2012). Существующая проблема элиминации антигенных свойств биоматериалов, создание необходимых условий для выживания культивируемых клеток после пересадки, подавление реакций клеточного и гуморального иммунитета у реципиента заставляет разрабатывать новые ключевые подходы в области применения трансплантатов.
Одним из наиболее успешно развивающихся направлений в
регенеративной медицине является использование биодеградируемых
трансплантатов аллогенного происхождения. В ФГБУ «Всероссийский центр
глазной и пластической хирургии» МЗ РФ разработаны биоматериалы
Аллоплант, которые обладают низкими антигенными свойствами и после
имплантации постепенно замещаются полноценным по структуре
регенератом. Биоматериалы Аллоплант в различной модификации используются не только для восполнения объемных физических дефектов, но и как эффективные стимуляторы регенерации соединительной ткани при деструктивно-дистрофических патологиях через направленную миграцию и индукцию собственных клеток организма (Муслимов С.А., 2000; Лебедева А.И., 2004; Мусина Л.А., 2006 а,б). Механизмы реализации регенеративного потенциала биоматериала Аллоплант в мышечных тканях остаются неизвестными.
Степень разработанности проблемы. В процессе изучения некоторых аспектов регенерации скелетной мышечной ткани после повреждения большое внимание уделяется течению регенерационного процесса. Установлены стадии регенерации, описаны элементы каждой стадии, сроки регенерации, определена камбиальность мышечной ткани (Мауро А., 1961, Студитский А.Н., 1959, Данилов Р.К., 2008; Одинцова И.Е., 2012). Заживление сердечной мышечной ткани после ишемического повреждения
заканчивается формированием рубца. Считается, что кардиомиоциты не обладают регенеративными возможностями и лишены резервных клеток (Румянцев П.П., 1982; Байдюк Е.В., с соавт., 2015). Однако, существует и противоположная точка зрения. Ряд исследователей выявили стволовые клетки c-kit в миокарде (Olivetti G., Ricci R., Anversa P., 1987; Quaini F., et al., 1994; Olivetti G., et al., 1996; Чудиновских Ю. А., 2011; et al., 2007; Beltrami A.P. et al., 2003). Также, были обнаружены резидентные кардиомиогенные клетки (Непомнящих Л.М. с соавт., 2010; Голованова Т.А., Белостоцкая Г.Б., 2011). Регенерация миометрия матки исследована достаточно хорошо. Основной клеточной популяцией, участвующей в заживлении ран являются пролиферирующие малые лейомиоциты с последующей гипертрофией (Созыкин А.А. 2004; Зашихин А.Л., Селин Я., 2001). Не отрицается влияние стволовых слеток, расположенных в миометрии и эндометрии (, , 2013; 2014). Однако, скорость фибриллогенеза значительно превышает скорость пролиферации миоцитов.
Анализ современной литературы показывает, что имеется ряд
малоисследованных вопросов по стимуляции регенерации различных видов
мышечных тканей, изучение которых будет способствовать не только
теоретическому пониманию механизмов регенерационного процесса, но и
является актуальным для решения задачи влияния на течение заживления ран
механического и биологического повреждения. Данных об эффективных
методах стимуляции недостаточно. Результаты этих исследований
открывают перспективу для разработки принципиально нового подхода к
лечению поврежденных мышечных тканей – заместительной терапии с
применением биологического каркаса, представляющего собой
децеллюляризированный внеклеточный матрикс аллогенного
происхождения. Дальнейшая работа невозможна без детального
исследования некоторых факторов трофического влияния: васкулогенеза и иннервации.
В связи с этим, целью данного исследования явилось раскрытие регенераторного потенциала скелетной, сердечной и гладкой мышечных тканей в модельных экспериментах на животных с применением биоматериалов Аллоплант. Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:
-
Изучить гистогенез скелетной мышечной ткани при миопластике субтотального дефекта икроножной мышцы биоматериалом губчатой модификации. Определить возможные источники репаративного гистогенеза скелетной мышечной ткани.
-
Выявить механизмы регенерации сердечной мышечной ткани, индуцированной диспергированным биоматериалом при остром
инфаркте миокарда. Определить возможные источники репаративного морфогенеза миокарда.
-
Изучить особенности регенерации гладкой мускулатуры матки при замещении ее дефекта объемно-волокнистым биоматериалом. Определить возможные источники репаративного морфогенеза миометрия.
-
Определить морфофункциональные особенности макрофагов, как ключевого звена репаративной регенерации мышечных тканей.
5. Выявить роль профиброгенных и противофиброгенных факторов в
регенерации мышечных тканей, стимулированной аллогенными
биоматериалами и в контроле без применения биоматериалов.
6. Обосновать применение аллогенных биоматериалов для реализации
резервного клеточного потенциала мышечной ткани в свете
регенеративной медицины.
Научная новизна исследований. Впервые была применена губчатая модификация биоматериала Аллоплант для пластики субтотального дефекта брюшка икроножной мышцы у экспериментальных животных. Впервые описаны репаративные процессы при замещении дефекта скелетной мышцы губчатым соединительнотканным трансплантатом, сопровождающимся синтезом всех структурных элементов: кровоснабжения, эпимизия, перимизия, иннервации. Показана роль аллогенного биоматериала в индукции, дифференциации и направленной миграции миосателлитоцитов.
Впервые на моделях с применением экспериментальных животных
показана возможность индукции, стимулирования и дифференциации
стволовых клеток миокарда при интрамиокардиальном способе введения
диспергированного биоматериала Аллоплант в ишемически поврежденную
зону. Установлено, что в процессе регенерации после имплантации
биоматериала Аллоплант происходит синтез мышечно-
соединительнотканного регенерата, состоящего из рыхлой соединительной
ткани и сердечных миоцитов. Выявлено, что формирование
функционального регенерата в миокарде экспериментальных животных
после использования аллогенного биоматериала сопровождается
восстановлением всех составляющих элементов сердечной ткани - усилением степени васкуляризации за счет ангиогенеза, иннервации.
Впервые экспериментально обоснована возможность применения аллогенных биоматериалов для восстановления анатомической целостности стенки матки и профилактики рубцовых изменений. Установлено, что биоматериал Аллоплант стимулирует пролиферацию клеток миометрия, рост кровеносных сосудов и замещается адекватным органотипическим регенератом.
Доказано, что репаративные возможности скелетной, сердечной и гладкой мышечных тканей осуществляются на фоне ингибирования факторов
фиброза и низкой степени секреции TGF-1. Выявлена роль макрофагов в регенерационном процессе поврежденных мышечных тканей. Установлено, что при замещении биоматериала Аллоплант макрофаги М1 системы активации становятся доминирующими клетками гистиона. Изучены факторы биодеградации биоматериала Аллоплант при регенерации мышечных тканей, определены их гистоиндуктивные свойства.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты
исследования могут быть использованы в практическом здравоохранении у
человека, в ветеринарной медицине у животных при проведении
хирургических манипуляций, связанных с восстановлением глубоких
повреждений скелетной мышечной ткани, индукции регенерации мышечной
стенки матки, профилактики рубцовых изменений миокарда. Установление
патоморфологических механизмов регенерации мышечных тканей с
использованием биоматериалов, могут быть использованы для разработки
принципов регенеративной медицины. Полученные данные могут быть
использованы для создания структурно - функциональных скаффолд-систем
для ткано-инженерных конструкций. Результаты диссертации используются
в практической работе при анализе биопсийного материала в
патологоанатомических отделениях клиник, отделе морфологии ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» МЗ РФ. Материалы работы можно использовать при проведении теоретических и практических занятий со студентами и врачами на кафедре патологической анатомии, при чтении лекций на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии, на кафедре физиологии человека и зоологии ФГБО ВПО «Башкирский государственный университет», на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВО «Башкирский государственный аграрный университет», на курсах и семинарах повышения квалификации врачей офтальмологов ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» МЗ РФ, для врачей травматолого-ортопедического, хирургического профиля, акушеров-гинекологов, кардиологов, ветеринарных врачей.
Методология и методы исследования. В процессе исследований
применяли современный методологический подход к изучению
биологических закономерностей заживления поврежденных мышечных
тканей посттравматического и ишемического характера. С целью изучения
была проведена серия экспериментов с применением экспериментальных
животных. Моделирование объемных дефектов в скелетной и гладкой
мышечной ткани осуществляли путем формирования объемного дефекта. А в
сердечной мышечной ткани для достижения ишемических повреждений
проводили лигирование коронарной артерии. В опытной группе для
стимуляции регенерации использовали аллогенные биоматериалы.
Гистологическое исследование тканей проводилось в сравнительном аспекте
с контрольной группой животных, где заживление происходило в результате
ушивания мышечных дефектов или спонтанного заживления.
Методологической основой изучения проблемы является комплекс
морфологических методов, включающий ряд светооптических,
гистохимических, электронно-микроскопических, иммуногистохимических, морфометрических исследований. Полученные числовые данные подвергали статистической обработке.
Реализация результатов исследования.
-
Результаты работы внедрены в ФГБУ «Всероссийский центр глазной и пластической хирургии» МЗ РФ в клиническую практику отделений офтальмохирургии, отдела морфологии, в производственную практику работы лаборатории консервации тканей; в ФГБУ «Научно-исследовательский институт кардиологии» (г. Томск); в ГБУЗ РБ Больницы скорой медицинской помощи (г. Уфа) в отделении гинекологии, в ГБУЗ РБ КБ №1 (г. Стерлитамак) в отделении гинекологии.
-
Приказом Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения (Росздравнадзор) от 03.02.2015г. № 686 Аллотрансплантаты для хирургии «Аллоплант» по ТУ 9398-001-04537642-2011 (аллогенные биоматериалы) допущены к обращению на территории Российской Федерации. Материалы проведенных исследований включены в монографию «Alloplant@ Регенеративная медицина» (Уфа, 2014).
-
Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при изложении лекционного курса и проведении практических занятий на кафедре физиологии человека и зоологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет», на кафедре гистологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» МЗ РФ, на кафедре морфологии, патологии, фармации и незаразных болезней ФГБОУ ВО «Башкирский государственный аграрный университет», на кафедре морфологии, физиологии и патологии факультета ветеринарной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный аграрный университет».
Личный вклад диссертанта в исследование. Автором лично выполнены морфологические исследования в отделе морфологии ФГБУ «ВЦГПХ» МЗ РФ. Весь материал диссертации проанализирован и обработан с использованием математических методов лично автором. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались лично, с соавторами и научным консультантом.
Положения, выносимые на защиту. Применение губчатой
модификации аллогенного биоматериала для замещения объемного дефекта скелетной мышечной ткани способствует индукции, дифференциации и
направленной миграции миосателлитоцитов, в результате чего на месте дефекта формируется органотипичная ткань с основными составляющими элементами – поперечноисчерченными мышечными волокнами, эндомизием, перимизием и восстановленным кровообращением и иннервацией.
Интрамиокардиальное введение диспергированного аллогенного
биоматериала способствует улучшению морфогенеза ишемически
поврежденного миокарда у экспериментальных животных за счет интенсификации кровообращения, миграции и пролиферации стволовых (с-kit) и коммитированных (GATA-4) клеток, стимуляции внутриклеточной регенерации на фоне ингибирования фиброза.
Объемно-волокнистая форма биоматериала Аллоплант после пересадки
в дефект стенки рога матки экспериментальных животных в процессе
биодеградации вызывает пролиферацию, дифференциацию лейомиоцитов.
Заживление заканчивается полноценной реституцией поврежденной ткани за
счет ингибирования процесса синтеза коллагена и адекватной
васкуляризации.
Биоматериалы Аллоплант стимулируют миграцию и дифференциацию макрофагов М1 системы активации, что приводит к полноценному фагоцитозу и снижению антигенности в ране. Продукты биодеградации ингибируют экспрессию профиброгенных клеточных факторов (TGF-1, FGF-1), регулируют функциональную активность фибробластических клеток, ингибируют миграцию их предшественников (vimentin+ клеток) и являются индукторами стволовых и коммитированных клеток в мышечных тканях.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты
работы получены на современном сертифицированном оборудовании с
использованием комплекса современных методов сбора и обработки
информации. Оценка степени достоверности представленных в
диссертационной работе результатов опирается на соответствие
теоретических заключений, статистическим расчетам комплекса
проведенных исследований.
Материалы диссертации изложены на IV Азиатско-Тихоокеанском
международном конгрессе анатомов (Kusadasi, Turkey, 2005), на симпозиуме
«Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Москва,
2007), на IX конгрессе международной ассоциации морфологов (Бухара
2008), на Всероссийской конференции с международным участием
«Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток»
(Москва, 2008), на IV Всероссийском съезде трансплантологов памяти акад.
В.И.Шумакова (Москва, 2008), на VI Всероссийском съезде анатомов,
гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009), на межрегиональной научно-
практической конференции, посвященной 100-летию основания
патологоанатомической службы Республики Башкортостан (Уфа, 2010), на
XX конгрессе Европейской ассоциации тканевых банков (Барселона, 2011),
на Всероссийской конференции «Регенеративная биология и медицина»
(Москва, 2011), на V Всероссийском симпозиуме с международным участием
«Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии» (Уфа, 2012),
на I Национальном конгрессе по регенеративной медицине (Москва, 2013),
на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы
морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов», посвященной
памяти чл.-кор. АМН СССР профессору Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013), на
объединенном конгрессе международной ассоциации морфологов и VII
съезде Всероссийского научного медицинского общества анатомов,
гистологов и эмбриологов (Тюмень, 2014), на VII Всероссийском съезде
трансплантологов (Москва, 2014), на III Межрегиональной научно-
практической конференции «Клеточные технологии практическому
здравоохранению» (Екатеринбург, 2014), на Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием, посвященной
памяти доктора ветеринарных наук, профессора Х. Х. Абдюшева (к 120-
летию со дня рождения) (Уфа, 2015), на II Национальном Конгрессе по
регенеративной медицине (Москва, 2015), на XII Международной
конференции «Фундаментальные проблемы лимфологии и клеточной
биологии» (Новосибирск, 2016).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 42 печатные работы, из них 21 статья в рецензируемых
журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией
Министерства образования и науки Российской Федерации, 1 статья в журнале, индексируемом в международных системах цитирования Scopus. Издана 1 коллективная монография и 1 учебное пособие.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из оглавления,
введения, обзора литературы, экспериментальной части (описания
материалов и методов исследования), результатов собственных
исследований, обсуждения полученных результатов, практических
рекомендаций, выводов и списка использованной литературы. Указатель литературы содержит сведения о 533 источниках, 161 на русском и 372 на иностранных языках. Диссертационная работа изложена на 293 страницах компьютерного текста. Иллюстрации представлены 122 микрофотографией, цифровой материал сгруппирован в 16 диаграммах, приведены 2 схемы, 1 таблица.
Оптимизация регенерации сердечной мышечной ткани
Ранним этапом развития скелетной мышечной ткани является сегментация осевой мезодермы, которая заканчивается образованием сомитов. Следующий этап характеризуется детерминацией клеток в сомитах. Этот процесс находится под контролем окружающих тканей, в частности, хорды и нервной трубки. Удаление нервной трубки приводит к нарушению формирования мышцы (Stockdale F.E., Nikovits W., Christ B., 2000; Beck C. W., Christen B., Slack J.M.W., 2003). После сегментации мезодермы и образования сомитов происходит разделение на миотом. Из дерматома и склеротома, формируются кожные, скелетные и мышечные структуры. После формирования дермамиотома и склеротома наблюдается экспрессия гена Pax 3. Этот ген является одним из основных регуляторов начальных этапов миогенеза (Buckingham M., Relaix F. . 2007; Озернюк Н.Д., Балан О.В., 2009). Формирование миотомов происходит в результате разделения дермамиотома на дерматом и миотом. Этот процесс регулируется генами семейства Shh, расположенных в вентральных осевых тканях и генами семейства Wnt – из дорсальной части нервной трубки (Munsterberg A.E., Kitajewski J., Bumcrot D A. et al., 1995; Munsterberg A.E., Lassar A.B., 1995).
Скелетная мышечная ткань развивается из миотомов мезодермы. Миотомы представляют собой дорсомедиальную часть сомита дорсальной мезодермы. В места закладки скелетных мышц мигрируют стволовые клетки миотома (Клишов А.А., 1984). Стволовые клетки миотомов последовательно проходят следующие стадии: миобластическую, миосимпластическую, мышечных трубочек (миотуб), молодых и зрелых мышечных волокон (Клишов А.А., 1984; Buckingham с соавт., 2003).
Промиобласты характеризуются высоким пролиферативным потенциалом, способностью вступать в контакт друг с другом и образовывать путем слияния многоядерные симпласты. При ультраструктурном исследовании выяснено, что они имеют веретеновидную форму, высокое ядерно-цитоплазматическое отношение, смещенное в сторону ядра. Крупное светлое ядро содержит 1-3 ядрышка, в котором преобладает эухроматин. Среди органелл обнаруживаются органеллы общего значения: небольшие митохондрии с темным матриксом, рибосомы, полисомы, цистерны эндоплазматической сети, гранулы гликогена, редкие капли липидов (Danilov R K., 1982). Промиобласты проходят ряд митотических делений, после чего путем дивергентной дифференцировки возникают два дифферона – клеточный (миосателлитоциты) и симпластический. Эти этапы миогенеза регулируются специфическими белковыми факторами – генами семейства bHLH. К данному семейству генов относятся и гены специфических транскрипционных факторов MyoD, Myf5, myogenin и Mrf4 (Sabourin L.A., Rudnicki M.A. 2000; Buckingham M., Relaix F. 2007; Балан О. В., 2009). Причем, Myf5 и myogenin два взаимозаменяемых фактора. У мутантных мышей с дефицитом гена Myf5 myogenin также может способствовать миогенезу (Wang Y., Jaenisch R., 1997).
Впоследствии, мышечная масса подвергается экстенсивному росту в пренатальный и послеродовой период, и этот рост поддерживают миосателлитоциты, расположенные в нише между плазмалеммой и базальной пластинкой волокон (Tajbakhsh S., 2003). Впервые клетки-сателлиты были идентифицированы и описаны А. Mauro (1961). Неактивированные миосателлитоциты характеризуются темными ядрами овальной или округлой формы с преобладанием гетерохроматина. Кариолемма ровная, ядрышки отсутствуют. Ядерно-цитоплазматическое отношение смещено в сторону ядра. В узком ободке цитоплазмы выявляются органеллы общего значения – 1-2 митохондрии, свободные рибосомы, короткие каналы эндоплазматической сети. Данные клетки относятся к миосателлитоцитам I вида. Они служат камбиальным резервом мышечной ткани и сохраняются на всем протяжении жизни мышечного волокна (Danilov RK., 1982; Данилов Р.К., 2008; Одинцова И.А., 2012).
В скелетных мышцах содержатся два типа сателлитных клеток. Первый тип клеток относится к миогенным предшественникам, второй – мультипотентные сателлитные клетки взрослого организма. Покоящиеся клетки спутники имеют ген фактора транскрипции Pax 7 (Zammit PS, Relaix F, Nagata Y et al., 2006; Brack A.S., 2014), но они не экспрессируют миогенные регуляторы семейства bHLH (Сooper R. N., Tajbakhsh S., Mouly V., et al., 1999). Среди наиболее надежных маркеров миосателлитоцитов в мышцах человека служит CD56, хотя данный маркер определяется и у лимфоцитов (Dhawan J., Rando T.A., 2005).
На протяжении миогенеза баланс между пролиферацией, дифференцировкой и слиянием необходим для правильного формирования окончательных структур мышцы (Tatsumi, R., A. Hattori, Y. Ikeuchi, J.E. et al. 2002, Buckingham, M., L. Bajard, T. Chang, P., 2003). Многие положительные и отрицательные сигналы несут ответственность за регулирование такого тонкого баланса, действующие на эмбриональном / пренатальном этапе и после родов. Они включают в себя факторы транскрипции, такие как MyoD, Myf5, MRF4, и миогенин, а также внеклеточные агонисты и антагонисты, такие как члены семейства инсулиноподобного фактора роста IGF и TGF, FGF, фактора роста гепатоцитов, и костного морфогенетического белка (BMP) и его антагонистов (Balemans, W., and W. Van Hul. 2002; Parker, M., Seale P., Rudnicki M., 2003). Оксид азота (NO) регулирует основные функции взрослых скелетных мышц, такие как деятельность нервно-мышечного синапса, связь возбуждение-сокращение, расширение кровеносных сосудов, глюкозы, функции митохондрий и биогенез, гликолиз (Wang, T., Xie Z., Lu B.. 1995; Balon T.W., Nadler J.L.. 1997; Clementi, E., Brown G.C., Feelisch M., et al., 1997; Wolosker и др., 1997; Bredt, 1998; Stamler, J.S., Meissner G. 2001; Eu J.P., Hare J.M., Hess D.T., et al., 2003; Nisoli E., Falcone S., Tonello C., et al., 2004). Также известно о ключевой роли оксида азота (NO) / циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ) в регуляции слияния миобластов во время мышечного развития (Pisconti A., Brunelli S., Padova M. et al., 2003). Открыт новый белок миомейкер— это высококонсервативный белок, состоящий из 221 аминокислоты и имеющийся у всех позвоночных. Это необходимый для миогенеза белок, без которого невозможно образование мышечных волокон. Он локализован в мембранах мышечных клеток и вызывает их «объединение» в одно мышечное волокно (Bentzinger C.F., Wang Y. X., Rudnicki M. A., 2012; Douglas P. Millay, Jason R. O Rourke, Lillian B. Sutherland et al., 2013). Рецепторы MOR23 являются факторами адгезии и клеточной миграции миосателлитоцитов и участвуют в организации и формировании мышечного волокна. Утрата рецепторов MOR23 приводит к увеличению ветвящихся миофибрилл и обычно ассоциируется с мышечной дистрофией (Griffin Ch. A., Kafadar K. A., Pavlath G. K., 2009).
Результаты исследования регенерации скелетной мышечной ткани после имплантации губчатого биоматериала Аллоплант (опытная группа) .
Морфогенез матки в раннем периоде внутриутробного развития млекопитающих животных и человека начинается из парамезонефрального протока, расположенного в общем мезенхимном тяже. Он тесно связан с формированием сосудистого и нервного компонентов (Дорохович Г. П., Татун Т. В. 2008; Гребенькова Н. В., 2013).
В эмбриональном гистогенезе формирование лейомиоцитов происходит из общего с фибробластами стволового мезенхимного предшественника в результате дивергентной дифференцировки. Лейомиоциты проходят этапы промиобласта, миобласта, дифференцирующихся и дифференцированных миоцитов (Созыкин А.А., 2004; Karamariti E., Margariti A., Winkler B. et al., 2013; Шурыгина О.В., Ямщиков Н.В., Абрамов В.Н. с соавт., 2014).
В составе гладкой мышечной ткани внутренних органов выделяются субпопуляции малых, средних и больших контрактильных лейомиоцитов, различающихся по своим линейным параметрам и структурно-метаболическим характеристикам (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., 1997; Зашихин А.Л., Селин Я., 2001). Группа малых клеток представлена растущими миоцитами и малодифференцированными предшественниками, характеризующимися слабым развитием внутриклеточных органелл, высоким ядерно-цитоплазменным показателем и тесно интегрирована с окружающими гладкомышечными клетками (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., 1997). Средняя - составляет основу популяции. Большие миоциты являются самыми малочисленными, представляют собой терминальное звено миобластического дифферона. Средние размеры гладких мышечных клеток характеризуются межвидовыми и межорганными различиями, но общий принцип организации популяционной структуры лейомиоцитов остается постоянным (Зашихин А.Л., Селин Я., 2001). Фенотипически различают: сократительные, синтетические и сократительно-синтетические клетки. Среди сократительных миоцитов выделяют светлые и темные, характеризующиеся различным уровнем электронной плотности цитоплазмы, которые отличаются разным функциональным состоянием клеток. Для темных клеток характерна упорядоченная организация филаментов, более плотное и однонаправленное их расположение. В светлых миоцитах элементы контрактильного аппарата расположены рыхло и беспорядочно, кортикальная зона свободна от миофиламентов (Зашихин А.Л., Агафонов Ю.В., 2008; Григорьева Ю.В., Ямщиков Н.В., Ренц Н.А. с соавт., 2014). Гладкие мышечные клетки обладают высокой фенотипической пластичностью, что позволяет быстро адаптироваться к колебаниям окружающей среды. Регуляция фенотипа лейомиоцитов осуществляется взаимодействием между фактором сыровоточного ответа (SRF) кофактором взаимодействия SRF-CArG коробки ДНК и основной программой модификации гистонов (Oliver G. McDonald, Gary K. Owens, 2007). Фенотип лейомиоцитов характеризуется экспрессией гладкомышечных сократительных белков, таких как -актин гладкой мышцы (-SMA), H 1 -кальпонин, миотеллин гладких мышц, тяжелой цепи миозина (Owens G.K., Kumar M.S., Wamhoff B.R., 2004) .
Физиологическая и репаративная регенерация гладкой мышечной ткани Гладкая мышечная ткань характеризуется высокой способностью к регенерации (Санжапова А.Ф., Кондратенко Ю.Н., Сыч В.Ф. с соавт., 2011). Источником образования гладкой мышечной ткани являются малодифференцированные мезенхимные клетки, вступившие на путь миогенной дифференцировки. В динамике гистогенеза лейомиоциты проходят стадии промиобластов, миобластов, дифференцирующихся и дифференцированных миоцитов. Они осуществляются клеточным и внутриклеточным механизмами. Субпопуляция малых миоцитов, находящихся в прираневой зоне является источником клеточной регенерации: после митотических делений они заселяют зону повреждения, участвуя в восстановлении целостности ткани. Светлые миоциты пограничной с повреждением зоны претерпевают перестройку синтетического аппарата, в итоге чего осуществляется внутриклеточная регенерация и гипертрофия этих клеток. (Суворова Г. Н., 2001). Источником гипертрофии гладкой мышечной ткани являются ДНК-синтезирующие лейомиоциты (Гансбургский А.Н., 2004). Гипертрофия клеток характеризуется усилением полиплоидности и активацией миофибриллярного аппарата (Кауффман О.Я., 1974). Дополнительным источником гипертрофии мышечной ткани является малодифференцированные миоциты, клетки фибробластического ряда (Баженов Д.В., 1998), дифференциальные миоциты (Дубинко Г.А., 1966; Вержбицкая Н.И., 1974), премиобласты, интегрированные в состав мышечной оболочки (Зашихин А. Л., 1997), камбиальные элементы, расположенные на периферии мышечной оболочки (Гладкий А.П., 1976).
Гладкая мышечная ткань миометрия взрослых особей животных образована в основном популяцией сократительных гладких миоцитов, интегрированных в два пласта с продольной (наружный пласт) и циркулярной (внутренний пласт) ориентацией и разделенных интерстицием. Клеточный дифферон в развивающейся гладкой мышечной ткани миометрия представлен несколькими типами лейомиоцитов: малодифференцированными, дифференцирующимися, дифференцированными. По ходу её гистогенеза происходит нарастание мономорфности популяции дифференцирующихся лейомиоцитов, усложнение межмиоцитарных взаимоотношений, падение их пролиферативной активности, элиминация некоторых из них апоптозом. Наблюдается возрастание относительного объема гладких миоцитов в ткани и уменьшение относительного объема клеточного ядра, значительная редукция органелл биосинтеза и, как следствие, - снижение интенсивности образования сократительного аппарата, межклеточного вещества и др. (Созыкин А.А., 2004; Ямщиков Н. В., Шурыгина О. В., 2010). Малодифференцированные предшественники составляют популяцию лейомиоцитов. Это мелкие клетки со слабо развитым спектром органелл и высоким ядерно-цитоплазматическим отношением (Ono, M., Qiang, W., Serna, V.A. et al., 2012). Ряд авторов выделяют в отдельную популяцию взрослые прогениторные стволовые клетки матки (myoSP), участвующие в ремоделяции ткани. Они митотически делятся с образованием дочерних клеток (Maruyama T., Ono M, Yoshimura Y., 2013; Ono M., Bulun S.E., Maruyama T., 2014). Клетки myoSP проявляют свойства малодифференцированных клеток: экспрессируют CD90, CD73, CD105, и Stro-1, большинство данных клеток CD34-позитивны и CD44-отрицательные (Ono M., Maruyama T., Masuda H. et al., 2007). Г. В. Безнусенко рассматривает субпопуляцию клеток сосудистой зоны в качестве основного пролиферативного пула миометрия. Расположение этих клеток на границе между наружным и внутреним слоями может свидетельствовать о том, что они являются источником миометрия. Они обладают максимальной пролиферативной активностью и располагаются непосредственно около сосудов или в их стенках. Интенсивно пролиферирующие перициты новообразованных сосудов являются своеобразным "камбием" для популяций соединительнотканных и гладких мышечных клеток миометрия (Безнусенко Г. В., 1997).
Несмотря на наличие регенеративного пула миометрия, механическое растяжение нижнего сегмента матки и разрез приводит к некрозу гладких миоцитов и разрывам коллагеновых волокон, как в составе эндометрия, так и миометрия, что ведет к нарушению архитектоники их расположения и, как следствие, к биомеханической дисфункции данного отдела органа. Репарация осуществляется за счет фибробластов (Лалоян Р.С. Созыкин А.А., 2002; Григорьева Ю.В., Ямщиков Н.В., Бормотов А.В., 2013) и смены фенотипа миоцитов с сократительных на сократительно-синтетические (Григорьева Ю. В., 2014). Это, как правило, приводит к формированию различного вида рубцов, что обуславливает высокий риск разрыва матки по рубцу при повторных беременностях (Демура Т. А., 2014).
Морфология миокарда кроликов после введения диспергированного биоматериала Аллоплант при экспериментальной острой ишемии (опытная группа) .
Через 3-е суток после нанесенного субтотального дефекта с последующим ушиванием скелетной мышцы голени выявлялись морфологические признаки острого воспаления. В строме наблюдались обширные поля кровоизлияний. Разрушенные, разволокненные гомогенизированные мышечные волокна были инфильтрированы воспалительными клетками: полиморфноядерными лейкоцитами, тучными клетками, макрофагами, лимфоцитами. Обнаруживался отек межпучковых пространств. Наблюдались признаки дилятации кровеносных сосудов, их разрывы. Саркомеры в волокнах не определялись. Также, в строме наблюдались гнойные абсцессы: обширные конгломераты раневого детрита, инфильтрированного массивными скоплениями полиморфноядерных лейкоцитов (Рисунок 4).
Спустя 7 суток в центральной зоне дефекта сохранялись очаги острого воспаления. Выявлялись обширные скопления полиморфно-ядерных лейкоцитов, раневой детрит. В периферической зоне наблюдались признаки развития грануляционной ткани. Воспалительный клеточный инфильтрат замещался многочисленными макрофагами, лимфоцитами, клетками фибробластического ряда, среди которых превалировали малодифференцированные мезенхимные клетки. Стволовые мезенхимные клетки при помощи нексусов соприкасались друг с другом и образовывали густую сеть (Рисунок 5).
В интерстициальном пространстве выявлялись пучки новообразованных коллагеновых волокон различной толщины. Причем, при импрегнации препаратов солями серебра по Футу эти волокна обладали аргентофильными свойствами и классифицировались как незрелые ретикулиновые волокна III типа (Рисунок 6).
Воспалительная инфильтрация и разрушенные мышечные волокна через 3-е суток после нанесения дефекта в скелетной мышечной ткани. Окраска гематоксилином и эозином. Грануляционная ткань в реактивной зоне через 7 суток после нанесения дефекта в скелетной мышечной ткани. Инфильтрация нейтрофилами, макрофагами, мезенхимными клетками. Появление тонких коллагеновых волокон. Окраска гематоксилином и эозином. Грануляционная ткань была пронизана тонкостенными разнонаправленными гемокапиллярами. В просветах сосудов определялись форменные элементы крови. В процессе восстановления скелетной мышечной ткани участвовали как миосателлитоциты, так и мышечные ядерно-саркоплазматические сегменты в виде укороченных фрагментов миосимпластов с ядерными цепочками и ядерными сумками, расположенными по периферии (Рисунок 7).
Наряду с признаками миогистогенеза, в реактивной зоне выявлялись признаки дисрегенерации. Среди миогенных и соединительнотканных клеток обнаруживались адипоциты с разнокалиберными жировыми каплями (Рисунок 8). При исследовании суммарной фракции ГАГ (реакция Хейла) травматическая и паратравматическая зоны окрашивались слабо (Рисунок 9). При дифференциации ГАГ в регенерате определялась слабая альцианофилия на присутствие хондроитин-4,6-сульфата, дерматан- и кератансульфатов, что свидетельствовало об их низком количестве (Рисунок 10). Реакция на наличие гиалуроновой кислоты была отрицательной.
Через 14 суток после эксперимента выявлялись признаки развития соединительнотканно - мышечного регенерата с доминированием волокнистой соединительной ткани. Резецированные мышечные волокна запечатывались коллагеновыми волокнами за счет наплыва сарколеммы. Выявлялись признаки образования аваскулярного грубоволокнистого рубца, организованного толстыми пучками коллагеновых волокон, как со стороны резецированных мышечных волокон, так и со стороны реактивной грануляционной ткани, образованной на месте мышечного дефекта.
Грануляционная ткань была инфильтрирована макрофагами, фибробластами, лимфоцитами, адипоцитами. Фенотипизм макрофагов при ультраструктурном исследовании был различный, но количество секреторных макрофагов превосходило по численности фагоцитарные. Овальное ядро секреторных макрофагов содержало большое количество эухроматина. Гетерохроматин в виде тонкой полосы концентрировался вдоль внутренней ядерной мембраны. В широком ободке цитоплазмы был хорошо развит везикулярно-вакуолярный аппарат. Макрофаги контактировали не только с иммунными клетками, но и друг с другом. Возле макрофагальных клеток в непосредственной близости выявлялись лимфоциты с типичной для них ультраструктурой. Наряду с секреторными макрофагами в ткани определялись эпителиоидные клетки. В цитоплазме эпителиоидных клеток наблюдалось довольно ограниченное количество органелл, среди которых определялись: комплекс Гольджи, короткие и редкие каналы ГЭР, единичные рибосомы, пиноцитозные пузырьки. Фагоцитарная функция данных клеток проявлялась слабо, о чем свидетельствовало отсутствие в цитоплазме лизосом и фаголизосом; обнаруживались лишь единичные остаточные тельца, окаймленные двойной мембраной. Выявлялось умеренное количество митохондрий средних размеров с признаками набухания. Они характеризовались округлой формой и резким просветлением матрикса, размытыми и разрушенными кристами. Обращало на себя внимание наличие густой сети микрофибрилл и тонофиламентов, локализующихся как в перинуклеарной зоне, так и на периферии клетки. Их цитолемма образовывала длинные пальцеобразные интердигитации посредством которых они объединялись друг с другом, сливались и образовывали гигантские клетки инородных тел.
Гигантские клетки инородных тел были представлены крупными многоядерными клетками. В широком ободке цитоплазмы наблюдался дефицит органелл специфичных для фагоцитов. Выявлялись лишь органеллы общего значения: единичные округлые митохондрии, короткие каналы ГЭР, распыленные рибосомы, мелкие везикулы. В ядрах гетерохроматин конденсировался вдоль внутренней ядерной мембраны и центрально в виде глыбок (Рисунок 11).
Результаты исследования заживления дефекта миометрия рога матки самок кроликов после применения объемно-волокнистого биоматериала Аллоплант (опытная группа)
Полученные результаты свидетельствуют о том, что в контрольной (ушивание раны) и опытной (применение ГБМА) экспериментальных группах в процессе заживления начальная фаза воспаления протекала без принципиальных отличий. В начальные сроки гистион окружающей ткани включал в себя воспалительные клетки: полиморфноядерные лейкоциты, нейтрофилы, мастоциты, макрофаги. Сосудистая реакция выражалась в дилятации кровеносных сосудов, наблюдался отек межпучковых пространств. Признаки острого воспаления были обусловлены механическими воздействиями, возникшими вследствие оперативного вмешательства.
Наиболее значимой являлась пролиферативная фаза воспаления, которая характеризовалась принципиальными отличиями в экспериментальных группах. В контрольной группе стадия острого воспаления трансформировалась в фазу пролиферации и образования грануляционной ткани, в которой наиболее выраженной являлась деятельность мезенхимных клеток и фибробластов. Присутствие лимфоцитов указывало на наличие иммунного компонента в ткани, вызванного недостаточной элиминацией раневого детрита, разрушенных клеток и межклеточного матрикса, обладающих антигенными свойствами (Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д., 2000). Выраженная фибробластическая реакция и дифференциация их в коллагенобласты II типа инициировала интенсивное коллагенообразование.
В опытной группе в перифокальной зоне при биодеградации и замещении балок ГБМА у реципиента наиболее выраженной являлась макрофагальная реакция, а фибробластическая деятельность была подавлена, коллагенобласты относились к I типу с умеренной коллагенсинтетической активностью. Губчатый трансплантат в силу высоких адсорбционных способностей пропитывался интерстициальной жидкостью - плазмой. Нити фибронектина прорастали в каналы и полости центростремительно, способствовали миграции, адгезии, ориентации клеток соединительной ткани и эндотелиоцитов из реактивных зон. Миогенезу предшествовал синтез соединительнотканного компонента. Происходило формирование соединительнотканно-мышечного регенерата, где доля собственной органотипической рыхлой волокнистой соединительной ткани со временем снижалась за счет замещения ее мышечной.
Известно, что камбиальными клетками скелетной мышечной ткани является фенотипически гетерогенная популяция миосателлитоцитов, которая включает истинные стволовые клетки, способные как к долгосрочной пролиферации, так и дифференцировке в миогенном направлении - MyoD+. (Zammit P.S., Relaix F., Nagata Y. et al., 2006). Но только MyoD+ клетки способны к терминальной 125 трансформации в зрелые миоциты, восполняя утраченную или поврежденную мышечную ткань (Shefer G., Van de Mark D.P., Richardson. J. B. et al ., 2006; Sacco A., Doyonnas R., Kraft P. et al., 2008; Kanisicak O., Mendez J.J., Yamamoto S., et al., 2009).
Макрофаги также способствуют успешному приживлению миогенных клеток предшественников в раннем периоде заживления скелетной мускулатуры (Lesault P.F., Theret M., Magnan M. et al. 2012; Segawa M., Fucada S., Yomamato Y., H. et al. 2008; Stefater J. A., Ren S., Lang R. A. et al., 2011; Sonnet et al., 2006; Lesault P-F, Theret M., Magnan M. et al. 2012).
Анализ морфометрических данных численности MyoD+ клеток в опытной и контрольной группах в период 3 – 7 суток от начала эксперимента показал, что количество клеток не отличалось друг от друга в силу активации миосателлитоцитов, возникшей вследствие резекции мышечных волокон. Фаза роста в опытной группе в период 7-14 суток указывала на пролиферацию миогенных клеток предшественников. По мере их трансформации в зрелые симпласты, миобласты утрачивали MyoD дифференцировку и в дальнейшем не выявлялись. Об этом свидетельствовало постепенное снижение численности MyoD+ клеток в период 14 – 90 суток. В контрольной группе дефект стремительно заполнялся стромальными элементами, вытесняя мышечный компонент, включая MyoD+ клетки, что подтверждает нисходящая кривая их численности на всем протяжении эксперимента. Ультраструктурные исследования позволили проследить последовательность трансформации клеток миобластического дифферона в регенерате после применения ГБМА. Процесс клеточной трансформации происходил от мононуклеарной клеточной формы до многоядерного мышечного волокна. Дифферон включал в себя стадии миосателлитоцита I и II типов, миобласта, миоцита и стадии зрелого симпласта. Восполнение пула мышечных клеток происходило за счет пролиферации миобластов, а синтез волокон за счет их инкорпораций между собой, с юными миоцитами. В результате чего наблюдалось образование симпластических многоядерных форм, что повторяло процесс регенерационного миогистогенеза (Данилов Р.К., 2008; Одинцова И.А., Чепурненко М.Н., Комарова А.С. с соавт., 2014). Новообразованные миосимпласты сопровождали коллагеновые волокна и свободно проникали в межволоконные пространства за-за их рыхлой текстуры. За счет удлинения и гипертрофии, мышечные волокна постепенно вытесняли новообразованную рыхлую соединительную ткань на периферию мышечного пучка. Так формировался эндомизий и перимизий. В данном случае, соединительная ткань выступает «в качестве источника индукционно-формативной тканевой регуляции», а мышечная ткань является регулируемой системой (Клишов А.А., 1984).
Немаловажным критерием полноценности регенерата в скелетной мышечной ткани является восстановление иннервации и степень васкуляризации (Данилов, 2008). Выявленные в регенерате - нервно-мышечные соединения в опытной группе являются свидетельством восстановлении нервной регуляции. После имплантации ГБМА показатели СППК резко возрастали, что указывало на интенсивный ангиогенез в соединительнотканном регенерате. Ишемия тканей в контрольной группе, развившаяся из-за редукции гемокапилляров также могла способствовать распаду мышечных волокон и их массовой гибели, что также могло провоцировать развитие фиброза (Данилов Р.К., 2008).
В патологической зоне в условия гипоксии и воспаления известна способность трансформации фибробластических клеток в адипоциты (Киселева Е. В., Чермных Э. С, Воротеляк Е. А. и др., 2009; Бозо И. Я., Деев Р. В., Пинаев Г. П., 2010), что и наблюдается в данном случае. Фибробласты по мере накопления липидных капель в цитоплазме трансформировались в адипоциты.