Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Доксорубициновая кардиомиопатия 12
1.1. Этиология и патогенез доксорубициновой кардиомиопатии 12
1.2. Энергетический метаболизм в здоровом миокарде и при патологии
1.3. Диагностика и современные методы лечения доксорубициновой кардиомиопатии
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования 50
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1. Макроморфологические и гематологические аспекты течения доксорубициновой кардиомиопатии и при корректировке их по сравнению с интактными животными
3.2. Биохимические параметры тканевого метаболизма доксорубициновой кардиомиопатии и при патогенетической коррекции в сравнении с интактными животными
3.3. Гистологическая характеристика миокарда в условиях эксперимента и у интактных животных
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов собственных исследований
Выводы 107
Список использованной литературы
- Энергетический метаболизм в здоровом миокарде и при патологии
- Диагностика и современные методы лечения доксорубициновой кардиомиопатии
- Биохимические параметры тканевого метаболизма доксорубициновой кардиомиопатии и при патогенетической коррекции в сравнении с интактными животными
- Гистологическая характеристика миокарда в условиях эксперимента и у интактных животных
Введение к работе
Актуальность проблемы. Кардиомиопатии являются болезнями миокарда, ассоциированными со структурными и функциональными изменениями сердечной ткани. До недавнего времени, в клинической практике патологии этой группы не различались, ввиду неясностей классификации, симптоматики и патогенетического процесса. В последние десятилетия был произведен существенный прорыв в понимании патофизиологии, генетических источников и молекулярных основ кардиомиопатий. Полученная информация позволила классифицировать их, разработать достаточно эффективное лечение при некоторых видах этого заболевания, а понимание молекулярных механизмов позволяет обосновать превентивные меры при данной патологии.
За последние два десятилетия химиотерапия у онкологических пациентов сделала большой шаг вперед, существенно увеличив выживаемость пациентов. Тем не менее, несмотря на все положительные аспекты, у современных химиотерапевтических препаратов встречается большое количество побочных эффектов, оказывающих влияние на сердечно-сосудистую систему. Развитие кардиотоксических эффектов, даже при бессимптомном течении, ведет не только к ухудшению прогноза, ассоциированного с сердечной недостаточностью, но и к ограничению терапевтических возможностей в борьбе как с онкологическим процессом, так и с сердечной дисфункцией. Клиническая манифестация данного патологического процесса ассоциирована со множеством нарушений – от незначительного изменения сердечного ритма до смертельно опасных аритмий и развития кардиомиопатии, тем самым ограничивая оптимальный подход к противоопухолевому лечению. Таким образом, сохранение нормальной функции сердца является важным аспектом в фармакотерапии онкологических пациентов. Рациональный подход при работе с данной группой больных должен включать оценку рисков развития кардиотоксичности, превентивные меры и наиболее ранние лечение обнаруженных отклонений.
Доксорубицин давно известен своим дозозависимым кардиотоксичным эффектом, который приводит к необратимой дилатационной кардиомиопатии у человека и собак, но он остается одним из самых широко применяемых препаратов [131, 211]. У людей и животных после лечения данным антрациклином происходит повреждение миокардиальных структур, но чаще всего этот процесс остается незаметным в течении длительного времени, а затем манифестирует быстрым развитием бивентрикулярной недостаточности и смертью [70, 89, 183, 211]. К сожалению, не инвазивные техники слабо отражают реальное состояние миокарда в латентный период при данной патологии, поэтому золотым стандартом ранней диагностики доксорубициновой
кардиомиопатии является эндомиокардиальная биопсия. В биоптатах обнаруживаются довольно характерная данному заболеванию картина: вакуолизация и лизис кардиомиоцитов, интерстициальный отек, диапедез и инфильтрация лейкоцитами [24, 189].
Механизм развитие доксорубициновой кардиомиопатии до конца не изучен и остается спорным, но наиболее вероятной причиной является образование свободных радикалов и развивающийся оксидативный стресс [211].
Нарушение метаболизма в сердечной мускулатуре приводит к дистрофии миокарда и, как следствие, к дилатации функциональных полостей сердца, нарушению сократительной функции, ослаблению скорости кровотока и сопутствующим этим процессам симптомам. Развитие кардиомиопатии сопровождается апоптозом кардиомиоцитов (КМЦ), снижением систолического выброса, активацией ренин-ангиотензиновой системы, вазоконстрикцией, что приводит к порочному кругу их взаимодействия.
Согласно современным данным отечественных и зарубежных
исследователей, тестостерон играет важную роль в метаболитических процессах миокарда и способствует снижению развития отягчающих патологий в течении болезни [128]. Таким образом анаболический эффект этого гормона можно использовать для восстановления некоторых поврежденных функций миокарда.
В настоящее время для лечения подобных патологий необходимы, помимо медикаментов, действующих непосредственно на сократительную функцию миокарда, энерготропные препараты.
С учетом особенностей регенерации КМЦ особую актуальность приобретает разработка оптимального способа консервативного лечения, способствующего активации естественных компенсаторных процессов в виде гипертрофии структурных единиц сердечной мышцы, нормализации трофики и метаболизма в них.
Степень разработанность темы. На сегодняшний день единого мнения в вопросе лечения доксорубициновой кардиомиопатии нет. Существует несколько препаратов, рекомендованных в качестве превентивных (дексразоксан, триметазидин, мельдоний), но их применение имеет незначительный эффект при уже развившейся патологии, а с учетом патогенеза данного заболевания эффективность профилактических мер не может быть достаточно оценена. Также представляет интерес изменение метаболических путей получения энергии для миокарда в условия доксорубициновой кардиотоксичности и при воздействии на пораженный миокард медикаментов. С гистологической стороны имеет значение оценка обеспеченности клеток энергетических субстратом и возможности реверсирования процессов соединительнотканного перерождения сердечной мышцы.
Цель и задачи исследования.
Цель нашего исследования представляет собой раскрытие патогенетических аспектов энергетического метаболизма при экспериментальной доксорубициновой кардиомиопатии, а также теоретическое обоснование и предложение методов диагностики и коррекции выявляемых нарушений при данной патологии. Задачи:
Изучить механизмы развития доксорубициновой кардиомиопатии на экспериментальной модели у белых крыс линии Вистар.
Изучить основные компоненты энергетического метаболизма миокарда в условиях физиологической нормы и в условиях индуцированной доксорубициновой кардиомиопатии
Выявить структурные изменения миокарда у здоровых и животных с индуцированной доксорубициновой кардиомиопатией.
Разработать экспериментальную коррекционную схему и изучить ее эффективность коррекционной схемы на миокардиальный метаболизм при доксорубициновой кардиомиопатии
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Комплекс морфологических и метаболических изменений, характеризующий доксорубициновую кардиомиопатию.
-
Разработанная терапевтическая схема, корректирующая побочные эффекты доксорубицина.
-
Патогенетический эффект тестостерона на морфологические и метаболические параметры миокарда при доксорубициновой кардиомиопатии.
-
Оценка эффектов коррекционной схемы на миокард при доксорубициновой кардиомиопатии и их отличие от монотерапии тестостероном.
-
Теоретическая основа применения коррекционной схемы у животных с доксорубициновой кардиомиопатией
Научная новизна
В ходе нашей работы получены данные о компонентах тканевого метаболизма у здоровых крыс и при доксорубициновой кардиомиопатии, а также проведено гистологическое исследование образцов миокарда крыс в условиях эксперимента. Определены патогенетические механизмы влияния тестостерона и коррекционной схемы на тканевой метаболизм в поврежденном миокарде. Выявлены некоторые особенности ремоделирования миокардиальной ткани в условиях корректируемой предложенными препаратами доксорубициновой кардиомиопатии. Разработана схема применения компонентов коррекционной схемы для экспериментальных животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Данная работа выявляет один из путей терапевтического подхода при доксорубициновой кардиомиопатии. Полученная в экспериментальном исследовании информация позволяет предположить о положительной экстраполяции экспериментальных методов терапии изучаемого заболевания у животных другого вида. Выявленные данные о аспектах тканевого метаболизма у здоровых животных и его изменение при доксорубициновой кардиомиопатии будут полезны для разработки медикаментозной корректировки данной патологии.
Методология и методы исследований. Для исследования проявления доксорубициновой кардиомиопатии у крыс линии Wistar использовали комплекс морфологических, гистологических, гистохимических, биохимических методов. Проводилась сравнительная оценка живой массы на момент начала эксперимента и по его завершению. Посмертно производился отбор материала для гистологического и биохимического исследования миокарда, а также определение массы сердца и сердечного индекса. Гистологические и гистохимические методы включали окрашивание гематоксилин-эозином, железным гематоксилином и докрашивании пикрофуксином, выявление соединительнотканных структур по Маллори и Ван Гизону, нейтральных гликопротеидов ШИК-реакцией по Мак-Манусу. Полученные данные анализировались статическими методами, представленными в пакете программ STATISTICA 7.0.
Степень достоверности и внедрение результатов работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на внутренних и международных конференциях (Международный ветеринарный конгресс VetIstanbul 2015, СПб; Актуальные направления научных исследований XXI века 2014, Воронеж; Современные проблемы и пути их решения в науке, производстве и образовании 2014, Темрюк; Инновационные разработки молодых ученых – развитию агропромышленного комплекса» 2014, Ставрополь; Международная научная конференция профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ 2016, 2017; Proceedings of the 9th European Conference on Biology and Medical Sciences, 2016).
Материалы диссертации используются в научно-исследовательской работе и учебном процессе при проведении лабораторных практикумов и чтении лекций в курсе дисциплины «Внутренние незаразные болезни» следующих вузах: СПбГАВМ, ФГБОУ ВО Вятская ГСХА, ФГБОУ ВО «Белгородский государственный аграрный университет им. В.Я. Горина», Ульяновская ГСХА, ФГБОУ ВО Южно-Уральский ГАУ, ФГБОУ ВО «Бурятская ГСХА им. В.Р. Филиппова».
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.
Личный вклад. Диссертация является результатом исследования автора в период с 2014-2017гг. Автором самостоятельно поставлена цель и определены задачи исследования, план проводимых исследований по изучению и контролю рассматриваемой патологии, а также анализ и обобщение полученных результатов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 136 страницах компьютерного текста. Состоит из обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 242 источника. Диссертация содержит 8 таблиц и 31 микрофотографию.
Энергетический метаболизм в здоровом миокарде и при патологии
Современные разработки в лечении опухолевых заболеваний позволяют существенно повысить процент выживаемости онкологических пациентов и, иногда, контролировать агрессивность патологического процесса. Наряду с этим применение химиотерапевических препаратов существенно отражается на состоянии сердечно-сосудистой системы.
Чаще всего кардиотоксичность отмечается у антрациклиновых антибиотиков. Эти препараты предупреждают деление клеток вследствие нарушения структуры ДНК и выключения ее функций. В качестве противоопухолевых агентов в ветеринарной онкологии чаще всего используется один из представителей антрациклинов — доксорубицин (адриамицин), а также схемы с комбинированием доксорубицина, циклофосфамида и/или винкристина [140]. Данный препарат обладает достаточной эффективностью и одновременно по своим побочным проявлениям гораздо слабее, чем предшествующие поколения из той же группы антрациклинов [53].
Кардиотоксичность доксорубицина может развиваться остро, в течении 2-3-х дней после введения. Встречаемость такого течения относительно высока – до 11% [205, 211, 226]. Механизм острого воздействия не совсем ясен. Полагают, что он, скорее всего, связан с обратимым отеком миокарда [24, 189]. Хроническое воздействие доксорубицина встречается гораздо реже – в 2% случаев [229]. Обычно оно проявляется через 30 дней после введения препарата, но может обнаружиться и спустя несколько лет. Так как лечение опухолевых заболеваний требует неоднократного введения препарата, то достижение кумулятивной кардиотоксической дозы в 160 мг/м2 нередко, к тому же, если у пациента, проходящего курс химиотерапии были заболевания миокарда, протекающие в латентной форме, то критической может быть доза и в 100 мг/м2 [131].
Токсические эффекты доксорубицина на миокард можно объяснить несколькими общепринятыми теориями: оксидативный стресс; эффекты симпато-адреналовой системы и цитокинов; изменение структур или полное разрушение митохондриального аппарата клетки; повреждение молекулы ДНК; изменения, связанные с транспортом ионов Са+2 в кардиомиоцитах (КМЦ); апоптоз [8, 9, 12, 28].
Среди метаболических процессов превалирует активация перекисного окисления жиров. Под действием доксорубицина увеличивается содержание альдегидов, снижение активности антиоксидантных механизмов (супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы), которое прямо пропорционально кумулятивной дозе препарата. Пусковым механизмом данной реакции является связывание метаболитов антрациклина с железом, и появление 13-дигидрометаболитов, вытесняющих ионы Fe+2 из неферритиновых связей. Специфичность этого явления в миокарде, предположительно, обусловлена большим количеством миоглобина [79, 101, 157, 159, 211]. Образующиеся свободные радикалы вызывают повреждения липидов цитоплазматической мембраны КМЦ, увеличивая тем самым её проницаемость. При этом нарушается естественная регулировка работы мембранных белков-транспортеров, что приводит к усиленному движению ионов Ca+2 и последующим отрицательным эффектам на возбудимость и сократимость клетки. Как показывают опыты, эффект антрациклина на мембранно-транспортный аппарат КМЦ связан не только с дозой препарата, но и с продолжительностью его циркуляции в организме [54, 140, 157, 183].
Помимо действия на транспортные механизмы, доксорубицин (через ионы Са+2) влияет и на сократимость кардиомиоцитов. Из-за повышения концентрации Ca+2 ослабляется чувствительность к нему тропонина, что приводит к снижению силы сокращения. В одном из экспериментов, в котором сердце перфузировали раствором с высоким содержанием Са+2, вплоть до его остановки, было показано, что сердцам тех животных, которые получили предварительно виоламицин в дозе 2 мг/кг (антрациклиновый антибиотик), требовалась меньшая концентрация Са+2, чем здоровым (8 и 19 моль, соответственно) [16, 146].
Особый эффект антрациклин оказывает на митохондрии. Например, андриамицин имеет высокую тропность к кардиолипину (структурному липиду митохондриальной мембраны). К тому же, митохондрии КМЦ легко отдают свободные электроны антрациклину и обратно, что приводит к резкому увеличению концентрации активного (синглетного) кислорода. К патогенетическим особенностям митохондрий КМЦ можно отнести наличие особенной НАДФ-дегидрогеназы, взаимодействие которой с молекулой антрациклинового антибиотика ведет к ее дестабилизации и формированию свободных кислородных радикалов [70, 79]. Влияние антрациклиновых антибиотиков на ДНК заключается в нарушении репаративно-регенераторных процессов в структурах нуклеиновых кислот и, в частности, в способности интеркалировать в молекулу ДНК. Последующее образование свободных радикалов ведет к нарушению компартментной системы, поражению наружных и внутренних клеточных мембран, что, в свою очередь, изменяет сигнальные механизмы и пути, активируя защитный механизм апоптоза [9].
Гистологический уровень включает в себя изменения структурной характеристики ткани, изменение соотношения стромальных и паренхиматозных компонентов, организации соединительнотканного остова, хода мышечных клеток, размеров КМЦ, их цитоплазматической и ядерной структуры, соотношения цитозоля и ядра. На ультрамикроскопическом уровне определяется малое количество миофибрилл из-за лизиса миофиламентов, нехарактерные растяжения и сокращения саркомеров, набухание митохондрий, вакуолизация цитоплазмы, образование грубых глыбок хроматина и их пограничное расположение, увеличение перинуклеарного пространства. При усугублении – развиваются литические процессы, ведущие к разрушению внутренних структур клетки, ее апоптозу и далее – к фиброзу [5, 24, 31, 62, 225].
Диагностика и современные методы лечения доксорубициновой кардиомиопатии
В КМЦ присутствую 3 внутренних функциональных механизма, включенных в производство энергии и электромеханическую работу (митохондрии, саркоплазматический ретикулум, миофибриллы). Все три эти системы тесно связаны с работой КК. Кардиомиопатия приводит к изменению функций данных субклеточных структур, что проявляется в снижении активности миотохондриальной КК; ослаблении оксидативной способности миокардиальных волокон и отсутствии регуляторного воздействия на дыхательную функцию митохондрий акцепторов фосфата (креатин, АДФ, АМФ); снижении способности КК стимулировать потребление Са+2 саркоплазматическим ретикулумом; резком падении сократительной способности миофибрилл. Таким образом, локальное изменение движения энергии нарушает баланс доставки и утилизации энергетических субстратов, что приводит к ослаблению электромеханической работы миоцита. Повреждение саркоплазматического ретикулума ведет к снижению потребления им Са+2, это свидетельствует о том, что связанная с данной структурой КК не может выполнять энергетическую поддержку для Са+2 – АТФ-азы. Что в свою очередь приводит к усугублению сердечной недостаточности из-за снижения контрактильной функции миоцитов [48].
При снижении способности миокарда образовывать АТФ изменяется предпочтительный источник энергии. В начальных стадиях сердечной недостаточности основным энергетическим источником остаются свободные жирные кислоты. В дальнейшем работа пораженного сердца стимулируется симпатоадреналовой системой, вторично вызывая выход СЖК в кровяное русло, но использование их как источника для синтеза АТФ не происходит. Миокард переключается на глюкозу, лактат, пируват [165]. До некоторого времени рост СЖК в крови рассматривался как попытка организма восполнить недостаток миокарда в энергетическом субстрате, но, благодаря современной технологии позитронно-эмиссионной томографии, было обнаружено, что радиоактивно меченные СЖК циркулировали в общем кровотоке, но не утилизировались в КМЦ, в то время как меченная глюкоза активно поглощалась и разлагалась в миокарде с образованием радиоактивного СО2 [46, 233, 238].
Эксперименты на собаках также указывают на использование на начальных стадиях естественного энергетического субстрата (СЖК) для миокарда, а при ухудшении – резкий переход на углеводы. Особенно ярко видна превалирующая роль углеводов в питании КМЦ на стадиях декомпенсации сердечной недостаточности [116, 155, 162]. Интересным фактом остается тот момент, что при переключении на глюкозу, как источник энергии, резко ингибируется синтез NO, но механизм взаимосвязи окончательно не установлен (возможно, это связано с повреждениями молекулярных ферментных систем, NO-синтазы в том числе) [194]. Недостаток оксида азота ведет к возрастанию потребности митохондрий в кислороде и приводит к нарушению коронарной микроциркуляции [50, 173, 174, 206, 215].
В условиях лимитированного доступа кислорода в клетку нарастает содержание НАДН. На начальных этапах этот избыток НАДН ингибирует ГАФДГ и, зависящий от него, анаэробный гликолиз. В зависимости от тяжести ишемии накопленный лактат может быть транспортирован из КМЦ с помощью МКТ, но при ухудшении состояния миокарда возможности эффективно выводить его нет. Задержка молочной кислоты вызывает усиление ингибирования ГАФДГ и гликолиз не может продолжаться [25, 177]. Neely & Grotyohann было установлено, что накопление лактата, протонов, НАДН ведет к необратимому повреждению миокарда [150]. В работе Cross et al. предполагается, что накопление лактата, увеличение отношения лактат/пируват и, соответственно, отношения НАДН/НАД, играет ведущую роль в нарушении миокардиальной функции [44]. Таким образом, усиление анаэробного гликолиза может выполнять кардиопротективную функцию, так как продуцирует АТФ и способствует поддержанию ионного баланса внутри КМЦ [45].
При ишемии, окислительные процессы в миокарде тормозятся. Большая часть оставшейся окислительной активности остается за бета-окислением жиров. Но этот процесс оказывает ингибирующее влияние на ПДГ (через усиление выработки НАДН), что тормозит гликолиз [55, 63, 230].
При тяжелых поражениях метаболических процессов в миокарде, полученный из жирных кислот или пирувата ацетил-КоА не может включится в цикл трикарбоновых кислот, поэтому данная молекула соединяется с подобной себе и образует ацетоацетат. Он, в свою очередь, превращается в гидроксибутират, повышая соотношение НАД/НАДН [192, 194].
Изменение работы МКТ 1 при ишемии миокарда. При экспериментальной ишемии сердца у крыс было обнаружено усиление способности транспортировать лактат в КМЦ, ввиду увеличения МКТ 1 протеинов в цитоплазматической мембране клеток. В этом же эксперименте было обнаружено увеличение количества строительных молекул МКТ 1 в комплексе Гольджи, что свидетельствует о большой роли монокарбоксилатных переносчиков при переходе на другой субстрат для образования макроэргов [23, 87].
Биохимические параметры тканевого метаболизма доксорубициновой кардиомиопатии и при патогенетической коррекции в сравнении с интактными животными
Кардиотоксичность доксорубицина значительно меняет миокардиальный метаболизм, приводя к энергетическому голоданию сердечной мышцы, поэтому необходимо охарактеризовать нормальный метаболизм в сердце у интактных крыс, а затем сравнить его с таковым у экспериментальных животных. Как уже было сказано, в миокарде основным энергетическим субстратом являются свободные жирные кислоты и, в гораздо меньшей степени, глюкоза, кетоновые тела. Так же известно, что в сердечной мышце содержится малое количество макроэргических соединений (АТФ и креатинфосфата). Это обуславливает особую уязвимость миокарда к действию доксорубицина, так как он имеет активное влияние на окисление липидов (приводит к накоплению промежуточных метаболитов перекисного окисления жиров), митохондриальный аппарат (ведет к разрушению их мембран и структурной дегенерации). Таким образом нивелируется весь оксидативный потенциал, заложенный в сердечной мышце. К тому же, взаимодействие доксорубицина с ионами кальция ведет к ослаблению сократительной способности, снижению доступности энергетических субстратов для АТФ-аз сократительного аппарата и ионных насосов [52, 126, 160, 184, 208, 222].
Специфика миокардиального метаболизма и характер его компенсаторных изменений при повреждении КМЦ, позволили нам выявить показатели для оценки углеводного обмена кардиомиоцитах (лактат, пируват, лактатдегидрогеназа, креатинкиназа), и энергообразования (макроэргические фосфаты и соотношение НАД+/НАДН в цитозоле) [82]. Известно, что тканевые показатели лактата, пирувата и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) характеризуют гликолитические процессы и сопряженность их с дальнейшим окислением в различных энергетических циклах миокарда, а также используемые в этом субстраты. Соотношение НАД+/НАДН отражает редокс-потенциал клеточного аппарата. Макроэргические соединения характеризуют эффективность клеточного метаболизма и способность совершать миофибриллами работу. Особое внимание уделяется общей креатинкиназе – ферментной системе, отвечающей за накопление энергии и повреждаемой действием антрациклина.
В ходе исследования нами были изучены особенности метаболизма в миокарде интакных крыс. Эти данные указаны в табл.3.2.1 и в последствии рассматривались как физиологическая норма.
Сравнительный анализ метаболических показателей миокарда крыс в условиях эксперимента Группа Общая КК, ЕД/мг ткани Лактат,мкмоль/гткани Пируват,мкмоль/гткани ЛДГ, МЕ/г ткани Макроэргическиефосфаты,мкмоль/г ткани Отношение НАД/НАДН Интактные (n=8) 8,67±0,53 22,32±4,08 0,27±0,06 445,5±14,8 4,77±0,77 131,7±31Д КД (n=6) 2,56±0,63 9,46±0,9б" 0,6±0Д8 269,96±55,5 2,56±0,63 609,2±182,3 ДТ (n=8) 9,26±0,48+ 10,03±1,94 0,9±0,23 368,21±46,83 5,39±1,48 + 1688Д8±756 + ДТЭ(п=7) 16,5±1,76 + 15,03±1,67" 1,45±+0Д7 + 412ДЗ±37,96 7,28±1,38+ 905,8±100,02 Примечания: - p0,01 по сравнению с интактной группой - p0,05 по сравнению с интактной группой + - p0,01 по сравнению с контрольной группой ++ - p0,05 по сравнению с контрольной группой В образцах тканей здоровых животных было выявлено, что уровень средней активности общей креатинкиназы совпадает с данными в литературе и характеризует активность образования креатинфосфата [149]. Соответственно, выявленный уровень суммарных макроэргических фосфатов рассматривается как необходимый для нормальной функции миокарда. Исходя из активности ЛДГ, которая так же сопоставима с данными в литературе, можно определить превалирующий путь реакций, катализируемый данным ферментом [4]. Как видно из данных, представленных в табл.3.2.1, у интактных животных отмечается умеренно-активный гликолиз с образованием молочной кислоты и слабым накоплением пировиноградной. Эти показатели использовались как исходная точка для определения предпочтительного субстрата энергетического обмена. Соотношение НАД+/НАДН существенно варьирует в различных тканях и зависит, согласно Williamson et al., от активности ЛДГ и концентраций лактата, пирувата в цитозоле клетки [231]. Выведенное среднее значение характеризовало акцент метаболизма на использовании НАД для работы с пируватом и свободными жирными кислотами, что приводило к накоплению НАДН и снижению данного соотношения.
Далее мы проанализировали влияния антрациклина на миокардиальный метаболизм в условиях экспериментальной хронической доксорубициновой кардиомиопатии (табл.3.2.1).
В группе КД было выявлено резкое снижение активности ферментных систем кардиомиоцитов: общей креатинкиназы (2,56±0,63 ЕД/г ткани, p0,01) и лактатдегидрогеназы (269,96±55,5 МЕ/г ткани, p0,01) по отношению к интактной группе. Это в свою очередь привело к снижению среднего количества доступных макроэргических соединений – АТФ и креатинфосфата. Полученные данные можно интерпретировать как энергетическое голодание, которое характеризуется снижением эффективности контрактильной функции и, соответственно, гемодинамической дисфункцией. Снижение концентрации лактата (9,46±0,96 мкмоль/г ткани, p0,05) и увеличение средней концентрации пирувата, ассоциированное с низким содержанием макроэргических фосфатов, свидетельствует о снижении активности гликолиза и ослаблении утилизации пирувата в энергетическом обмене при блокировании ПДГ. Изменение среднего соотношения НАД+/НАДН, сопряженное со снижением активности НАД-зависимых ферментных систем, свидетельствует о торможении синтеза макроэргических соединений. Ввиду слабой работы механизмов образования макроэргических соединений, активность использования окисленной формы НАД и ее последующее восстановление была существенно снижена. Наиболее вероятной причиной повышения свободной формы НАД+ является повреждение митохондриального аппарата в следствии оксидативного стресса [93]. Затем мы охарактеризовали миокардиальный метаболизм в условиях применения коррекционных схем, включавших тестостерон и его комбинацию с экспериментальной вытяжкой.
В группе ДТ было обнаружено повышение активности общей креатинкиназы по сравнению с группой КД (p0,01) и достижением среднего уровня, сопоставимого с таковым показателем у интактных крыс. Лактатдегидрогеназа у крыс ДТ достигла значений, характеризовавших состояние данной системы у интактной группы, и, в тоже время, в среднем превышающих показатели группы КД (табл.3.2.1).
Как видно из таблицы, повышение средней активности общей креатинкиназы и лактатдегидрогеназы сопровождается увеличением среднего уровня макроэргических соединений в миокарде по сравнению с группой контроля и приближению этих значений к показателям интактных животных.
Если в случае ДК низкий уровень лактата определялся слабым проявлением энергетического метаболизма и был связан с низкой активность ЛДГ, то в группе ДТ это связано с незначительной конвертацией пирувата из-за высокого соотношения НАД/НАДН. Исходя из литературных данных, применение высоких доз андрогенов ведет к усилению выработки АМФ-активируемой протеинкиназы, которая является ответственной за активность многих ферментных систем клеточных компартментов, в том числе и митохондрий [75].
Гистологическая характеристика миокарда в условиях эксперимента и у интактных животных
Объяснить метаболизм в сердечной мышце животных, получавших тестостерон и его комбинацию с миокардиальным экстрактом несколько сложнее. В данном случае также присутствует блокировка оксидативного гликолиза, но рост концентрации пирувата и лактата свидетельствует о стимуляции гликолиза. Однако, рост соотношения НАД\НАДН предполагает усиленный ток восстановленных эквивалентов в митохондрию и, возможно, усиление активности дыхательной цепи переноса электронов. Также в группе ДТЭ активируется малат-аспартатный челночный механизм и восстанавливается мембранный потенциал митохондрий, что обуславливает высокий уровень макроэргов. Снижение соотношения НАД\НАДН в данной группе, по сравнению с ДТ-крысами, обусловлено активацией гликолиза (диаграмма «Изменение уровня ЛДГ и отношения НАД\НАДН»). Изменение уровеня ЛДГ и отношения НАД\НАДН 1600140012001000800600400200 Интактные КД ДТ ДТЭЛДГ, Ед\г НАД\НАДН Активность креатинкиназы в большей степени отражает состояние энергетического статуса миокарда животных (диаграмма «Изменения уровня макроэргических фосфатов и активности креатинкиназы»). Уровень лактатдегидрогеназы косвенно отображает активность энергообмена в клетках и, скорее всего, следует за общим состоянием энергетического метаболизма КМЦ.
Данная трактовка результатов положительно согласуется с общим взглядом на миокардиальный метаболизм в мировой литературе [199].
Завершающим этапом эксперимента явилась гистологическая и гистохимическая оценка состояния КМЦ. В группе интактных животных при окраске гематоксилин-эозином было выявлено характерное для миокардиоцитов строение: центрально расположенное ядро, исчерченность цитоплазмы. В образцах, окрашенных по Маллори и Ван Гизону, обнаруживалось незначительное количество коллагеновых волокон, расположенных преимущественно с сосудами микроциркуляторного русла. КМЦ, окрашенные железным гематоксилином и его комбинацией с пикрофуксином, имели большое количество миофиламентов и незначительные участки неспецифической цитоплазмы в перинуклеарном пространстве. ШИК-реакцией были выявлены единичные гранулы гликогена в цитоплазме клеток и ярко окрашенные нейтральные полисахариды интерстициальных компонентов ткани.
В группе доксорубицин-контроль было обнаружено, что миокардиальная ткань частично утратила свой специфический рисунок: у некоторых кардиомиоцитов частично отсутствовала исчерченность, они были истончены (диаметр КМЦ практически соответствовал диаметру ядра), пространство между миокардиальными волокнами было увеличено, что характеризует потерю межклеточного контакта и отек, свойственного для доксорубициновой кардиомиопатии. Сосуды микроциркуляторного русла были растянуты и заполнены эритроцитами. При окраске по Маллори и Ван Гизону обнаруживались многочисленные коллагеновые волокна, беспорядочно расположенные в интерстициальном пространстве. Кардиомиоциты, окрашенные железным гематоксилином и при докрашивании пикрофуксином, имели малое количество миофиламентов в цитозоле и крупные участки, заполненные неспецифической цитоплазмой. В литературных источниках приводятся подобные сведения, характеризующие данное состояние при ультрамикроскопии (рис. 4.1)[92].При окрашивании ШИФ реактивом гранул гликогена в цитоплазме КМЦ не было выявлено, но в одном из образцов обнаружена миграция лейкоцитов из сосудистого русла в ткани и ярко выраженная соединительнотканная пролиферация.
В группе ДТ мы обнаружили, что диаметр кардиомиоцитов увеличился и приближался к таковому у интактной группы. Но в интерстициальном компоненте присутствовало большое количество коллагеновых волокон, ассоциированных с микроциркуляторным руслом. Встречаемость гранул гликогена в цитоплазме была практически равна образцам интактной группы. В группе ДТЭ морфология КМЦ практически не отличалась от тканей интактных животных. Количество коллагеновых волокон было существенно ниже, чем в группе ДТ и КД. При окраске комбинацией железного гематоксилина и пикрофуксина было обнаружено нормальное содержание миофибрилл и незначительное количество неспецифической цитоплазмы, расположенной в перинуклеарном пространстве. ШИК-реакцией было выявлено большое количество гранул гликогена в цитоплазме КМЦ, нейтральные полисахариды интерстициальной ткани локализовались преимущественно в перивазальном пространстве.
При анализе изменения диаметра кардиомиоцитов в условиях эксперимента было выявлено, что коррекционная схема имела положительный эффект. Эксперименты, в которых описывается модель доксорубициновой кардиомиопатии, так же выявляли изменение диаметра кардиомиоцитов. В работе Непомнящих Л.М., диаметр КМЦ в контрольной группе (здоровые животные) составлял 14,99±20 мкм [13], в нашем эксперименте - 14,31±0,45 мкм, что свидетельствует о сопоставимости полученных результатов. В условиях острого воздействия доксорубицина (3 дня) диаметр изменялся незначительно, достигая величины в 12,24±0,70 мкм. В нашем эксперименте, ввиду хронического токсического воздействия, изменение в морфологии КМЦ более существенны - 5,83±0,44 мкм. Однако, применение предложенной коррекционной схемы позволило миоцитам компенсировать данную потерю и практически достигнуть нормальных значений: 10,97±0,61 мкм для ДТ крыс и 13,53±0,44 мкм для группы ДТЭ.