Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Искусственное осеменение и экстракорпоральное оплодотворение: перспективы развития
1.2. Современные подходы к изучению морфо-функциональных показателей спермы
1.3. Принципы подготовки и сохранения спермы для проведения экстракорпорального оплодотворения овец
1.4. Существующие методы подготовки и очистки спермы 30
1.5. Экономическая эффективность использования технологии экстракорпорального оплодотворения овец для сельскохозяйственных организаций Ставропольского края
2. Собственные исследования 37
2.1. Материалы и методы исследований 37
2.2. Результаты исследования 51
2.2.1. Изучение клинического статуса, микробиологических показателей и анализ спермограммы баранов-производителей
2.2.2. Изучение влияния среды SOF wash на жизнеспособность и 66
морфологические показатели свежеполученной спермы баранов
2.2.3. Разработка методики подготовки эякулята, обеспечивающую капацитацию спермиев для ЭКО
2.2.4. Оценка оплодотворяющей способности спермиев баранов-производителей подготовленной по разным методикам
Заключение 90
Выводы 93
Практические предложения 95
Список литературы
- Принципы подготовки и сохранения спермы для проведения экстракорпорального оплодотворения овец
- Экономическая эффективность использования технологии экстракорпорального оплодотворения овец для сельскохозяйственных организаций Ставропольского края
- Изучение клинического статуса, микробиологических показателей и анализ спермограммы баранов-производителей
- Оценка оплодотворяющей способности спермиев баранов-производителей подготовленной по разным методикам
Принципы подготовки и сохранения спермы для проведения экстракорпорального оплодотворения овец
Размножение домашних животных находится под контролем человека и осуществляется по технологиям, которые специально разработаны для облегчения работы [33, 120]. Современные репродуктивные технологии диктуют стратегические направления селекционной работы, которые обуславливают выбор животных по генетическим признакам отвечающих за высококачественную продукцию [36]. Решающее значение в этом вопросе было отведено искусственному осеменению, предусматривающим дополнительные возможности, позволяющие улучшать генетический отбор [91, 94, 120, 139, 162]. Современные методы биотехнологии открывают возможности практически для всех отраслей сельского хозяйства. Особо важным, для развития науки и наращивания темпов производства, являются исследования в области разведения, селекции и воспроизведении мелкого рогатого скота. Темпы селекции, благодаря внедрению в производство методов искусственного осеменения и криоконсервации спермы, были увеличены в 2-3 раза [10]. Искусственное осеменение - это сложная операция, которую могут выполнить лишь высококвалифицированные специалисты, хорошо знающие анатомо-топографические и физиологические особенности органов размножения овец. Станции по искусственному осеменению должны иметь необходимое оборудование и инструменты и соблюдающие ветеринарно-санитарные требования.
Сущность и значение искусственного осеменения животных - метод искусственного осеменения сельскохозяйственных животных заключается в том, что при помощи специальных инструментов, полученные и технологически обработанные половые продукты (сперму) самца или готовые эмбрионы вводят в половые органы самок [26]. Основное преимущество искусственного осеменения перед естественным спариванием животным заключается в том, что от одного производителя удается получить во много раз больше потомства, в результате значительно сокращается потребность в племенных производителях, кроме того есть возможность широкого использования генетического материала, в целях качественного улучшения продуктивных качеств животных в различных хозяйствах. Важное значение, искусственное осеменение имеет как ветеринарное мероприятие, предупреждающее распространение острых заразных болезней (вибриоз, трихомоноз) передающихся при естественном половом акте [9].
На уровне хозяйства воспроизводство стада является сложным технологическим процессом, направленным не только на получение приплода с высоким генетическим потенциалом, но и на обеспечение его сохранности и, в конечном счте, создание животных с определнными заданными качествами [27, 57].
Учитывая ключевую роль размножения, как ведущего звена эффективности производства и генетической селекции, улучшение репродуктивных технологий, будет иметь ключевое значение для решения проблем, связанных с предполагаемым ростом населения в мире (с семи миллиардов человек в 2011 году до ожидаемых девяти миллиардов к 2050 году) [199]; и трудностями в животноводстве, вызванными изменением климата [157].
В 90-е годы XX века благодаря внедрению в биотехнологическую, медицинскую и ветеринарную практику культивирования гамет и эмбрионов, обусловленного возрастающими потребностями современного общества интерес к репродуктивной биологии значительно вырос. Если в медицинской практике вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ)- это способ лечения бесплодия, то в сельском хозяйстве это метод улучшения генетического благополучия стада и эффективный метод увеличения численности поголовья. Впервые использование ВРТ относит к 1783 г., когда Spallazani получил щенков от искусственно оплодотворенной собаки, но этот метод был не востребован до 1900 годов, когда отечественный ученый Иванов разработал метод искусственного осеменения сельскохозяйственных животных. Эта разработка стала огромным прорывом в развитии сельского хозяйства в стране и в мире, став началом эпохи интенсивного развития репродуктивных технологий [26]. Важным этапом в развитии искусственной инсеменации стала разработка команды ученых из Кембриджа (Англия), возглавляемая Chis Polge в 40-х годах XX столетия, впервые им удалось создать методику замораживания и хранения сперматозоидов животных. В этот же период времени были также разработаны методы выделения и манипуляции с женскими гаметами. Первые шаги на пути к экстракорпоральному оплодотворению млекопитающих были сделаны более 50 лет назад и описаны Pincus, наблюдавший за спонтанным возобновлением мейоза первичного ооцита кролика, вышедшего из фолликула и помещенного в подходящую культурную среду, а в 1968 г. Joe Sreenan впервые в мире описал ядерное дозревание ооцитов in vitro у коров с бойни (Ирландия). Важное значение, в получении зиготы, является подготовка половых клеток, которая сопровождается их очисткой от посторонних примесей, созреванием, культивированием и хранением в пробирке. Существует множество способов подготовки спермы для экстракорпорального оплодотворения, но каждый из них обладает своими преимуществами и недостатками [57].
Широкое использование искусственного осеменения у крупного рогатого скота позволило провести точную генетическую оценку и способствовало распространению высоких генетических качеств среди поголовья, предпосылками к этому было использование сложных процедур анализа данных для оценки генетической ценности. Так, например, в Европейских странах, наличие эффективной овцеводческой службы, дало аналогичные преимущества и значительно повысило возможности отрасли для племенных и коммерческих заводчиков, в способности реагирования на изменения требований рынка [70, 124].
Экономическая эффективность использования технологии экстракорпорального оплодотворения овец для сельскохозяйственных организаций Ставропольского края
Дальнейшие исследования предусматривали подготовку и созревание спермиев in vitro в специализированных синтетических средах, которые готовили по стандартным рецептам и в условиях, указанных производителями.
Приготовление растворов для среды SOF wash (Synthetic Oviduct Fluide) осуществляли методом последовательного приготовления точных навесок химических компонентов, взвешивание которых проводили на аналитических весах. Смешивание компонентов проводили при обычных условиях ручным перемешиванием. Среды готовили в день разбавления спермы. Компоненты, входящие в состав сред, отвешивали на аналитических весах. 1. EDTA (0,1 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 3 мг EDTA (ООО "ОРИДЖИО") растворяли в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 1 недели. 2. Таурин (0,1 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 1,25 мг таурина (ООО "ОРИДЖИО") растворили в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 3. Цитрат (2,8 % в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 2800 мг натрия цитрата (ООО "ОРИДЖИО") растворяли в 10 мл в деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 4. Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 629 мг NaCl, 53,4 мг KCl, 16,2 мг KH2PO4, 5 мг гентамицина растворяли в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 5. NaHCO3 Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 210 мг NaHCO3 (ООО "ОРИДЖИО") растворяли в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 6. CaCl2 (1,71 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для исследований использовали готовый раствор с концентрацией 25 мг CaCl2x2H2O (ООО "ОРИДЖИО"). Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 7. Лактатный основной раствор (3,3 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). 0,1175 мл (61,6 мг) 60% раствор лактата натрия (ООО "ОРИДЖИО") растворяли в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 8. Глюкоза (5 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 90 мг глюкозы (ООО "ОРИДЖИО") растворяли в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 3 месяцев. 9. Пируват основной раствор (5 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 5,5 мг пирувата натрия растворить в 10 мл деионизированой воды. Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 1 недели 10. Глютамин (1,0 mM/l в 1x после растворения). Основной раствор (10x). Для приготовления рабочего раствора 0,5 мл L-глютамина (ООО "Сигма-Алдрич Рус") (200 mM/l или 29,23 мг/мл раствора) растворяли в 9,5 мл деионизированой воды (результат 10 mM/l). Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 1 недели. 11. Стоковый раствор глютамина (10х). Для приготовления рабочего раствора 2,92 мг сухого глютамина (ООО "Сигма-Алдрич Рус") растворяли в 2,0 мл деионизированой воды (результат 10 mM/l). Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 1 недели. 12. Стоковый раствор аланил-глютамина. Для приготовления рабочего раствора 4,3 мг сухого аланин-глютамата (ООО "Сигма-Алдрич Рус") растворяли в 2,0 мл деионизированой воды (результат 10 mM/l). Готовую среду фильтровали и хранили при 4C в течении 1 недели. 13. Глюкозо-цитратно – желточный разбавитель (ГЦЖ), готовили по ГОСТ 14746 – 69 (глюкоза медицинская безводная – 30,0 г, натрий лимоннокислый трехзамещенный, пятиводный – 14,0 г, желток куриного яйца – 200,0 мл, спермосан 3 – 750 - 900 тыс. ед., вода дистиллированная – 1000,0 мл). Изучение морфофункциональных свойств спермы после внесения ее в готовые растворители проводили по ГОСТ 32277-2013 «Средства воспроизводства. Сперма. Методы испытаний физических свойств и биологического, биохимического, морфологического анализов» [17]. Цвет определяли визуально. Объем эякулята оценивали посредством градировочного спермоприемника (см3). pН определяли с помощью рН-метра-милливольтметра"Эксперт-рН" (Эконикс-Эксперт) в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора. Итоговым результатом считали среднеарифметическое значение, полученное в результате двух последовательных измерений, при допустимом расхождении ± 0,1 ед. рН.
Определение резистентности спермиев проводили по методике В.К. Милованова и А.И. Короткова, 1951. Спермии в процессе спермиогенеза поверх кератиновой оболочки покрываются специализированным липопротеиновым слоем, который представляет собой тончайшую пленку. Эта оболочка определяет жизнеспособность спермиев, чем она устойчивее, тем выше оплодотворяющая способность спермиев.
Таким образом, резистентность - это надежный показатель устойчивости спермы при разбавлении ее 1% раствором хлористого натрия. Методику определения проводили следующим образом: три пробирки маркировали и наливали в них 1%-ный раствор NaCl – 10,0; 0,5 и 0,25 мл соответственно. Микропипеткой во флакон № 1 добавляли 0,02 мл неразбавленной спермы барана, размешивали мерной пипеткой, градуированный на 1 или 2 мл, и переносили из первого флакона во второй 0,5 мл. Повторно размешивали и переносили из второго флакона 0,25 мл в третий флакон.
В результате в первом флаконе сперму разбавляли 1%-ным раствором NaCl в 500 раз, во втором — в 1000, а в третьем - в 2000 раз. Через 3 минуты определяли наличие поступательно движущихся спермиев во всех флаконах под микроскопом в каплях, не накрытых покровным стеклом, при температурном режиме 40-42.Далее во флакон № 3 добавляли из бюретки 0,5 мл 1%-ного раствора NaCl (4000-кратное разбавление) и определяли наличие поступательно движущихся спермиев. В случае, если спермии имели поступательное движение, то снова добавляли 0,5 мл 1%-ного раствора NaCl. Добавление раствора проводили до полного прекращения поступательного движения. Далее проводили анализ проб.
Если поступательно-движущиеся спермий имеются только в первой пробирке, то резистентность спермиев равна – 500; во втором – 1000; в третьем – 2000. В третьей пробирке после однократного разбавления 0,5 мл 1%-ного раствора NaCl 4000; двукратного разбавления – 6000; трехкратного – 8000; четырехкратного – 10000; и т.д.
Изучение клинического статуса, микробиологических показателей и анализ спермограммы баранов-производителей
Причинами снижения качества спермиев при внесении их в среды для оплодотворения может быть множество факторов: инфекционные и неинфекционные заболевания баранов-производителей, микробная обсемененность свежеполученной спермы, неполноценность питательных сред и др. Для проведения экстракорпорального оплодотворения необходимо использование специально подготовленной спермы, для чего разработано множество методик. Однако, это в основном касалось скотоводства и отчасти свиноводства. Оплодотворение in vitro у овец в России носило фрагментарный характер и достоверно описано не было. Поэтому, подготовку спермы проводили по существующей методике зарубежных авторов (далее методика-прототип) [65]. Для оплодотворения использовали свежеполученную сперму барана, которую выдерживали в среде SOF без глюкозы с HEPES, лактатом натрия, 0,127 мг/мл пирувата натрия, 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина. Методика была выполнена следующим образом: 50 мкл свежеполученной спермы сразу вносили в пробирку, содержащую 0,45 мл среды SOF w. Центрифугировали 3 минуты при 200 G. Затем удаляли супернатант и ресуспендировали в 0,2 мл среды SOF w. Пробирку помещали в термостат на 15 минут (swim up). После инкубации надосадочную жидкость, содержащую живые спермии, отбирали и переносили в пробирку, содержащую 0,2 мл среды SOF w. Пробирку помещали в термостат на 15 минут для повторения процедуры swim up.
Для определения эффективности подготовки спермы по методике-прототипу, была проведена оценка наиболее важных показателей спермы, таких как активность, резистентность и количество живых спермиев с прямолинейно-поступательным движением (Табл. 10). Анализ спермы проводили до и после процедуры swim up, в результате которой происходила капацитация спермиев.
Анализируя показатели активности спермиев, установили, что при внесении спермы в среду SOF w, приготовленную по методике-протопиту, активность спермиев до процедуры swim up снизилась в среднем на 70,9 % по отношению к значениям ГОСТ 32200-2013, приведнным в таблице 8, а после процедуры swim up возросла на 14,5 %. Таким образом, нами зафиксировано достоверное снижение показателей активности после из созревания в среде SOF w на 47,6 %. (рис 4)
Количество живых спермиев после swim up снизилось на 53,2%, практически в 2 раза. В норме в сперме количество половых клеток должно быть не менее 80 %, поэтому показатель 46,8 % живых спермиев является ниже этого значения.
Из рисунка 5 видно, что резистентность спермиев после внесения их в разбавитель SOF w снизилась на 54,06%, но после swim up увеличилась на 21 %. В норме резистентность спермы должна быть в пределах от 20-40 тыс., в нашем опыте и до и после капацитации она была в пределах от 18,48± 0,15 до 14,23±0,43 и 18,08±0,29 и 23,06±0,25, что не соответствовало нормативным показателям.
Анализ количества спермиев с прямолинейно-поступательным движением при внесении свежеполученной спермы только в среду SOF w до процедуры swim up показал снижение значений на 47,97 %, а после увеличился на 11,43 %, что, тем не менее, значительно ниже нормальных данных указанных в ГОСТ 32200-2013. Статистическая значимость различий показателей спермы до и после проведения процедуры swim-up - р 0,05; статистическая значимость различий показателей спермы до и после процедуры swim-up подготовленной по двум методикам - # р 0,05 Рисунок 5– Динамика резистентности спермиев при внесении ее в разбавитель SOF w в норме, до и после процедуры swim up Таблица 11– Количество спермиев с прямолинейно-поступательным движением при подготовке спермы по методике-прототипу, n=10, % № животного Последовательность проведения swim up SOF w
После swim up 59,4 2 59,0 3 60,0 4 57,9 5 58,4 6 57,8 ИТОГО: 58,75 Примечание: 1. Статистическая значимость различий показателей спермы до и после проведения процедуры swim-up - р 0,05 Одним из показателей результативности оплодотворения является отсутствие агглютинации между спермиями и целостность их акросомы [103, 175]. Результаты оценки агглютинации спермы для ЭКО овец приведены в таблице
В норме склеиваются не более 3–5 % спермиев. Если количество агглютинированных спермиев составляло 10–15%, можно говорить о понижении их оплодотворяющей способности [12,48]. Установили, что при внесении спермы в культуральную среду SOF w до процедуры swim up, процент связанных спермиев с нормальных показателей увеличивался в 15,25 раз, с 4,00 % до 61,00 %, наибольший результат в группе показал образец спермы барана № 4 (Рис. 6). После процедуры средний показатель вырос на 25 %, хотя и остался значительно ниже нормы.
Оценка оплодотворяющей способности спермиев баранов-производителей подготовленной по разным методикам
Значительные усилия в репродуктивной биологии были сосредоточены на разработке процедур созревания и оплодотворения половых клеток в пробирке, что очень важно для фундаментальных и прикладных исследований. Изучением экстракорпорального оплодотворения у сельскохозяйственных животных преимущественно занимались иностранные ученые. У крупного рогатого скота изучением оплодотворения in vitro занимались Brackett (1982) [87,88], Xu, (1987) [206], Bavister, 1995 [84,85], коллектив Белорусских ученых под руководством Л.В. Голубец и др. (2010) [15]; у свиней Cheng (1986) [93]; у коз Hanada (1985) [119], Younis (1991) [126], de Smedt (1992) [127], Keskintepe 1994 [186]; у лошадей Palmer (1991) [125]; у овец Crozet (1987) [127,128], Czlonkowska (1991) [86] и S. Wang (1998) [64]. Единственными в России изучением процессов оплодотворения овец in vitro занималась команда ученых Ставропольского государственного аграрного университета под руководством Криворучко А.Ю. Все эти работы объединяет не только успешное получение эмбрионов животных in vitro, но и использование заморожено-оттаянной спермы, где она уже находится в каком-либо из разбавителей. Анализ эффективности использования такой спермы показал, что при оплодотворении ооцитов in vitro степень оплодотворения снижается, по сравнению со свежеполученной спермой на 30 – 40 % [29]. Таким образом, обособленного внимания подготовке свежеполученной спермы не уделялось, хотя применение таких спермиев является фактором успешного оплодотворения и здоровья полученного потомства.
К сожалению, в литературе практически отсутствуют сведения, в которых описывается исследование морфологии спермиев при подготовке эякулята баранов к процедуре экстракорпорального оплодотворения. Обычно подготовка спермы проходит по двум направлениям: с использованием метода «swim-up» и с применением разделения на градиенте плотности перколла [15].
В связи с этим, возможно, авторами и не уделялось такого внимания агглютинации, так как они использовали сперму замороженную, то есть, прошедшую этап подготовки в разбавителе. Однако мы считаем, так же, как ряд зарубежных исследователей, что предпочтительной является работа со свежей спермой потому, что количество активных спермиев в ней значительно выше, чем в замороженной сперме. Спермии в свежеполученной сперме обладают большей оплодотворяющей способностью, чем в заморожено – оттаянной. Жизнеспособность сперматозоидов после криоконсервации и оттаивания снижается с 85,6 до 34,3 %. Тем более, после криоконсервации может быть изменен механизм процесса капацитации, что существенно влияет на фертильность сперматозоидов [143, 196, 209].
Подготовленная свежеполученная сперма, полностью соответствовала нормативным значениям, указанным в ГОСТ 32200-2013 «Средства воспроизводства. Сперма баранов. Технические условия». Для ликвидации агглютинации спермиев и повышению уровня их активности и жизнеспособности, на этапе подготовки спермы мы использовали ГЦЖ среду, что позволило достичь значительного снижения числа связанных сперматозоидов в 15 раз, а нормальных спермиев в пробе подготовленной спермы стало на 16,7 % больше. Активность спермиев благодаря нашей методике выше в 1,3 балла, по сравнению с существующей технологией, количество живых спермиев достоверно выше на 43,65 %, а обладающих при этом прямолинейно-поступательным движением в 1,57 раз больше, при этом и жизнеспособность спермиев выросла в 1,6 раз. Улучшение показателей спермиев после предварительного их внесения в ГЦЖ буфер, связанно со специфическим влиянием входящих в его состав компонентов на спермии. Внесение спермы в среду ГЦЖ + SOF w способствует снижению степени агглютинации в 15 раз, чем при ее подготовке по методике-прототипу, при увеличении спермиев с нормальной морфологией и целостной акросомой на 16,7 % и 26,95 % соответственно. Предложенный нами метод позволяет достичь повышения уровня оплодотворяемости яйцеклеток в 3,5 раза и получить 7 бластоцит в преимплантационной стадии. Проведенные исследования позволили сделать следующие выводы и представить рекомендации по их практическому использованию.