Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Использование искусственного осеменения в козоводстве 9
1.2. Биологические повреждения сперматозоидов козлов при хранении в охлажденном и замороженном состоянии 10
1.3. Приемы повышения криоустойчивости сперматозоидов козлов 16
1.4. Современные методы криоконсервации спермы и искусственного осеменения в козоводстве 24
1.5 Методы стимуляции и синхронизации эструса у коз 28
2. Материал и методика исследований 37
2.1 Исследование показателей качества спермы козлов зааненской породы 37
2.2 Выяснение влияния температуры хранения на качество спермы козлов 38
2.3 Изучение криозащитного влияния антиоксидантов при хранении спермы в охлажденном и замороженном состоянии
2.3.1. Выяснение действия бычьего сывороточного альбумина на сперматозоиды при хранении в охлажденном до +17 0 С и +4 0 С состоянии 40
2.3.2. Действие бычьего сывороточного альбумина при замораживании сперматозоидов 40
2.3.3. Изучение влияния восстановленного глутатиона при хранении охлажденной спермы козлов 41
2.3.4. Изучение влияния восстановленного глутатиона при замораживании спермы козлов 42
2.4. Разработка новой среды для замораживания спермы козлов 43
2.4.1. Влияние концентрации желтка куриных яиц в новой среде на устойчивость сперматозоидов к замораживанию 44
2.4.2. Влияние концентрации глицерина в новой среде на криоустойчивость сперматозоидов 44
2.5. Изучение эффективности стимуляции эструса у коз 45
2.5.1. Изучение влияния прогестерона и ГСЖК на стимуляцию эструса вне сезона размножения 45
2.5.2. Определение эффективности стимуляции эструса во время полового сезона с помощью прогестерона, ГСЖК и простагландина F-2 45
2.5.3. Эффективность стимуляции эструса у коз во время сезона размножения с помощью простагландина F-2 46
3. Результаты исследований 46
3.1. Качественные показатели свежеполученной спермы козлов-производителей зааненской породы 46
3.2. Влияние условий хранения на показатели качества половых клеток козлов 47
3.2.1. Подвижность, живучесть и сохранность акросом при хранении сперматозоидов в охлажденном до +170 С и +40 С состоянии 47
3.3. Действие антиоксидантов на сперматозоиды козлов при хранении в охлажденном и замороженном состоянии 52
3.3.1. Защитное действие бычьего сывороточного альбумина при хранении спермы в охлажденном до +40 С и +170 С состоянии 52
3.3.2. Анализ эффективности бычьего сывороточного альбумина при замораживании сперматозоидов 56
3.3.3. Результативность защитного действия восстановленного глутатиона при хранении охлажденной спермы 59
3.3.4. Влияние восстановленного глутатиона при замораживании половых клеток козлов 61
3.4. Разработка новой среды для криоконсервации спермы козлов 64
3.4.1. Подбор оптимального соотношения электролитов и неэлектролитов в среде 64
3.5. Эффективность стимуляции эструса у коз с помощью гормональных препаратов 69
3.5.1. Результативность стимуляции эструса вне сезона размножения с помощью прогестерона и ГСЖК 69
3.5.2. Стимуляция эструса у коз во время сезона размножения с помощью комплексного применения прогестерона, ГСЖК и простагландина 72
3.5.3. Анализ эффективности стимуляции эструса у коз во время сезона размножения с помощью простагландина F-2 73
4.Обсуждение результатов 75
Выводы 84
Практические предложения 85
Список литературы 86
- Биологические повреждения сперматозоидов козлов при хранении в охлажденном и замороженном состоянии
- Изучение влияния восстановленного глутатиона при хранении охлажденной спермы козлов
- Результативность защитного действия восстановленного глутатиона при хранении охлажденной спермы
- Анализ эффективности стимуляции эструса у коз во время сезона размножения с помощью простагландина F-2
Введение к работе
Актуальность темы. Вопросы улучшения репродукции у коз являются важной технологической задачей, особенно при разведении животных на крупных промышленных фермах.
Среди этих вопросов наиболее актуальным является повышение эффективности воспроизводства и искусственного осеменения животных, что имеет большое значение для дальнейшего прогресса в области селекции и генетики в разводимых породах коз.
Важной научной задачей является совершенствование методов криоконсервации и повышения биологической полноценности сохраняемой при разных температурах спермы козлов.
При технологической обработке спермы, разбавлении её синтетическими средами, охлаждении и хранении в охлажденном состоянии происходят определенные структурные и биологические повреждения сперматозоидов, приводящие к значительному снижению их оплодотворяющей способности и результативности искусственного осеменения самок. Поэтому актуальной задачей является разработка более совершенных синтетических сред для криоконсервации спермы козлов-производителей, позволяющих повысить биологическую полноценность половых клеток в процессе их хранения и криоконсервации. В последние годы изучается возможность улучшения криоустойчивости сперматозоидов различных видов сельскохозяйственных животных путём использования в составе разбавителей для спермы различных биологически активных веществ и антиоксидантов. В этой связи представляет несомненный практический интерес изучение влияния различных биологически активных веществ на криоустойчивость спермы козлов.
Кроме того, в связи с тем, что козы относятся к животным с выраженным сезоном размножения, разработка более эффективных методов синхронизации и стимуляции у них эструса имеет большой практический интерес в связи с возможностью получения приплода в течение всего года и разработкой методов искусственного осеменения самок без выявления признаков половой охоты.
В настоящее время предлагаются различные гормональные методы воздействия на половой цикл коз. Но эффективность их применения всё ещё остается не достаточно высокой, в связи с чем требуются дальнейшие углубленные исследования в данном направлении.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы является повышение защитных свойств синтетической среды для криоконсерва-ции спермы козлов и совершенствование метода синхронизации эстру-са у зааненских коз.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние бычьего сывороточного альбумина и восстановленного глутатиона на подвижность и живучесть сперматозоидов козлов, сохраняемых в охлажденном до 17С и 4С состоянии;
Выяснить защитное влияние изучаемых антиоксидантов при глубоком замораживании спермы козлов до -196 С;
Определить результативность искусственного осеменения коз спермой, замороженной с восстановленным глутатионом;
Разработать новую синтетическую среду для замораживания спермы козлов;
Изучить влияние прогестерона и ГСЖК на синхронизацию эстру-са у зааненских коз в сезон размножения и вне этого сезона;
Выяснить эффективность синхронизации эструса коз в сезон размножения с помощью аналога простагландина F-2 - магэстро-фана.
Научная новизна исследований. Изучено влияние бычьего сывороточного альбумина и восстановленного глутатиона на биологическую полноценность сперматозоидов козлов, сохраняемых в охлажденном до 17 С и 4 С состоянии. Усовершенствована синтетическая среда для замораживания семени козлов, способствующая улучшению выживаемости сперматозоидов после процесса замораживания-оттаивания и повышению оплодотворяемости коз. Разработана новая синтетическая среда для замораживания семени козлов. Проведено сравнительное изучение эффективности синхронизации эструса у коз с помощью прогестерона и ГСЖК в сезон размножения и вне этого сезона. Изучена результативность синхронизации эструса у коз в сезон размножения с помощью однократного и двукратного введения аналога простагландина F-2 - магэстрофана.
Практическая значимость. Введение в состав синтетической среды оптимальных дозировок бычьего сывороточного альбумина и глутатиона способствует повышению её защитных свойств при хранении семени козлов в охлажденном состоянии. Замораживание семени
козлов в усовершенствованной среде с добавлением восстановленного глутатиона повышает подвижность, живучесть и оплодотворяющую способность сперматозоидов. Внутримышечное введение на протяжении 5 дней прогестерона в дозе 25 мг на животное в день с последующим однократным введением через 24 часа 500 ИЕ ГСЖК и 0,5 мл магэстрофана способствует эффективной синхронизации эструса у коз в сезон размножения.
Степень достоверности и апробация работы. Достоверность экспериментальных данных подтверждена биометрической обработкой полученных результатов.
Основные результаты диссертации доложены на:
9-м Международном симпозиуме по репродукции жвачных животных, г. Обихиро, Япония, 2014 г;
2-м Международном ветеринарном конгрессе VETistanbul Group - 2015, Санкт-Петербург, 2015 г;
Международной научно-практической конференции «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения», ФГБОУ РАМЖ, п. Быково, МО, 2015 г.;
6-й Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы животноводства и кормопроизводства в России», Тверская ГСХА, 2015 г;
Учёном совете ВНИИплем, 2014 г.;
Расширенной межотдельской конференции ВНИИплем, 2015 г.
Публикации по результатам исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей, в том числе 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах компьютерного текста и включает 26 таблиц. Диссертация содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследований, результаты исследований, обсуждение, выводы и практические предложения. Список литературы включает 200 источника, из которых 154 иностранных авторов.
Биологические повреждения сперматозоидов козлов при хранении в охлажденном и замороженном состоянии
Криоконсервация семени козлов вызывает ультраструктурные, биохимические и функциональные повреждения в сперматозоидах, что приводит к снижению подвижности и живучести половых клеток, нарушению их транспорта в половых путях самки и уменьшению оплодотворяющей способности. Несмотря на большое количество исследований, посвященных улучшению способов криоконсервации семени козлов, оплодотворяющая способность такого семени остается ниже, чем при использовании свежеполученного семени.
Одной из специфических проблем, связанных с хранением семени козлов, является наличие в их семенной плазме веществ, оказывающих повреждающее воздействие на сперматозоиды при введении в состав разбавителя желтка куриного яйца или молока.
Выяснение природы этих соединений показало, что в секрете бульбо-уретральной железы козлов содержится фермент, вызывающий коагуляцию яичного желтка (Roy A., 1957; Iritani A., Nishikawa Y., 1963).
При добавлении белков молока в состав разбавителя семени козлов, так же отмечается резкое снижение подвижности половых клеток, обусловленное взаимодействием ферментов семенной плазмы с этими белками.
В настоящее время биохимическая природа этих соединений семенной плазмы козлов установлена и эти ферменты относятся к классу триацилгли-церол липаз, в частности, этим ферментом является фосфолипаза А. (Pellicer M.T., 1995). Этот фермент катализирует гидролиз лецитина, содержащегося в яичном желтке, до свободных жирных кислот и лизолецитина. Образующиеся токсические вещества приводят к увеличению проницаемости цитоплазмати-ческой мембраны сперматозоидов, ускорению акросомной реакции и декон-денсации хроматина в ядре (Upreti G.C. e. a., 1999; Sawyer D.E., Brown D.B, 1995).
Семенная плазма, секретируемая у козлов вне сезона размножения, оказывает более повреждающее воздействие на подвижность и живучесть сперматозоидов козлов, разбавленных молочным разбавителем (Nunes J., 1982).
Поэтому было предложено с целью предотвращения токсического влияния ферментов семенной плазмы, проводить предварительное удаление плазмы из эякулята путем его центрифугирования перед разбавлением при 550-950 об/мин в течение 10-15 минут. (Nunes J.F. e. a., 1982; Ritar A.J., Sala-mon S., 1982; Leboeuf B. a.e., 1998).
Но при центрифугировании может происходить повреждение сперматозоидов и этот процесс довольно затруднителен в полевых условиях.
По данным ряда исследователей, удаление семенной плазмы помогает сохранить высокую подвижность и целостность акросом в сперматозоидах козлов после замораживания-оттаивания (Drobnis E.Z. e. a., 1980; Memon M.A. e. a., 1985).
По мнению других авторов, можно добиваться высокой сохранности сперматозоидов и без удаления семенной плазмы из эякулята козлов (Ritar A.J., Salamon S., 1982; Azeredo G.A., e. a., 2001).
Кроме того, предложено с целью минимизации времени взаимодействия сперматозоидов и фосфолипазы А, добавлять в состав разбавителя ингибитор данной липазы или использовать коровье молоко, освобожденное от липидной фракции (Pellicer-Rubio M.T., Combarnous Y., 1998).
Позднее было установлено, что снижение концентрации желтка в разбавителе (ниже 12%) позволяет получать высокую подвижность замороже-17 но-оттаянных сперматозоидов козлов после оттаивания без необходимости удаления предварительно семенной плазмы. (Ritar A.J., Salamon S., 1982).
Хорошие результаты по оплодотворяемости коз были получены при использовании для замораживания половых клеток козлов разбавителей, содержащих 1,5% желтка куриного яйца (Corteel J.M., 1975; Ritar A.J., Salamon S., 1983).
Наиболее широко применяются в настоящее время для криоконсерва-ции семени козлов обезжиренное сухое коровье молоко (Corteel J.M., 1974) или трис-глюкозный разбавитель (Salamon S., Ritar A.J., 1982).
Проведено большое количество исследований, посвященных изучению влияния различных факторов и веществ на устойчивость сперматозоидов козлов к глубокому замораживанию.
В опытах Salamon S. и Ritar A.J. (1982) изучалось действие осмотического давления разбавителей на криоустойчивость сперматозоидов козлов. Оказалось, что лучшее действие на подвижность и живучесть сперматозоидов проявил разбавитель с осмотическим давлением 54 mosm.
По мнению Bowen J.A. с сотрудниками (1988), меньшие повреждения в оттаянных сперматозоидах козлов наблюдались при осмотическом давлении среды в пределах 425 – 525 mosm.
Установлена большая роль постоянства pH среды при замораживании и оттаивании спермы козлов. Поэтому проведено много опытов по стабилизации pH в разбавителях для спермы с помощью различных буферных соединений (Good N.E. e. a., 1966; Graham E.F. e. a., 1972).
Лучшие результаты по подвижности и живучести оттаянных сперматозоидов козлов получены при значении pH в разбавителях в пределах 6,7 - 6,8 (Tuli R.K., Holtz W., 1992; Chauhan M.S. e. a., 1994).
Изучение защитного действия различных концентраций трис-гидроксиметил-аминометана показало, что лучшее защитное действие оказали концентрации данного вещества в пределах 300 – 450 mM (Salamon S.,
Ritar A.J., 1982). Сравнительное изучение эффективности замораживания спермы козлов в яично-фруктозном разбавителе с различными буферными соединениями: Bes, Tes, Test или Трис, показали, что наибольшая подвижность в оттаянной сперме (44%) и процент живых клеток (49%) получены в образцах, замороженных с Трис буфером ( Tuli R.K. e. a., 1992).
Положительное действие Триса на криоустойчивость спермы козлов было подтверждено и другими авторами (Drobnis E.Z. e. a., 1980; Deka B.B., Rao A.R., 1987).
Проведены опыты по изучению влияния различных сахаров на устойчивость сперматозоидов козлов при замораживании. Как известно, фруктоза является основным сахаром в сперме козлов (Mann T, 1954; Aboagla E.M., Terada T., 2003). Большинство авторов установило положительное влияние глюкозы и фруктозы при замораживании семени козлов (Corteel J.M., 1974) .
По мнению Naing S.W. e. a., (2010), совместное использование в разбавителе для спермы козлов глюкозы и тригалозы повышает криовыживае-мость половых клеток.
Имеются данные о высоком криозащитном влиянии трегалозы на сперматозоиды козлов (Aboagla E.M., Terada T., 2003). Лучшее действие было отмечено при добавлении в состав среды 375 mM данного сахара. Этот сахар оказывает так же влияние на микровязкость мембраны половых клеток козлов, тем самым повышая их криорезистентность, особенно при замораживании в разбавителе, содержащем 75% или 100% трегалозы (Eiman M.E. e. a., 2003).
Изучение влияния восстановленного глутатиона при хранении охлажденной спермы козлов
В экспериментах использовали сперму зааненских козлов в возрасте 2-3 лет, содержащихся в ООО «Красная Нива», Московской области.
В первом эксперименте изучали влияние бычьего сывороточного альбумина (Sigma, США) на подвижность, живучесть и целостность акросом у сперматозоидов, сохраняемых в охлаждённом до 4 0 С состоянии. Сразу после получения и оценки цельные эякуляты козлов разбавляли 1:3 средой, содержащей на 100 см3 дистиллированной воды: глюкоза – 0,8 г; цитрат натрия 2-х водный – 2,38 г; полиген – 30 мг. В опытные группы разбавленного семени вводили различные дозы (0,01 – 0,1 мг/мл) бычьего сывороточного альбумина. Контрольные образцы семени разбавляли этой же средой, дополнительно содержащей на 100 см3 дистиллированной воды 2,5 см3 желтка куриного яйца, без добавления BSA. После разбавления сперму хранили в холодильнике при 40 С и через определенные интервалы времени определяли подвижность сперматозоидов и процент клеток с неповрежденной акросомой.
Во втором эксперименте выясняли защитное действие BSA в аналогичной дозировке при хранении спермы при 170 С. Сперму разбавляли той же средой, без добавления желтка куриного яйца, в соотношении 1:3; добавляли различные дозировки BSA и помещали на хранение в термобокс при 170 С. Контрольная группа спермы разбавлялась этой же средой, но без добавления альбумина. Через каждые 24 часа анализировали показатели подвижности и сохранности акросом в сперматозоидах.
Кроме того, мы провели изучение действия BSA при глубоком замораживании спермы козлов до -1960 С. Сперму в опытных группах разбавляли и замораживали в трис-глюкозо-лимоннокислой среде, содержащей на 100 см3 дистиллированной воды: трис-оксиметил-аминометан – 4,04 г; глюкоза – 0,67 г; лимонная кислота – 2,32 г; глицерин – 5,3 мл; полиген – 30 мг. Цельные свежеполученные эякуляты с нормальными показателями разбавляли данной средой 1:3 и добавляли различные концентрации BSA (0,01 – 0,1 мг/мл). Контрольные образцы семени разбавляли аналогичной средой , содержащей дополнительно 2,5 см3 желтка куриного яйца на 100 см3 разбавителя, без добавление альбумина. После разбавления, сперму эквилибрировали в холодильнике при 40 С в течение 2 часов, замораживали в виде гранул объемом 0,2 см3 на фторопластовой пластине при -800 С, а затем в жидком азоте до -196 0 С. Оттаивали гранулы семени в гидрооттаивателе при 600 С. Оттаянные образцы семени инкубировали в термобоксе при 370 С и через определённые интервалы времени определяли анализируемые показатели.
В эксперименте использовали сперму козлов зааненской породы. В первом эксперименте изучали влияние восстановленного глутатиона на подвижность, живучесть и целостность акросом у сперматозоидов, сохраняемых в охлажденном до 40 С состоянии. Сразу после получения и оценки, цельные эякуляты козлов разбавляли 1:3 трис-фруктозо-лимоннокислой средой, содержащей на 100 см3 дистиллированной воды 2,5 см3 желтка куриного яйца и антибактериальный препарат полиген – 30 мг. Перед разбавлением в состав среды вводили различные концентрации (0,02 – 0,32 мг/мл) восстановленного глутатиона (Sigma, США). Контрольные образцы семени разбавляли этой же средой, но без добавления глутатиона. Затем помещали разбавленную сперму для хранения в холодильнике при 40 С. Через определенные интервалы времени хранения определяли подвижность сперматозоидов, количество половых клеток с неповрежденной акросомой и показатель их живучести. 2.3.4. Изучение влияния восстановленного глутатиона при замораживании спермы козлов
В следующем эксперименте выясняли защитное действие восстановленного глутатиона на устойчивость сперматозоидов козлов при глубоком замораживании до -1960 С. Сперму козлов разбавляли и замораживали в трис-глюкозо-лимоннокислой среде, с добавление на 100 см3 среды 5,3 см3 глицерина, 2,5 см3 желтка куриного яйца и 30 мг полигена. Свежеполучен-ные цельные эякуляты, без предварительного удаления семенной плазмы, разбавляли 1:3 данной средой, содержащей различные концентрации восстановленного глутатиона (0,02 – 0,16 мг/мл). Контрольные образцы семени разбавляли аналогичной средой, но без добавления глутатиона. После разбавления сперму эквилибрировали в холодильнике при 40 С течение 2 часов, замораживали в виде гранул 0,2 см3 на фторопластовой пластине при -800 С и затем в жидком азоте до -1960 С. Оттаивали гранулы семени в гидрооттаива-теле при 600 С. Затем оттаянные образцы семени инкубировали в термобоксе при 370 С и через определенные интервалы времени определяли подвижность сперматозоидов, количество клеток с неповрежденной акросомой и их живучесть при этой температуре.
Для проверки влияния добавления глутатиона в состав замораживающей среды на результативность искусственного осеменения коз были проведены специальные эксперименты. В опытной группе коз осеменяли двукратно в течение эструса спермой, замороженной с добавлением в состав трис-глюкозо-лимоннокислой среды 0,04 мг/мл восстановленного глутатиона. Контрольную группу осеменяли спермой, замороженной в аналогичной среде, но без добавления глутатиона. В дозе для осеменения в обоих группах содержалось 100 млн. подвижных сперматозоидов в 0,2 мл спермы. Сперму замораживали в гранулах объемом 0,2 мл. Оттаивали сперму в гидрооттаивате-ле при 600 С
Оптимальный состав новой синтетической среды для хранения семени козлов в замороженном состоянии мы разрабатывали на основе комбинации различного сочетания изотонических растворов фруктозы, трис- (оксиметил)-аминометана и этилендиамин-тетрауксусной кислоты.
Результативность защитного действия восстановленного глутатиона при хранении охлажденной спермы
В настоящее время успехи в области селекции и репродукции коз достигнуты благодаря более широкому внедрению в практику козоводства метода искусственного осеменения. При этом появляется возможность более широкого использования в селекционных программах наиболее ценных в генетическом плане и проверенных по качеству потомства козлов-производителей.
Как известно, результативность искусственного осеменения самок зависит от биологической полноценности используемой спермы.
В этой связи, в задачу наших исследований входило изучение основных показателей качества свежеполученной и криоконсервированной спермы козлов зааненской породы, содержащихся в ООО «Красная Нива», Московской области. Эксперименты проводились в сезон размножения с использованием спермы козлов в возрасте 2-3 лет.
На основании проведенных нами экспериментов было установлено, что объем эякулята у козлов в среднем составлял 2,2 мл; концентрация сперматозоидов – 2,4 млрд./мл; подвижность сперматозоидов – 78 %. Содержание сперматозоидов с морфологическими нарушениями в эякуляте достигало 10,9 %, а половых клеток с поврежденной акросомой – 7,8 %.
Результаты опытов по влиянию хранения спермы козлов в охлажденном до 40 С состоянии на подвижность и живучесть сперматозоидов показали, что при этой температуре разбавленная сперма козлов сохраняет довольно высокую подвижность при хранении в течение 4 дней, затем подвижность снижается по мере хранения спермы и на 9-й день хранения только 2-3 % сперматозоидов сохраняли подвижность.
Анализ сохранности акросомной мембраны у сперматозоидов при хранении при 40 С показал, что заметное снижение процента сперматозоидов с неповрежденной акросомой также наблюдается на 4-й день хранения спермы. Хранение разбавленной и охлажденной спермы козлов при более высокой температуре (170 С) приводило к заметному снижению подвижности сперматозоидов уже через двое суток хранения, и на 6-й день хранения в сохраняемой сперме уже не было отмечено подвижных половых клеток. А количество сперматозоидов с поврежденной акросомой значительно увеличивалось уже через 72 часа хранения при этой температуре.
Глубокое замораживание спермы козлов в жидком азоте при температуре -196 0 С способствовало снижению подвижности сперматозоидов сразу после оттаивания на 36% по сравнению с первоначальным уровнем.
Живучесть оттаянных сперматозоидов козлов при 370 С сохранялась на протяжении 4-5 часов.
Таким образом, проведённые нами исследования показали, что у отдельных козлов-производителей имеются определенные различия в показателях свежеполученной и криоконсервированной спермы. Это свидетельствует о том, что необходимо производить предварительный отбор козлов с более высокой устойчивостью их спермы к хранению как в охлажденном, так и в замороженном состоянии с целью их дальнейшего использования в селекционных программах.
Увеличение сроков сохранения биологической полноценности сперматозоидов при хранении спермы козлов в охлажденном или замороженном состоянии представляет значительный практический интерес.
При криоконсервации в сперме наблюдается активизация процесса пе-рекисного окисления липидов, в результате чего образуются свободные кислородные радикалы, способствующие повреждению мембран сперматозоидов, ДНК и других клеточных структур (Aitken R. J. e.a., 1989; Ерохин А.С. и др., 1992; Sanocka D.M., Kurpisz M., 2004). Мембраны сперматозоидов разных видов животных, в том числе и козлов, содержат высокий уровень ненасыщенных жирных кислот, что способствует их пониженной устойчивости к процессу пероксидации липидов. При этом нарушается биологическая полноценность половых клеток и снижается результативность искусственного осеменения самок. Введение антиоксидантов в состав разбавителей семени животных способствует снижению уровня пероксидации липидов в половых клетках и может улучшить результативность искусственного осеменения сельскохозяйственных животных (Uysal J., Bucak M., 2007; Ерохин А.С., Ду-нин М.И., 2013).
По данным ряда исследователей, бычий сывороточный альбумин обладает антиоксидантными свойствами и его добавление в состав разбавителя для семени животных оказывает положительное влияние на подвижность и живучесть сперматозоидов (Yashamiro H. e.a., 2006; Anghel e.a., 2010).
В нашей работе мы изучали влияние введения в состав разбавителя для семени козлов различных дозировок бычьего сывороточного альбумина (BSA) на биологическую полноценность криоконсервированных сперматозоидов.
Добавление BSA в состав среды для хранения спермы козлов при 40 С не оказало положительного влияния на подвижность сперматозоидов и сохранность акросомной мембраны. Но использование этого препарата в дозе 0,1 мг/мл среды способствовало улучшению подвижности и живучести сперматозоидов, сохраняемых в охлажденном до 170 С состоянии. Добавление BSA при этом также повышало сохранность акросом в сперматозоидах опытных групп.
В задачу наших исследований входило и изучение влияния бычьего сывороточного альбумина на устойчивость сперматозоидов козлов к глубокому замораживанию. При этом было установлено, что его применение в составе разбавителя, в котором отсутствует желток куриного яйца, в дозах 0,08 - 0,1 мг/мл, оказало заметное криозащитное влияние. Но подвижность заморожено-оттаянных сперматозоидов в контрольной группе, где в составе среды содержался желток куриного яйца, была достоверно выше. Живучесть оттаянных сперматозоидов также была выше в контрольной группе.
Анализ эффективности стимуляции эструса у коз во время сезона размножения с помощью простагландина F-2
Добавление восстановленного глутатиона в дозах 0,02-0,08 мг/мл в состав среды для замораживания семени козлов оказало выраженное защитное влияние на криоустойчивость сперматозоидов. Более заметный эффект отмечен в группе с добавлением 0,04 мг препарата на 1 мл среды. В этой группе сразу после оттаивания подвижность половых клеток была на 8 % выше, по сравнению с контролем (Р 0,05). Живучесть оттаянных сперматозоидов при 37 С в этой группе была на 19 % выше, чем в контрольной (Р 0,05). Также изученный препарат оказал защитное влияние и на сохранность акросом в сперматозоидах.
В последующем эксперименте мы изучили влияние оптимальной дозировки восстановленного глутатиона (0,04 мг/мл среды) на оплодотворяющую способность сперматозоидов, подвергнутых глубокому замораживанию. Введение препарата в этой дозе в состав замораживающей среды способствовало повышению оплодотворяемости коз от криоконсервированного семени на 10,7 % по сравнению с контрольной группой. Таким образом, результаты этого эксперимента свидетельствуют, что добавление восстановленного глу-татитона в оптимальной дозировке в состав замораживающей среды способствует повышению результативности искусственного осеменения коз.
К настоящему времени учеными разработано несколько синтетических сред для замораживания спермы козлов, в состав которых входят различные углеводы, соли и буферные соединения (Corteel J.M., 1981; Evans G., Maxwell W., 1987; Ritar A.J. e.a., 1990; Leboef B. e.a., 2000). Но недостатком многих сред является их низкая криозащитная эффективность на сперматозоиды, в результате чего после процесса замораживания-оттаивания погибает более 50% половых клеток. Поэтому в своей работе мы попытались разработать новую синтетическую среду для замораживания спермы козлов, обладающую высокими защитными свойствами на сперматозоиды при замораживании. В качестве основных компонентов этой среды нами были выбраны фруктоза, трилон-Б и трис-(оксиметил)-аминометан. На основании изучения живучести сперматозоидов козлов при различных вариантах соотношения изотонических растворов используемых веществ, был разработан состав новой среды, в который входят: вода дистилированная – 100 мл; трис-(оксиметил)-аминометан – 0,42 г; фруктоза – 3,0 г; трилон - Б – 1,32 г.
После выбора оптимального соотношения электролитных и неэлектролитных компонентов в разрабатываемой нами среде, мы провели опыты по изучению влияния различных концентраций глицерина и желтка куриного яйца в составе этой среды на криоустойчивость сперматозоидов козлов.
Анализ результатов показал, что лучшее действие при замораживании спермы в этой среде было получено при содержании в ней 6-7 % глицерина и 5-7 % желтка.
Таким образом, в результате наших лабораторных исследований была разработана среда для замораживания спермы козлов, следующего состава: вода дистилированная – 100 мл; трис-(оксиметил)-аминометан – 0,42 г; фруктоза – 3,0 г; трилон-Б – 1,32 г; глицерин – 6,0 мл; желток куриного яйца – 6 мл; полиген – 30 мл.
В дальнейшем необходимо провести испытания по изучению результативности искусственного осеменения коз спермой, замороженной в этой среде.
Дальнейшее совершенствование методов синхронизации и стимуляции эструса у коз имеет большой научный и практический интерес.
В настоящее время предложены различные гормональные методы воздействия на половой цикл сельскохозяйственных животных, в том числе коз (Айбазов М.М. и др., 2004; Айбазов А-М.М. и др., 2006; Ерохин А.С., 2013; Khandoker M.A.M. e.a., 2009). Выбор схемы и метода регуляции полового цикла зависит от сезона года. Например, простагландины применяются во время сезона размножения, когда в яичниках имеются функциональные желтые тела (Малахова Л.С., 2003; Аксёнова П.В.. 2012).
Гормональные препараты обычно используют вне сезона размножения. При этом применяют прогестерон или синтетические гестагены, ГСЖК, ри-лизинг-гормоны (Ерохин А.С., 2013; Rekik M. e.a., 2014). В настоящее время используются усовершенствованные методы введения самкам прогестагенов путем применения внутривлагалищных полиуретановых губок или силиконовых спиралей, пропитанных определенным количеством прогестерона или его синтетических аналогов, например, медроксипрогестерон ацетатом или флуорогестон ацетатом (Powell M.R. e.a., 1996; Айбазов А-М.М. и др., 2007). Но данные приспособления довольно дороги или не имеют официальной регистрации в РФ, позволяющей их использование в практических условиях.
В этой связи представляет интерес изучение эффективности стимуляции эструса у коз в различные сезоны года с помощью применения внутримышечного введения прогестерона совместно с гонадотропинами.
В первом эксперименте, проведённом вне сезона размножения, мы изучали результативность стимуляции эструса у коз путём сравнительного применения двух схем введения прогестерона. Первая схема состояла из ежедневного внутримышечного введения козам на протяжении 5-ти дней по 25 мг прогестерона. Особенностью второй схемы было трехкратное введение прогестерона через день, в той же дозировке. Затем в обоих случаях самкам через 48 часов после последней инъекции прогестерона вводили однократно внутримышечно 500 ИЕ ГСЖК и после выявления эструса, их покрывали козлами.