Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Морфофункциональные особенности организации гистогематических барьеров .17
1.2. Проницаемость гистогематических барьеров для наночастиц .32
1.3. Проницаемость многослойного плоского ороговевающего эпителия для наночастиц 38
1.4. Биологическое влияние золотых наночастиц в экспериментах in vivo и in vitro 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1. Объекты исследования и схемы экспериментов in vivo 53
2.1.1. Схема эксперимента по изучению биораспределения золотых наночастиц при их внутривенном введении и нанесении на кожу 58
2.1.2. Схема эксперимента по изучению проницаемости гематоплацентарного барьера для золотых наночастиц, вызванных этим морфологических изменений плаценты и их эмбриотоксического действия 59
2.1.3. Схема эксперимента по изучению проницаемости гематоэнцефалического, гематотестикулярного и гематоретинального барьеров для золотых наночастиц при их внутривенном введении и вызванных этим морфологических изменений органов 61
2.1.4. Схема эксперимента по изучению проницаемости многослойного плоского ороговевающего эпителия для золотых наночастиц и вызванных этим морфологических изменений в коже 63
2.1.4.1. Изучение проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц .63
2.1.4.2. Усиление проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц физическими способами 63
2.1.4.3. Усиление проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц химическими агентами 65
2.1.4.4. Мультимодальное усиление проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц .65
2.1.4.5. Проницаемость патологически измененной кожи для золотых наночастиц 66
2.1.4.6. Усиление проницаемости патологически измененной кожи для золотых наночастиц физическим способом .67
2.1.4.7. Усиление проницаемости патологически измененной кожи для золотых наночастиц химическими агентами 67
2.1.4.8. Мультимодальное усиление проницаемости патологически измененной кожи для золотых наночастиц .67
2.1.5. Схема эксперимента по изучению потенциальной токсичности золотых наночастиц в экспериментах in vivo и in vitro 68
2.1.5.1. Токсичность золотых наночастиц и их морфологическое влияние на внутренние органы крыс при внутривенном введении .68
2.1.5.2. Токсичность золотых наночастиц для опухолевых клеток in vitro 69
2.2. Методы исследования 71
2.2.1. Морфологические методы исследования 71
2.2.1.1. Гистологические методики 71
2.2.1.2. Гистохимические методики 72
2.2.1.3. Морфометрические методы 74
2.2.2. Биофизические методы исследования 75
2.2.2.1. Атомно-адсорбционный спектральный анализ 75
2.2.2.2. Оптическая когерентная томография 76
2.2.2.3. Флуоресцентный анализ клеток in vitro 77
2.2.3. Методы статистической обработки экспериментальных данных 78
Глава 3. Результаты собственных исследований 80
3.1. Выявление золотых наночастиц в гистологических препаратах.. 80
3.2. Биораспределение золотых наночастиц 87
3.2.1. Распределение золотых наночастиц при их внутривенном введении .87
3.2.2. Распределение золотых наночастиц при их нанесении на кожу .90
3.3. Проницаемость гистогематических барьеров для золотых наночастиц разного диаметра при внутривенном введении .91
3.3.1 Проницаемость гематоплацентарного барьера для золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения плаценты 91
3.3.2. Проницаемость гематоэнцефалического барьера для золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения в головном мозге .101
3.3.3. Проницаемость гематотестикулярного и гематоретинального барьеров для золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения в органах .103
3.4. Морфологические изменения внутренних органов крыс в системе «мать-плод» при внутривенном введении золотых наночастиц разного диаметра 106
3.4.1. Морфологические изменения внутренних органов беременных крыс 106
3.4.2. Морфологические изменения внутренних органов плодов при внутривенном введении золотых наночастиц беременным крысам 115
3.5. Проницаемость многослойного плоского ороговевающего эпителия для золотых наночастиц 125
3.5.1. Проницаемость здоровой кожи для золотых наночастиц 125
3.5.2. Физические способы усиления проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц 130
3.5.3. Проницаемость здоровой кожи для золотых наночастиц при действии химических энхансеров .139
3.5.4. Мультимодальный подход к усилению транспорта золотых наночастиц в здоровую кожу 144
3.5.5. Проницаемость поврежденной кожи для золотых наночастиц 148
3.6. Токсичность золотых наночастиц в экспериментах in vivo и in vitro 163
3.6.1. Токсичность золотых наночастиц разного типа при их внутривенном введении в остром эксперименте 163
3.6.2. Токсичность золотых наночастиц для опухолевых клеток в различные периоды клеточного цикла in vitro 174
Глава 4. Обсуждение результатов исследования .180
Выводы 220
Практические рекомендации .222
Библиографический список 223
- Проницаемость гистогематических барьеров для наночастиц
- Проницаемость гематоплацентарного барьера для золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения плаценты
- Физические способы усиления проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц
- Токсичность золотых наночастиц для опухолевых клеток в различные периоды клеточного цикла in vitro
Проницаемость гистогематических барьеров для наночастиц
Число работ, посвященных исследованию проницаемости гистогематических барьеров для НЧ и особенно ЗНЧ в отечественной и зарубежной литературе, невелико. Так, была исследована проницаемость ЗНЧ через плацентарный барьер ex vivo, используя перфузионную модель плаценты человека. Монодисперсные ЗНЧ размером 10, 15 и 30 нм, покрытые ПЭГ, перфузировали в течение 6 часов. ЗНЧ указанных диаметров в плодной части плаценты обнаружены не были. После перфузии концентрация НЧ в материнской части плаценты уменьшалась до 64% от первоначальной дозы. Авторы предполагают, что частицы задерживались в тканях плаценты – электронно-микроскопический анализ показал, что НЧ в основном располагались в синцитиотрофобласте и не были обнаружены в эндотелиоцитах фетальных капилляров, свидетельствуя о том, что плацентарный барьер человека непроницаем для ПЭГ-покрытых ЗНЧ (Myllynen P.K. et al., 2008).
В другой работе, применяя перфузионную модель плаценты человека, с применением полистиреновых НЧ с флуоресцентными метками диаметром 50, 80, 240 и 500 нм авторами была изучена размерная зависимость транспорта НЧ ex vivo. Результаты показали, что НЧ размером до 240 нм обнаруживались в плаценте в следующих количествах от вводимой дозы: 35% для 50 нм частиц, 30% для 80 нм и 9% для 240 нм. Статистически значимое количество полистиреновых НЧ диаметром 500 нм обнаружено не было. Авторы обращают внимание на размерную зависимость проницаемости плацентарного барьера без поражения жизнеспособных тканей (Wick P. et al., 2010).
Различия результатов работы этих двух исследовательских групп (Myllynen P.K. et al., 2008; Wick P. et al., 2010), которые использовали НЧ небольших размеров, могут быть объяснены различными видами покрытия поверхности НЧ и их стабильностью, а также различиями экспериментальных условий.
Перфузионная модель плаценты человека была также использована для исследования проницаемости дендримеров полиамидоамина в плод ex vivo (Menjoge A.R. et al., 2011). Авторами были использованы НЧ с флуоресцентными метками диаметром порядка 5-6 нм. Высокоэффективная жидкостная хромотография (HPLC-анализ) показала, что дендримеры обнаруживаются в плодной части плаценты уже после 15 минут перфузии и концентрация их увеличивается в течение всего эксперимента, который длился 5,5 часов. Коэффициент финальной концентрации дендримеров в плаценте достигал величины 0,07, а абсолютная концентрация НЧ в плодной части составляла 3% от вводимой дозы. Анализ тканей на флуоресцентном микроскопе показал, что дендримеры в основном накапливаются в межворсинчатом пространстве, окружая край синцитиотрофобласта. В отдельных случаях НЧ определялись в фетальных капиллярах. Однако разрешение использовавшегося микроскопа было слишком малым для визуализации одиночных НЧ, а сигнал флуоресценции отражает сам факт того, что дендримеры находятся в данной области. Результаты исследования показали, что использованные в экспериментах НЧ в человеческой плаценте не накапливаются в значительном объеме. Авторы предполагают, что транспорт НЧ через синцитиотрофобласт относиться к параклеточной диффузии, из-за малых размеров НЧ (5,5 нм) и, в меньшей степени, к трансклеточному транспорту. Результаты исследования также указывают на то, что транспорт через плаценту человека дендримеров, коньюгированных с лекарственным веществом, снижен, по сравнению с только одним лекарством.
Исследования с помощью ex vivo модели имеют определенные неудобства в сравнении с изучением in vivo. Так, время перфузии ограничено несколькими часами в связи с отмиранием тканей. Экспланты характеризуют проницаемость плаценты только на поздней стадии беременности, когда сама плацента подвергается существенным преобразованиям, подготавливаясь к родам, и происходит редукция барьерной функции. Безусловно, на более поздних сроках эмбриогенеза проницаемость гематоплацентарного барьера будет выше.
Можно ожидать, что накопление НЧ в трофобласте, медленное и постепенное освобождение НЧ из плодной части плаценты (Myllynen P.K. et al., 2008; Menjoge A.R. et al., 2011), могут оказывать продолжительные физиологические эффекты на жизнедеятельность клеток плаценты и эмбриона, а также в результате косвенного влияния на развивающийся плод через материнский организм. Эти вопросы сложно осветить, используя ex vivo технологии. Кроме того, модель ex vivo не может предоставить информацию о распределении НЧ, их накоплении в плоде и последующих физиологических эффектах после введения матери НЧ во время беременности.
К настоящему моменту имеется только несколько исследований проницаемости НЧ через барьер гемохориальной плаценты in vivo. В частности, была изучена проницаемость полупроводниковых НЧ через плацентарный барьер и их накоплении в эмбрионах мыши. Авторы использовали квантовые точки, состоящие из кадмий-телурового ядра, покрытые меркаптопропионовой кислотой. НЧ вводились в хвостовую вену беременным мышам за 1-5 суток до предполагаемого срока родов, когда плацентарный барьер считается полностью сформированым. Кадмий аккумулировался в эмбрионах, достигая 0,6% от вводимой дозы (20 мг Cd). Авторы установили, что трансплацентарная проницаемость НЧ зависит от размера и покрытия квантовых точек. В частности, введение квантовых точек небольших размеров (были использованы 1,7 нм, 2,6 нм, 3,2 нм) обусловливает высокий уровень содержания кадмия в тканях эмбриона. В случае стабилизации частиц оксидом кремния или покрытием их ПЭГ трансплацентарный перенос НЧ снижался (Chu M. et al., 2010). Однако следует отметить, что распределительный анализ численности квантовых точек был осуществлен авторами посредством атомно-эмиссионного спектрометра с индуктивно-связанной плазмой (ICP-AES), техники, которая чувствительна к элементному составу, в частности, к кадмию. Очевидно, что использование такого рода спектрометра не могло позволить авторам отличить, соответствовал ли обнаруженный в эмбрионах кадмий кадмию, входящему в состав кристаллов квантовых точек, или ионам Cd+2, которые образуются после деградации квантовых точек в материнском организме (Kulvietis V. et al., 2011; Buerkihurnherr T. et al., 2012). Эта двусмысленность подрывает надежность ICP-AES метода для оценки концентрации НЧ in vivo. Кадмий-теллуровые квантовые точки деградируют in vivo и приобретают токсичность благодаря наличию ионов Cd+2 (Liu L. et al., 2008; Lin C.H. et al., 2009). Поэтому уменьшение аккумуляции кадмия в эмбрионах после покрытия НЧ может быть объяснено следующим образом: во-первых, покрытие стабилизаторами кадмий-телуровых НЧ обусловило минимизацию образования ионов Cd+2, во-вторых, при покрытии увеличивается общий размер НЧ, результатом чего и будет являться снижение их проницаемости через плацентарный барьер. Обращает внимания тот факт, что непокрытые кадмий-телуровые квантовые точки обладают отрицательным зарядом, вследствие чего такие НЧ легко взаимодействуют с белками плазмы, что приводит к значительному увеличению их диаметра (Chen Z. et al., 2008). Так как НЧ, покрытые ПЭГ, имеют нейтральный заряд, что уменьшает белковую адсорбцию, а соотвественно и значительного увеличения диаметра НЧ не происходит.
Авторами также были обсуждены эмбриотоксичность после введения квантовых точек. Они установили, что эмбриотоксичность коррелирует с концентрацией кадмия в эмбрионах. Токсический эффект был низким при использовании квантовых точек больших диаметров и НЧ, покрытых ПЭГ (Chu M.. et al., 2010). Другая группа исследователей отмечала возникновение осложнений беременности у мышей, которым внутривенно вводили НЧ кремния и оксида титана различного диаметра (Yamashita K. et al., 2011). Оптический анализ показал аккумуляцию флуоресцирующих меток НЧ кремния диаметром 70 нм и НЧ оксида титана размером 143 нм в плаценте через 24 часа после их введения. Электронная микроскопия обнаружила, что изучаемые НЧ были локализованы в клетках трофобласта плаценты, а также в печени и мозге плода. Однако, НЧ кремния большего размера (300-1000 нм) в плаценте или плоде обнаружены не были. Авторы предполагают, что НЧ проникают через плаценту активным межклеточным транспортом или напрямую, повреждая структуры, формирующие плацентарный барьер. Наличие НЧ в мозге плодов авторы объясняют не полностью сформированным гематоэнцефалическим барьером на исследованной стадии эмбриогенеза. Эксперименты показали, что НЧ кремния и оксида титана индуцируют неблагоприятные эффекты на эмбриогенез, включающие ингибирование роста, резорбцию, дисфункции плаценты и другие функциональные и структурные изменения. Вызванные физиологические изменения не были обнаружены для 300 нм и 1000 нм частиц, что коррелируют с непроницаемостью больших НЧ через барьер – частицы, указанных размеров не накапливались в плаценте или плоде. Токсичность НЧ зависела от концентрации НЧ, и предотвращалась покрытием НЧ кремния карбокси- или аминогруппами. Примечательно, что накопление НЧ в плодах не изменялось после связывания их поверхности с лигандами.
Проницаемость гематоплацентарного барьера для золотых наночастиц и обусловленные этим морфологические изменения плаценты
Была изучена проницаемость гематоплацентарного барьера при внутривенном введении ЗНЧ различного диаметра. ЗНЧ диаметром 5, 10, 30, 50 и 150 нм, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), объемом 2 мл/кг массы животного, концентрацией 50 мкг/мл внутривенно вводили беременным самкам белых крыс на 15-е сутки гестации, что соответствует дозе в 100 мкг (золота)/кг массы животного (в среднем 30-40 мкг(Au) на животное).
In vivo ГПБ хориального типа оказывается проницаемым для ЗНЧ диаметром 5, 10, 30 и 50 нм - методом ААС анализа установлено, что содержание ЗНЧ, указанных диаметров, в плодах экспериментальных групп животных после внутривенного введения суспензии ЗНЧ матери в среднем достоверно превышает таковое плодов контрольной группы в 23-57 раза (на уровне p 0,005). Содержание золота в плодах интактных животных и животных контрольной группы, которым вводили физиологический раствор, составляет 0,12±0,03 и 0,11±0,07 нг/г сырого веса плодов соответственно, что практически идентично (табл. 2). Количество ЗНЧ в плодах, полученных от самок, которым не вводили ЗНЧ, находится в пределах погрешности атомно-адсорбционного спектрометра, и, вероятно, обусловленно предыдущими измерениями аналита с высоким содержанием золота.
Наибольшее содержание золота установлено для плодов животных, подвергшихся введению суспензии ЗНЧ диаметром 50 нм – концентрация золота в плодах равна 6,58±1,9 нг/г сырого веса плодов (табл. 2), что составляет порядка 0,5% от вводимой дозы ЗНЧ на общее количество плодов (0,05 % для одного плода).
Отсутствуют существенные отличия в проницаемости гематоплацентарного барьера для золотых наночастиц размером от 5 до 30 нм (р 0,05). Количество ЗНЧ диаметром 5-30 нм, преодолевших гематоплацентарный барьер, составляет порядка 0,25% от вводимой дозы ЗНЧ на общее количество плодов (0,025 % для одного плода). Согласно полученным результатам можно предположить, что золотые наночастицы размером 150 нм практически не преодолевают плацентарный барьер. В плодах, полученных от животных, которым внутривенно вводили наночастицы размером 150 нм, содержание ЗНЧ составило 0,09±0,03 нг/г сырого веса плодов, что соответствует значениям данного показателя для животных интактной и контрольной групп. Данные ААС анализа концентрации золота в плодах подтверждены результатами гистохимического обнаружения наночастиц золота в гистологических препаратах – применение метода автометаллографии не позволило выявить наночастицы золота в тканях плодов, полученных от крыс, которым внутривенно вводили ЗНЧ диаметром 150 нм.
Для установления зависимости проницаемости ЗНЧ через гематоплацентарный барьер и размера ЗНЧ, вводимых беременным самкам, была построена корреляционная кривая (рис. 17) и проведен дисперсионный анализ.
Результаты дисперсионного анализа указывают на то, что различия в концентрации ЗНЧ в тканях плода в зависимости от размера частиц статистически достоверны (F=18,1811, p 0,00002). При проведении попарного сравнения (Bonferroni test) выявлены статистически достоверные различия в концентрации ЗНЧ в тканях плода между частицами диаметром 30, 50 и 150 нм.
Учитывая полученные результаты, для последующего проведения регрессионного анализа были использованы данные концентрации ЗНЧ в тканях плода с диаметрами 30, 50 и 150 нм (рис. 18).
Построенная модель адекватно описывает взаимосвязь размера золотых наночастиц, вводимых беременным самкам, с их проницаемостью через гематоплацентарный барьер и, обусловленную этим, концентрацию ЗНЧ в тканях плода. Прогностическое значение влияния диаметра ЗНЧ на их концентрацию в плодах является высокозначимым (b=-0,677969, p=0,005474).
Построенное уравнение регрессии имеет вид:
Y= 6,2243 - 0,0383 X,
где Y – концентрация золота в тканях плода (нг/г), Х - диаметр вводимых ЗНЧ (нм) от 30 до 150 нм. Данное уравнение с точностью до 95% моделирует проницаемость ЗНЧ с диаметром от 30 до 150 нм через гематоплацентарный барьер хориального типа.
Применение метода автометаллографии позволило нам оценить основные органы накопления ЗНЧ в плодах – таковыми являются их печень и селезенка (рис. 19-20). Золото не определяется в костном мозге, крови, почках, легких, головном мозге плодов, полученных от животных, которым вводили растворы ЗНЧ диаметрами 5-50 нм.
Печень плодов крысы на 16-е сутки пренатального развития через сутки после внутривенного введения самкам физиологического раствора. Метод автометаллографии 0,2 % азотнокислым серебром с докраской гематоксилином; хЮОО. Рис. 20. Печень плодов крысы на 16-е сутки пренатального развития через сутки после внутривенного введения самкам суспензии ЗНЧ диаметром 5 нм: 1 - частицы золота в цитоплазме макрофагов. Метод автометаллографии 0,2 % азотнокислым серебром с докраской гематоксилином; 1000.
Для установления морфологических реакций структур гематоплацентарного барьера было проведено морфологическое изучение плаценты. Установлено, что массы последов животных, подвергшихся введению суспензии ЗНЧ и физиологического раствора, не имеют статистически значимых различий в сравнении с таковой животных контрольной группы (р 0,05, табл. 3). Плацента всех групп экспериментальных животных характеризуется типичным планом строения, свойственным гемохориальной плаценте белой крысы (рис. 21-23). Рис. 21. Лабиринтная зона плаценты белой крысы интактной группы на 16-е сутки беременности. Окраска гематоксилином и эозином; хбОО.
Лабиринт, представляющий собой собственно гематоплацентарный барьер, образован трофобластическими балками, которые омываются материнской кровью со стороны лакун, внутри балок проходят плодные сосуды. Лабиринтная зона плацент животных всех экспериментальных групп соответствует гестационному сроку и полностью дифференцированна. Лабиринтные балки, имея трехслойное строение, представлены двумя эпителиальными слоями и одним слоем трофобласта. Трофобластические балки всех групп экспериментальных животных хорошо васкуляризованы, бессосудистые балки отмечены не были. Для животных интактной группы характерны умеренно расширенные материнские лакуны, более полнокровные по сравнению с плодными сосудами. В плацентах всех групп животных отсутствуют фибриноиды и кальцифицаты.
Внутривенное введение суспензии ЗНЧ обусловливает увеличение относительной площади материнских лакун по сравнению с таковой животных интактной группы (р0,05). Вероятно, данный факт можно объяснить введением в кровоток животных дополнительного объема жидкости. На это указывает отсутствие достоверных различий между значениями относительной площади материнских лакун животных, которым внутривенно вводили ЗНЧ, и животных, подвергшихся введению физиологического раствора такого же объема (табл. 3).
Физические способы усиления проницаемости здоровой кожи для золотых наночастиц
Простое нанесение геля с ЗНЧ доказало неэффективность доставки нанооболочек в здоровую кожу за счет пассивного транспорта путем диффузии. Для преодоления рогового слоя эпидермиса были использованы такие физические методы усиления проницаемости кожи как, предварительная лазерная абляция кожи и обработка ультразвуком.
При дополнительном воздействии на здоровую кожу УЗ (3 группа животных) эпидермис сохраняет свое нормальное строение. Дерма представлена волокнами, расположенными более рыхло, что свидетельствует о ее незначительном отеке. Сосуды на границе дермы и подкожной мускулатуры полнокровны, расширены. Определяется незначительная периваскулярная инфильтрация лимфоцитами и макрофагами. В подкожной мускулатуре и по ходу сосудов определяются тучные клетки с разной степенью дегрануляции (рис. 53). Коэффициент дегрануляции повышается до 0,64±0,07 в сравнении с интактной кожей, что также свидетельствует о формировании воспалительной реакции в коже.
Результаты проведенного эксперимента свидетельствуют о том, что УЗ не способствует повышению проницаемости ЗНЧ через неповрежеднный роговой слой эпидермиса. Применение метода автометаллографии нитратом серебра демонстрирует расположение золотых нанооболочек на поверхности кожи. При этом не происходит проникновения наночастиц вглубь дермы.
Анализ ОКТ изображений участков кожи 3-ей экспериментальной группы показывает, что, как и у животных 2-ой группы, усиления контраста внутренних структур кожи за счет присутствия наночастиц не наблюдается (рис. 54), поскольку частицы в основном остаются на поверхности кожи, не проникая в более глубокие слои. Таким образом, ультрафонофорез не способствует повышению проникающей способности золотых нанооболочек через роговой слой здоровой кожи.
Для возможного повышения степени проницаемости кожи для золотых нанооболочек предварительно была проведена перфорация кожи с помощью частичной лазерной абляции (4 группа). В результате воздействия лазером на коже образовывались микроотверстия в виде конусов, глубина которых в среднем составила 0,15 мм, а объем – порядка 0,310-3 мм3 (рис. 55).
Гистологический анализ кожи показал, что в результате лазерной абляции возникают конусные микроотверстия, расположенные через равномерные промежутки и ограниченные участками некроза, которые затрагивают эпидермис и сосочковый слой дермы. Коллагеновые волокна сетчатого слоя дермы сохранены, имеют характерную для них структуру. Сосуды всех калибров полнокровны, наблюдается эритростаз с присутствием клеток лимфоцитарного ряда. Коэффициент дегрануляции тканевых базофилов составил 0,59±0,03, не отличаясь от такового интактной кожи.
Предварительная лазерная абляция способствует преодолению ЗНЧ эпидермиса, на что указывают данные микроскопического анализа препаратов кожи и ОКТ. Глубина расположения нанооболочек составляет 45,8±3,4 мкм (табл. 8), что соответствует верхним слоям дермы.
Примечательно, что сами частицы, не распределяясь равномерно в дерме, располагаются скоплениями в области микропор, образовавшихся в результате лазерного воздействия (рис. 56). Базофилы обнаруживаются в соединительной ткани дермы обособленно, редко в виде небольших групп, коэффициент их дегрануляции составляет 0,59±0,07 (р 0,05).
Кожа после предварительной лазерной абляции ЗНЧ (4 группа) 45,8±3,4 ЗНЧ и УЗВ (5 группа) 47,4±6,2 Примечание: - статистически значимые различия в соответствующих показателях для неповрежденной кожи (p 0,05).
Одновременное воздействие УЗ и лазером (5 группа) для повышения проницаемости кожи для ЗНЧ также обусловливает наличие участков некроза эпидермиса, образовавшихся в результате предварительной перфорации. В этих участках эпидермис и прилежащие коллагеновые волокна дермы разрушены. Капилляры поверхностного слоя дермы расширены, нерезко полнокровны. Коллагеновые волокна окрашены по большей части равномерно, в светло-розовый цвет. Миосимпласты отечны. Ядра мышечных волокон сохранены. Характерно периваскулярное расположение дегранулированных форм, коэффициент дегрануляции составил 0,62±0,09.
Таким образом, проведенный микроскопический анализ свидетельствует о том, что структура кожи крыс, подвергшихся предварительной лазерной абляции с последующим нанесением ЗНЧ (4 группа), мало отличается от кожи животных, подвергшихся предварительной лазерной абляции с последующими нанесением ЗНЧ и обработкой УЗ (5 группа). Вероятно, вызванные морфологические изменения обусловлены указанными выше физическими воздействиями на кожу, а не ЗНЧ.
Использование метода автометаллографии на гистологических срезах кожи животных, подвергшихся предварительной лазерной абляции и ультрофонофорезу, позволило определить диффузную локализацию золотых нанооболочек вокруг микропор. Более равномерное распределение ЗНЧ, вероятно, обусловлено дополнительной ультразвуковой обработкой перфорированной кожи. Эти зоны затрагивают сосочковый слой дермы. В то же время, в области микроперфораций сохраняются скопления ЗНЧ.
На ОКТ изображениях кожи животных 5 экспериментальной группы (рис. 57А и Б) четко определяются микроотверстия, образовавшиеся в результате лазерной перфорации. Анализ ОКТ изображений свидетельствует о более результативном проникновении нанооболочек в дерму и их накоплении там за счет использования таких физических агентов для усиления проницаемости, как частичная лазерная абляция и ультрафонофорез.
Токсичность золотых наночастиц для опухолевых клеток в различные периоды клеточного цикла in vitro
Эксперимент проведен на клеточной линии карциномы толстого кишечника (HCT-116). Согласно имеющимся литературным данным, наночастицы золота диаметром 10 нм in vitro обнаруживаются в эндосомах клеток уже через 5 минут после их добавления в культуру (Рябчикова Е.И. и др., 2011).
Изучение уровня флуоресценции клеток с ЗНЧ (наночастицы золота обладают собственной флуоресценцией) свидетельствует об их присутствии в клетках, на что указывают его положительные значения. Флуоресценция интактных клеток при всех прочих равных условиях отсутствовала (табл. 14).
Обращает внимание тот факт, что максимальная интенсивность поглощения ЗНЧ клетками с интенсивным метаболизмом, которыми являются опухолевые клетки, характерна для митоза, на что указывают наибольшие значения флуоресценции клеток.
Функциональную активность митохондрий изучали с помощью флуоресцентного зонда TMRE, способного избирательно накапливаться в функционально активных митохондриях с высокими значениями трансмембранныого потенциала. Флуоресценция зонда TMRE интактных опухолевых клеток HCT-116 на протяжении всего клеточного цикла характеризуется постепенным снижением. Клеткам в интерфазе свойственно медленное достоверное (p 0,05) уменьшение значений уровня флуоресценции с 73,89±3,39 у.е. в пресинтетическом периоде до 60,94±4,34 у.е. в постсинтетическом периоде (рис. 84).
Своего минимального значения уровень флуоресценции зонда TMRE достигает в митотический период, снижаясь более, чем в 1,5 раза. Известно, что вследствие изменения метаболической активности клетки изменяется и митохондриальный потенциал в норме. Снижение уровня флуоресценции TMRE указывает на временное уменьшение АТФ-синтетической функции митохондрий в течение всего клеточного цикла и, особенно, во время митоза.
Содержание активных форм кислорода (АФК) оценивали по уровню флуоресценции зонда DCFH-DA, который взаимодействует с АФК.
Интактные опухолевые клетки HCT-116 в интерфазе характеризуются достоверным увеличением уровня флуоресценции DCFH-DA, что свидетельствует об усиленной продукции АФК, которые регулируют ряд биологических процессов в клетках, таких как пролиферация и последующая дифференцировка клеток. В митотический период концентрация активных форм кислорода резко снижается, на что указывает 5-кратное уменьшение уровня флуоресценции зонда DCFH-DA в опухолевых клетках в сравнении с таковым в постсинтетическом периоде.
Вероятно, снижение внутриклеточной концентрации АФК происходит за счет уменьшения объемов их образования, а также посредством нейтрализации.
Получасовая инкубация клеток HCT-116 с наночастицами золота не приводит к их значительным метаболическим изменениям, на что указывает отсутствие статистически значимых различий в показателях уровня флуоресценции TMRE между интактными клетками и клетками, подвергшихся воздействию ЗНЧ в пресинтетический (G1), синтетический (S) и митотический (M) периоды клеточного цикла. В интактных и опытных клетках в указанные периоды определяется интенсивная флуоресценция зонда (рис. 47), что свидетельствует о наличие функционально активных митохондрий, работа которых адекватно обеспечивает энергоснабжение этих клеток. Клетки, подвергшиеся влиянию наночастиц золота, в постсинтетическом периоде (G2) характеризуются значимым увеличением митохондриального потенциала, на что указывает увеличение интенсивности уровня флуоресценции на 20% (p 0,05). Данный факт может быть связан с ростом или делением митохондрий в постсинтетический период, и свидетельствует о повышении АТФ-синтетической функции митохондрий перед митозом.
Инкубация культуры клеток с ЗНЧ в течение часа также не приводит к функциональному изменению митохондрий клеток, находящихся в пресинтетическом (G1), синтетическом (S) и митотическом (M) периодах клеточного цикла. Об этом свидетельствует отсутствие значимых различий в уровне флуоресценции интактных клеток и клеток с наночастицами. Снижение интенсивности флуоресценции зонда TMRE (p 0,05) в постсинтетический период (G2) по сравнению с интактными клетками указывает на снижение АТФ-продуцирующей функции митохондрий в данный период или их повреждении.
Опухолевые клетки HCT-116 при получасовом нахождении в культуре золотых наночастиц характеризуются значимым снижением интенсивности флуоресценции DCFH-DA с 182,68±10,85 у.е. в постсинтетическом периоде (G2) до 97,77±51,43 у.е. в период митоза (М) (p 0,05). Обращает внимание тот факт, что содержание АФК в клетках в присутствии ЗНЧ в пресинтетическом (G1) и синтетическом (S) периодах интерфазы соответствует таковым значениям, свойственных контрольной группе. На это указывает отсутствие статистически значимых отличий (p 0,05) в уровне флуоресценции в эти периоды между интактными клетками и клетками с ЗНЧ. Постсинтетический период (G2) опухолевых клеток после 30-минутной инкубации с ЗНЧ характеризуется меньшими значениями уровня флуоресценции зонда DCFH-DA, по сравнению с таковыми интактных клеток. Данный факт указывает на снижение продукции АФК в течение постсинтетического периода клеток с ЗНЧ, а также об усилении процессов удаления реакционно-активного кислорода внутриклеточными антиоксидантными ферментами (пероксидредуктаза, глутатионтрансфераза, супероксиддисмутаза и пр.).
Митотически делящиеся клетки, подвергшиеся воздействию золотых наночастиц в течение 30 минут, характеризуются большей концентрацией АФК по сравнению с таковой интаткных клеток – уровень флуоресценции DCFH-DA в клетках с наночастицами в 1,7 раза выше, чем в контрольной клеточной культуре. Обращает внимание тот факт, что клетки с ЗНЧ, находящиеся в митотическом периоде, отличаются уменьшением в 2 раза интенсивности флуоресценции DCFH-DA по сравнению с предшествующим постсинтетическим периодом (G2).
Инкубация опухолевых клеток HCT-116 с ЗНЧ в течение часа обусловливает снижение образования в этих клетках АФК в 3 раза. На это указывают меньшие значения уровня флуоресценции зонда DCFH-DA в интерфазу клеток, подвергшихся 60-минутному воздействию ЗНЧ, в сравнении с интактными клетками и клетками, которые культивировались с ЗНЧ 30 минут (p 0,05). Обращает внимание тот факт, что митотический период клеток, подвергшихся часовому влиянию ЗНЧ, отличается почти трехкратным увеличением уровня флуоресценции по сравнению с таковым клеток контрольной группы и полуторократным с клетками, которые подверглись получасовому воздействию ЗНЧ. При этом интенсивность флуоресценции клеток с золотыми наночастицами в митотический период не достигает максимальных значений уровня флуоресценции, свойственных интактным клеткам в интерфазе.
Таким образом, 30- и 60-минутное воздействие ЗНЧ на культуру опухолевых клеток HCT-116 in vitro не приводит к развитию оксидативного стресса клеток в интерфазе и не обусловливает нарушений АТФ-синтезирующей функции митохондрий. Об этом свидетельствуют меньшая концентрация АФК в пресинтетическом (G1), синтетическом (S) и постсинтетическом (G2) периодах клеточного цикла, а также отсутствие значимого снижения мембранного потенциала митохондрий в клетках с ЗНЧ. Рост концентрации АФК в митотический период в клетках с ЗНЧ указывает на интенсификацию окислительных процессов в клетках, и снижение скорости утилизации АФК.