Введение к работе
Актуальность темы исследования. Современное направление развития молекулярной генетики в области разведения сельскохозяйственных животных и сохранения их генетического разнообразия включает полное секвенирование геномов и исследование отдельных полиморфных локусов ДНК, доступных для анализа [Зиновьева, 2008; Столповский, 2010]. Информация по генетическому разнообразию необходима для выявления и использования генетических ресурсов популяций, имеющих разное генетическое происхождение, и, возможно, уникальное сочетание генов и аллелей, обуславливающих их продуктивные, воспроизводительные и адаптивные признаки [Алтухов, 2003]. Селекция по признакам продуктивности в ряде случаев приводит к снижению генетической изменчивости и, как следствие, к ухудшению воспроизводительных и адаптивных способностей животных [Костомахин, 2007; Петухов, 2007]. Эффективным подходом контроля генетического разнообразия является использование молекулярно-генетических маркеров [Эрнст, 2008].
Идентификация значимых генов, их влияние на проявление желательных фенотипических характеристик важны для оценки микроэволюционных процессов и разработки стратегии селекционной работы с породами [Смарагдов, 2005]. Метод маркер-вспомогательного отбора (MAS-селекция) позволяет на ранней стадии онтогенеза прогнозировать продуктивные качества животного. Результаты исследования генов, возможно, плейотропных, сцепленных или непосредственно входящих в комплекс локусов количественных признаков (QTL), можно использовать в селекции вместе с другими маркерами.
К числу перспективных локусов у крупного рогатого скота относят гены семейства фактора некроза опухоли. Ген фактора некроза опухоли альфа (TNF-) кодирует многофункциональный цитокин, продуцируемый клетками иммунной системы, эпителиальными и эндотелиальными клетками. Биологический эффект этого цитокина проявляется через связывание со специфическими рецепторами (TNFR1 и TNFR2).
Цитокин индуцирует воспалительный процесс, стимулируя синтез других цитокинов и простагландинов, выступает фактором активации и
4 пролиферации клеток крови. Кроме того, фактор некроза опухоли альфа обладает противомикробной и противовирусной цитотоксической активностью, индуцирует апоптоз клеток [Кевра, 1995]. Благодаря своим разным биологическим эффектам этот цитокин оказывает влияние на репродуктивные функции и липидный обмен животных.
Исследования последних лет свидетельствуют о недостаточной изученности генетического разнообразия по генам фактора некроза опухоли и его рецептора в породах крупного рогатого скота, особенно отечественной селекции, а также их участии в формировании многих продуктивных признаков у животных.
Степень разработанности темы. Полиморфизм генов семейства фактора некроза опухоли у крупного рогатого скота изучается отечественными и зарубежными исследователями в первую очередь в связи с иммуностимулирующей функцией цитокина [Konnai et al., 2006; Булгакова, 2013]. Показано, что однонуклеотидная замена А на G гена TNF- в позиции 824 приводит к снижению экспрессии мРНК в лейкоцитах коровы, при этом данный полиморфизм влияет на прогрессирование лимфомы при BLV-инфекции [Konnai et al., 2006]. Полиморфизм этого гена также связан с устойчивостью скота к туберкулезу и маститу [Cheng et al., 2016; Ranjan et al., 2015]. Имеются данные о роли TNF- в функционировании репродуктивной системы сельскохозяйственных животных. Были показаны ассоциации однонуклеотидных полиморфизмов в промоторе и экзоне гена TNF- с наступлением первой овуляции после отела у высокопродуктивных коров [Shirasuna et al., 2011]. Выявлена связь генотипа по TNF- с перинатальной смертностью телят [Петухов и др., 2015; Hansen et al., 2004; Soto et al., 2003]. Показано влияние TNF- на продуктивные признаки крупного рогатого скота черно-пестрой и красной степной пород [Yudin et al., 2013; Люханов и др., 2014].
Цель и задачи исследования. Целью исследования являются изучение генетического разнообразия крупного рогатого скота красной степной, симментальской и голштинской пород по аллелям, генотипам и различным генотипическим комбинациям полиморфных локусов фактора некроза опухоли альфа (TNF- A/G и С/T) и его рецептора (TNFR1 T/С) и оценка прогностического значения полиморфизма этих генов для продуктивности животных.
5 В задачи исследования входило:
Установить частоту встречаемости аллельных вариантов генов TNF- и TNFR1 и генотипическую структуру выборочных популяций крупного рогатого скота.
Исследовать различные меж- и внутрилокусные комбинации по генотипам TNF- и TNFR1 в трех породах.
Оценить межпородную дифференциацию по частотам встречаемости аллелей, отдельных генотипов и их комбинаций.
Изучить влияние полиморфизма генов TNF- и TNFR1 на молочную продуктивность, воспроизводство, рост и развитие, биохимический состав крови крупного рогатого скота разной породной принадлежности.
Научная новизна работы. Впервые установлены особенности генетической структуры популяций крупного рогатого скота симментальской и голштинской пород по однонуклеотидным заменам в промоторной области гена фактора некроза опухоли альфа (TNF- A/G и С/Т) и в экзоне гена рецептора (TNFR1 Т/С). Выявлен высокий уровень дифференциации и межпородных различий по генотипам и разным межлокусным и внутрилокусным комбинациям. Определены популяционно-генетические параметры изменчивости по изучаемым локусам. Впервые показана ассоциация отдельных генотипов по однонуклеотидным полиморфизмам генов TNF- и TNFR1 с уровнем молочной продуктивности, воспроизводительными качествами, ростом и развитием животных.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученная в ходе исследования информация по генетическому разнообразию важна для оптимизации стратегий сохранения и использования генетических ресурсов сельскохозяйственных животных, а также при оценке возможных генетических изменений структуры популяций в условиях интенсивной селекции по продуктивности. Сравнительная породная оценка полиморфизма генов фактора некроза опухоли альфа и его рецептора, а также анализ ассоциаций генотипов с продуктивными качествами коров позволяет расширить наши представления о фенотипической аннотации генома крупного рогатого скота с учетом породной уникальности и продуктивности. Полученные данные послужат основой для генетического мониторинга популяций крупного рогатого скота Западной Сибири. Выявление
6 предпочтительных с точки зрения селекции генотипов позволит дополнительно к традиционным методам отбора и подбора животных повысить эффективность племенной работы в исследуемых стадах. Результаты исследований используются в учебном процессе по направлениям подготовки Зоотехния и Биология в ФГОУ ВО Новосибирский ГАУ.
Методология и методы исследования. Исследовали выборки коров красной степной (n = 148), симментальской (n = 149) и голштинской пород (n = 100), разводимых в хозяйствах Алтайского края и Новосибирской области. Объектами исследования стали гены фактора некроза опухоли альфа (TNF-) и его рецептора (TNFR1). Предметами исследования являлись замены нуклеотида A на G в позиции 824 (rs109245511), С на Т в позиции 793 (rs109111281) промоторной области гена TNF- и замена T на C в позиции 1704 мРНК (U90937), соответствующая замене А на G (rs43103242) по цепи ДНК, гена TNFR1. Геномную ДНК выделяли из цельной крови стандартным методом протеолитической обработки с последующей экстракцией фенол-хлороформом. Полиморфизмы генов изучали методом ПЦР-ПДРФ анализа с электрофоретической детекцией. Показатели хозяйственно полезных признаков были получены на основе данных зоотехнического учета. Биохимический анализ крови проводили на анализаторе Stat Fax 3300. Данные обрабатывали с помощью вариационной, популяционной статистики и дисперсионного анализа.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Распределение генотипов, частоты аллелей, наблюдаемая
гетерозиготность и уровень значимости соответствия равновесию Харди-
Вайнберга свидетельствуют о различной степени генетического разнообразия
в исследуемых популяциях красной степной, симментальской и голштинской
пород по полиморфным локусам TNF- (A/G и С/Т) и TNFR1 (Т/С).
2. Ассоциации отдельных генотипов по TNF- (A/G и С/Т) и TNFR1
(Т/С) с хозяйственно полезными признаками животных, обусловленные
генетическими особенностями конкретных популяций, указывают на
вовлеченность полиморфизма в проявление некоторых показателей.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждается использованием современных молекулярно-генетических методов исследования на достаточном количестве
7 фактического материала, всесторонней статистической обработкой полученных данных. Результаты исследований представлены и обсуждены на научных конференциях: 53-й Международной научной студенческой конференции «МНСК-2015» (Новосибирск, 2015), 54-й Международной научной студенческой конференции «МНСК-2016» (Новосибирск, 2016), 67-ой Международной научно-практической конференции «Инновационные подходы к развитию агропромышленного комплекса региона» (Рязань, 2016), Международной научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Инновационные технологии и технические средства для АПК» (Воронеж, 2016). По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 5 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, и 1 статья в журнале, индексируемом в базе Scopus.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 119 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 43 таблицами, 4 рисунками, включает 214 литературных источников, 95 из которых иностранных авторов.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность научному руководителю, доктору биологических наук, профессору Николаю Николаевичу Кочневу за оказанную помощь на всех этапах работы и при подготовке диссертации, а также кандидату биологических наук, заведующему лабораторией молекулярной генетики и селекции сельскохозяйственных животных ФНЦ «Институт цитологии и генетики СО РАН» Николаю Серафимовичу Юдину и кандидату биологических наук, научному сотруднику этой лаборатории Руслану Бейшеналиевичу Айтназарову за помощь в проведении исследований. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 13-04-00968-а), Экспедиционного гранта СО РАН и ФАНО России (проекты №0324-2015-0004 и № 0324-2016-0002).