Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .13
1.1 Физическая нагрузка и ее влияние на организм человека и животных .13
1.2 Морфология скелетной мышечной ткани .20
1.3 Влияние физической нагрузки на скелетную мышечную ткань 25
1.4 Обзор и классификация лекарственных средств, применяемых в спортивной медицине 27
1.5 Характеристика L-карнитина 33
Глава 2. Материалы и методы 49
2.1 Характеристика подопытных животных .49
2.2 Моделирование физической нагрузки .49
2.3 Морфологические методы исследования 53
2.4 Характеристика исследуемых соединений .60
2.5 Методы статистической обработки полученных данных 61
Глава 3. Результаты собственных исследований 62
3.1 Исследование влияния препаратов метаболического типа действия на показатели физической выносливости животных при статической и динамической физической нагрузке 62
3.2 Влияние статической и динамической физической нагрузки на гематологические показатели крови и конформационные свойства гемопорфирина гемоглобина эритроцитов .65
3.3 Исследование морфологии скелетных мышц 74
Обсуждение полученных результатов .113
Выводы 122
Список литературы .124
- Физическая нагрузка и ее влияние на организм человека и животных
- Характеристика L-карнитина
- Влияние статической и динамической физической нагрузки на гематологические показатели крови и конформационные свойства гемопорфирина гемоглобина эритроцитов
- Исследование морфологии скелетных мышц
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Одним из актуальных направлений
современной морфологии является изучение адаптации клеток, тканей и
органов, к изменениям режима функционирования, в том числе при
воздействии различных гуморальных факторов. Важнейшим звеном этого
раздела морфологии является исследование адаптивных
морфофункциональных изменений скелетной мышечной ткани в условиях
интенсивных физических нагрузок и действия разнообразных биологически
активных веществ и др., 2007; Стернин Ю. И. и др., 2008;
Parker B. A. et al., 2013). Результаты этих исследований, кроме своего
фундаментального общебиологического значения, являются актуальными, для
современного животноводства и, безусловно, окажутся полезными для запросов
медицины. Изучение этих процессов в скелетных мышцах необходимо для
научного обоснования оптимизации условий производства продукции мясного
животноводства и такие исследования полностью согласуются с
Государственной программой развития сельского хозяйства и регулирования
рынков сельскохозяйственной продукции, сырья и продовольствия на 2013-
2020 гг. (). Кроме того,
исследование механизмов адаптации скелетных мышц к различным видам
физической нагрузки позволит использовать полученные данные для
разработки подходов оптимизации тренировочного процесса в
профессиональном спорте и для лечения различных видов патологии мышечной системы (Морозов В. И. и др., 2006; Гридин Л. А. и др., 2007; Минигалин А. Д. и др., 2015; Leblanc P. J. et al., 2004).
Скелетные мышцы составляют гетерогенную популяцию и среди них различают быстрые и медленные мышцы, а в них, в свою очередь, быстрые и медленные мышечные волокна, различающиеся между собой силой и скоростью сокращения, а также устойчивостью к утомлению (Платонов В.Н., 2004; Ковригина Т. Р., Филимонов В. И., 2010; Schiaffino S., Reggiani C., 2011). Ранее было показано, что на одни и те же воздействия быстрые и медленные скелетные мышцы и мышечные волокна могут отвечать совершенно по-разному, а в некоторых случаях и противоположным образом (Murtona A. J., Greenhaffb P. L., 2013).
Работа скелетных мышц находится под постоянным контролем со стороны нервной и гуморальной систем организма, но, морфофункциональные характеристики скелетных мышц существенно зависят и от уровня их функциональной активности (Валиуллин В. В., Дзамуков Р. А., 1999).
Применительно к спортивной медицине, тренировочная и
соревновательная деятельность спортсменов, опосредованная интенсивными физическими нагрузками, вызывает значительные изменения в различных функциональных системах организма (Платонов В. Н., 2004; Роженцов В. В., Полевщиков М. М., 2006; Мирошников С. В. и др., 2012; Воронков А. В. и др., 2013). Истощающие физические нагрузки, используемые в профессиональном
спорте, сопровождаются перенапряжением, разнообразными метаболическими
нарушениями, появлением в крови специфических маркеров повреждения
мышц, активацией образования свободных радикалов, ослаблением
антиоксидантной защиты организма (Платонов В. Н., 2010; Корнякова В. В. и др., 2012; Воронков А. В. и др., 2012, 2013). Такой комплекс нарушений обладает прямым повреждающим действием на клетки, ткани и органы, и, безусловно, во многих случаях является фактором травматизации.
При интенсивной мышечной деятельности остро встает проблема обеспечения, функционирующих мышечных волокон кислородом. Поэтому любые исследования по изменению биохимических процессов, связанных с обменом гемоглобина в условиях интенсивной мышечной деятельности окажутся очень ценными для понимания механизмов адаптации скелетных мышц при изменении режима функционирования.
Несмотря на очевидную актуальность проблемы функционирования скелетной мышцы при различных режимах двигательной активности, экспериментальных работ, посвященных исследованию скелетных мышц различных фенотипов при статической и динамической физической нагрузках и коррекции негативных последствий таких воздействий с помощью биологически активных веществ (Багметова В. В. и др., 2012; Хабибуллин И. М., 2017) явно не достаточно.
Среди многочисленных препаратов, являющихся перспективными в качестве корректоров мышечных дефектов одним из привлекающих внимание является левовращающий изомер карнитина (L-карнитин). Его биологические эффекты весьма разнообразны. L-карнитин обладает кардиопротекторными (Копелевич В. М., 2005; Czeczot H., Scibior D., 2005), гепатопротекторными (Яковлева Л. В. и др., 2011; Губергриц Н. Б. и др., 2012), нефропротекторными (Мондоев Л. Г. и др., 2007, 2009; Yang S. K. et al., 2014), нейропротекторными свойствами (Студеникин В. М. и др., 2011; et al., 2014), оказывает антиоксидпнтное и антигипоксическое действие (Яковлева Л. В. и др., 2011). Предполагается, что перечисленные свойства препарата реализуются через стимуляцию -окисления жирных кислот в митохондриях, что обеспечивает оптимизацию энергообмена во всех клетках (Спасов А. А., Иежица И. Н., 2005; Титов В. Н., 2012). Вместе с тем практически не исследовано действие L-карнитина на скелетные мышцы разнообразных фенотипов при различных режимах функционирования. Более того, практически ничего не известно о внутриклеточных механизмах воздействия L-карнитина на различные стороны функционирования клеток, что можно было бы исследовать, например, на стандартных клеточных линиях, в качестве, которых в последнее время активно используются мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки. Результаты таких цитологических исследований действия этого препарата были бы полезны при разработке схем использования L-карнитина в ветеринарии и спортивной медицине.
Степень разработанности темы. Основные закономерности адаптации мышечной ткани к интенсивной физической нагрузке хорошо изучены и
представлены в классических фундаментальных трудах (Резвяков Н. П. и др., 1980; Волков Н. И., 2001; Coffey V. G., Hawley J. A., 2007; Egan B., Zierath J. R., 2013; Sun Y., Ding S. Z., 2014). Однако авторы этих исследований, как правило, не учитывали гетерогенность мышц по составу мышечных волокон. Кроме того, остается малоисследованной эффективность использования спортсменами и последствия применения недопинговых фармакологических средств, пищевых добавок, в том числе L-карнитина применительно к скелетным мышцам. Следует отметить, что в научной литературе, также присутствуют данные о высокой стресспротекторной активности препарата (Сейфулла Р. Д., Орджоникидзе З. Г., 2003; Балыкова Л. А. и др., 2011, 2014, 2016; Рылова Н. В. и др., 2014; Karlic H., Lohninger A., 2004; Dutta A. et al., 2008), что делает его привлекательным для спортсменов. Однако, как уже отмечалось выше, его эффективность в качестве корректора деструктивных изменений скелетной мышечной ткани, вызванных интенсивной физической нагрузкой, не исследована.
Цель и задачи исследования: Целью работы явилось изучение структурных характеристик медленной камбаловидной и быстрой подошвенной мышц лабораторных грызунов, в комплексе с гематологическими показателями в условиях интенсивной физической нагрузки и действии L-карнитина.
В соответствии с целью настоящей работы были поставлены следующие задачи:
-
Изучение выносливости крыс, гематологических показателей и конформационных состояний гемопорфирина гемоглобина у мышей при моделировании статической и динамической физических нагрузок и введении L-карнитина, карнитина хлорида и креатинфосфата.
-
Исследовать сукцинатдегидрогеназную и АТФ-азную активности мышечных волокон в составе быстрой и медленной скелетных мышц крыс при динамической физической нагрузке и действии L-карнитина и креатинфосфата.
3. Изучить ультраструктуру камбаловидной и подошвенной мышц крыс
при динамической физической нагрузке и действии L-карнитина.
4. Оценить влияние L-карнитина на метаболическую активность
мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в МТТ-тесте.
Научная новизна. Впервые показано, что в условиях статической физической нагрузки введение карнитина хлорида (50,0 мг/кг), креатинфосфата (100,0 мг/кг) и L-карнитина (50,0 и 100,0 мг/кг) не оказывали влияния на динамику показателей выносливости мышей. Новыми следует признать данные о том, что при динамической физической нагрузке L-карнитин (особенно в дозе 100,0 мг/кг), в отличие от референтных препаратов, проявил стабильный стимулирующий эффект на длительность плавания мышей.
Приоритетными являются сведения о том, что выбранные нами модели статической и динамической нагрузки у мышей не вызывают резких отклонений гематологических показателей, но сопровождаются некоторым изменением лиганд-связывающих свойств гемопорфирина гемоглобина.
Большинство этих отклонений при физической нагрузке успешно
компенсируются L-карнитином и препаратами сравнения.
Безусловной новизной обладают результаты морфометрического анализа
гистологических препаратов свидетельствующие о том, что динамическая
физическая нагрузка способствует гипертрофии мышечных волокон в
камбаловидной и подошвенной мышцах крыс, тогда как L-карнитин и
креатинфосфат не оказывают влияния на этот процесс. В работе впервые
определена совокупность деструктивных изменений ультраструктуры
мышечных волокон камбаловидной и подошвенной мышц в условиях динамической физической нагрузки, которые заключаются в инвагинациях ядерных оболочек, разволокнении и разрывах миофибрилл, деструкции митохондриальных крист с просветлением матрикса, расширении канальцев и цистерн саркоплазматического ретикулума, а также появлении зон внутриклеточного отека. Приоритетными следует признать сведения о том, что у крыс, получавших L-карнитин (100,0 мг/кг), в ультраструктуре скелетной мышечной ткани деструктивные изменения наблюдались реже и степень их выраженности была меньше, чем у животных контрольной группы.
На культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток впервые показана способность L-карнитина поддерживать их метаболическую активность в условиях атипического культивирования, моделирующего ацидоз и алкалоз.
Теоретическая и практическая ценность работы. Полученные нами
новые данные о морфофункциональных особенностях скелетных мышц
различных фенотипов при моделировании интенсивной физической нагрузки и
фармакологической коррекции представляют теоретический и практический
интерес для специалистов в области спортивной медицины, фармакологии,
гистологии, клеточной биологии и других медико-биологических наук.
Доказано отсутствие у L-карнитина фармакологических свойств,
обусловливающих принадлежность к допинговым средствам, что позволяет использовать этот препарат для коррекции нарушений, вызванных избыточной мышечной деятельностью. Кроме того некоторые свойства L-карнитина позволяют его использование в ветеринарии.
Материалы, методология и методы исследования. Работа выполнена в соответствии с внутривузовскими программами «Медицинские основы жизнедеятельности организма в норме, патологии и в эксперименте» (регистрационный номер 01201252293 от 10.02.2012 г.) и «Новые материалы. Фундаментальные и прикладные исследования лекарственных препаратов, соединений и биологически активных веществ» (регистрационный номер 01201252292 от 22.02.2012 г.). Работа выполнена на лабораторных грызунах (мыши, крысы) и культуре мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Объектом исследования служили камбаловидная и подошвенная мышцы крыс и периферическая кровь мышей. Исследования, анализ и обработка материала выполнены в ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва» на базе кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсами медицинской
биологии и молекулярной биологии клетки. Отдельные разделы исследования нами выполнены на базе кафедры биологии ФГБОУ ВО Кировского ГМУ Минздрава России и лаборатории молекулярных основ патогенеза КИББ ФИЦ КазНЦ РАН. Эксперименты проведены при соблюдении всех необходимых требований по гуманному обращению с животными в соответствии с решением Локального этического комитета Медицинского института ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва» (протокол № 44 от 18.11.2016 г.).
В работе использован комплексный подход, включающий объективные методы исследования: гистологические, гистохимические, электронно-микроскопические, МТТ-тест на культуре мезенхимальных стволовых клеток. Оценены гематологические показатели крови животных. Применен метод спектроскопии комбинационного рассеяния.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. L-карнитин является эффективным стимулятором выносливости
при динамической нагрузке, не проявляет анаболических свойств, но
уменьшает выраженность опосредованных интенсивной нагрузкой:
инвагинаций нуклеолеммы, разволокнений и разрывов миофибрилл,
деструкции митохондриальных крист с просветлением матрикса, расширения канальцев и цистерн саркоплазматического ретикулума, интенсивности внутриклеточного отека в миосимпласте.
Степень достоверности и апробация результатов. Научные выводы и практические предложения теоретически обоснованы и подтверждаются фактическими данными. Достоверность проведенных исследований основана на том, что все гистологические, морфометрические, гистохимические, ультрамикроскопические данные получены с использованием объективных методов на сертифицированном оборудовании с последующей статистической обработкой.
Основные материалы диссертации были представлены и обсуждены на: II
Международной научно-практической конференции «Современная биология:
актуальные вопросы» (Санкт-Петербург, 2014); XIX научно-практической
конференции молодых ученых, аспирантов и студентов МГУ им. Н. П. Огарёва
(Саранск, 2014); Международной научно-практической конференции «Наука
сегодня» (Вологда, 2015); Международной научно-практической конференции
«Инновационные технологии нового тысячелетия» (Киров, 2016);
Международной научно-практической конференции «Наука и инновации в современных условиях» (Казань, 2017); Международной научно-практической конференции «Новая наука: от идеи к результату» (Сургут, 2017); 2nd International Symposium on «Physics, Engineering and Technologies for Biomedicine» (Москва, 2017); XXI научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов МГУ им. Н. П. Огарёва (Саранск, 2017); VI Международной научной конференции «Актуальные проблемы медицинской науки и образования» (Пенза, 2017); VII Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2017» (Санкт-Петербург, 2017); Всероссийской научной конференции с международным
участием «Фундаментальные и прикладные аспекты морфогенеза человека» (Оренбург, 2017), XXVII Российской конференции «Современные методы электронной и зондовой микроскопии в исследованиях органических, неорганических наноструктур и нано-биоматериалов» (Черноголовка, 2018).
Результаты диссертационного исследования внедрены в научно-исследовательскую и учебную работу кафедры цитологии, гистологии и эмбриологии с курсами медицинской биологии и молекулярной биологии клетки, центра перспективных исследований инновационных лекарственных средств ФГБОУ ВО «МГУ им. Н. П. Огарёва», а также лаборатории молекулярных основ патогенеза КИББ ФИЦ КазНЦ РАН и кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России.
Личный вклад. Диссертация является результатом самостоятельного исследования автора, принявшего участие в работе на этапах планирования, формулирования цели и задач исследования, анализе данных и их обсуждении, подготовке публикаций, а также оформлении рукописи диссертации. Получение фактических результатов, забор и фиксация материала, получение и окраска срезов, морфометрия, статистическая обработка результатов выполнялись лично автором.
Публикации. По материалам диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе одна из них в журнале, входящем в базу цитирования Web of Science и четыре – в журналах, входящих в перечень рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 162 страницах текста компьютерного набора и включает: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы. Диссертация иллюстрирована 38 рисунками, 14 таблицами. Список литературы включает 341 источник, из которых отечественных работ 143, иностранных – 198.
Физическая нагрузка и ее влияние на организм человека и животных
В настоящее время проблема влияния физических нагрузок на организм является одной из актуальных в различных областях медико-биологической науки. Двигательная активность для организма является важным фактором для жизнедеятельности и оказывает влияние на весь организм.
Под физической нагрузкой понимается «дополнительная по сравнению с покоем степень функциональной активности организма, привносимая вы полнением упражнений, а также степень переносимых при этом трудностей» (Руденик В. В., 2000). Существует и другое определение данного термина: «нагрузка – это воздействие физических упражнений на организм человека, вызывающее активную реакцию его функциональных систем» (Бернштейн Н. А., 2002).
Существует целый ряд классификаций физических нагрузок, авторы которых исходят из специфики видов спорта, энергетики и мощности мышечной работы, влияния нагрузки на восстановительные процессы и эффект последующей работы, преимущественной направленности работы и других критериев. Однако скорость адаптационных перестроек в организме человека, их направленность и достигнутый уровень адаптации обусловливаются характером, величиной и направленностью используемых нагрузок (Берн-штейн Н. А., 2004).
По характеру работы мышц физическая нагрузка подразделяется на динамическую, статическую и смешанную (статико-динамическую) (Панферова Н. Е., 1977; Руденик В. В., 2000).
Смешанная физическая нагрузка является результатом общего воздействия в той или иной мере статического и динамического компонентов.
Динамическая физическая нагрузка характеризуется периодическими сокращениями и расслаблениями скелетных мышц. Динамическое сокращение является прерывистым и состоит из фаз укорочения и удлинения мышцы. Здесь выделяют следующие виды мышечной работы: преодолевающая – укорочение мышцы под нагрузкой и уступающая – растягивание мышцы под нагрузкой. Динамический компонент мышечной деятельности обеспечивает перемещение тела в пространстве (Криштоп В. В., 2005).
Статическая (удерживающая) физическая нагрузка характеризуется непрерывным сокращением мышцы, без изменения её длины с целью удержания положения тела или отдельных его частей, а также выполнения определенных действий, таких как удержание груза, приложение усилий (Панферова Н. Е., 1977). Сохранение равновесия тела осуществляется путем оказания противодействия, через сопротивление силе тяжести, что достигается быстрым перераспределением тонических и тетанических напряжений мышц (Криштоп В. В., 2005). При этом мышцы, поддерживающие равновесие тела, постоянно находятся в напряжении (Muller H., 1932; Tepper R. H., Hellebrandt F. A., 1938). Такая нагрузка сопровождается иммобилизацией отдельных частей скелета, вызывая ряд изменений со стороны кровообращения и дыхательной системы (изменение гемодинамических показателей, застой крови) (Шеффер Ж., 1973; Тарасенко Н. Ю. и др., 1979). Влияние статической нагрузки в виде длительного нахождения в вынужденной позе является особенно актуальным в эпоху всеобщей компьютеризации. Работа за персональным компьютером дома, на работе сопровождается длительным нахождением тела в статичном положении. С этой проблемой сталкиваются как офисные работники, так и каждый владелец персональных компьютеров.
Умеренная и регулярная физическая активность является важным компонентом, который способствует поддержанию и укреплению здоровья. По мнению Y. Sun, S. Z. Ding (2014) и B. Egan, J. R. Zierath (2013), с помощью умеренных физических нагрузок можно контролировать массу тела, кроме того, они способствуют снижению риска возникновения сердечнососудистых заболеваний, сахарного диабета, метаболического синдрома и даже развития некоторых видов онкологических заболеваний. При этом укрепляются кости и мышцы, улучшаются психическое здоровье и настроение, повышается работоспособность, ускоряются процессы метаболизма (Egan B., Zierath J. R., 2013; Sun Y., Ding S. Z., 2014).
Как известно, ни одно спортивное достижение невозможно без интенсивных физических нагрузок. Тренировочная и соревновательная деятельность спортсменов, опосредованная интенсивными физическими нагрузками, может способствовать значительным изменениям в различных функциональных системах организма (Роженцов В. В., Полевщиков М. М., 2006; Воронков А. В. и др., 2013). Данный фактор может обусловливать метаболические нарушения, изменения реологических свойств крови, вазоконстрикцию, им-муносупрессию и т. д., что может привести к развитию дезадаптационных изменений (Воронков А. В. и др., 2012). Активация свободнорадикальных процессов и ослабление антиоксидантной защиты организма способствуют развитию переутомления. Во время чрезмерно интенсивных нагрузок антиоксидантная защита организма значительно снижается в связи с возросшей потребностью тканей в кислороде, в таких условиях необходима дополнительная его доставка, и компенсация происходит за счет усиления свободно-радикальных реакций. Следствием этого процесса является увеличение свободных форм кислорода, что способствует дисбалансу про- и антиоксидант-ной систем и может спровоцировать каскад дезадаптивных реакций, ассоциированных с экстремальными физическими нагрузками (Меерсон Ф. З., Пшенникова М. Г., 1988; Корнякова В. В. и др., 2012; Воронков А. В. и др., 2013).
Активная мышечная деятельность, особенно в спорте высоких достижений, связана с риском для здоровья в виде получения травм и других негативных воздействий на организм. Скелетные мышечные ткани способны адаптироваться к стрессовым факторам, таким как физическая нагрузка (Sun Y., Ding S. Z., 2014).
Регулярные, повторяющиеся мышечные сокращения, связанные с тренировочным процессом, являются мощным стимулом для физиологической адаптации (Egan B., Zierath J. R., 2013). При длительном тренировочном процессе скелетные мышцы демонстрируют пластичность в функциональной адаптации и реконструкции в ответ на сократительную активность (Fluck M., Hoppeler H., 2003; Coffey V. G., Hawley J. A., 2007; Suwa M. et al., 2002, 2016). На клеточном уровне происходит ряд адаптационных перестроек, что отражается на изменении функционирования сократительных белков (Adams G. R. et al., 1993; Widrick J. J. et al., 2002), митохондриальной функции (Spina R. J. et al., 1996), метаболической регуляции (Green H. J. et al., 1992), внутриклеточной сигнализации (Benziane B. et al., 2008) и транскрипционных ответах (Pilegaard H. et al., 2003). Молекулярные механизмы, которые регулируют адаптацию к тренировочному процессу, вызывают постепенное изменение содержания сократительных белков и активности ферментов, отражая активацию или подавление специфических сигнальных путей, которые регулируют транскрипцию и трансляцию, а также экспрессию специфичных генов (Egan B., Zierath J. R., 2013). Эти приспособления свойственны работающим скелетным мышцам и способствуют улучшению доставки субстрата, дыхательной способности митохондрий, а также сократительной функции во время физических упражнений. Конечный результат заключается в оптимальной производительности в тренировочном процессе, что способствует защите го-меостаза в условиях метаболических изменений и, следовательно, повышает устойчивость к утомлению (Holloszy J. O., Coyle E. F., 1984; Booth F. W., Thomason D. B., 1991).
Физическая нагрузка приводит к мобилизации не только скелетной мускулатуры, которая осуществляет двигательную реакцию, но и других органов и систем организма, в частности органов дыхания и кровообращения, обеспечивающих энергетический метаболизм работающих мышц (Меерсон Ф. З., Пшенникова М. Г., 1988). Следовательно, эти системы являются звеньями одной цепи, их деятельность строго координирована.
Как известно, кровь выполняет ряд важных функций, таких как транспортная, защитная, регуляторная, а также теплообмен. Самая многочисленная популяция клеток крови – красные кровяные тельца (эритроциты), носители дыхательного пигмента – гемоглобина. Эритроциты переносят кислород из легких к тканям и удаляют углекислый газ из тканей, доставляя его к легким. При регулярных физических нагрузках наблюдается увеличение количества красных кровяных телец, что сопровождается повышением содержания гемоглобина в крови, в результате чего увеличивается ее кислородная емкость (Евсеев Ю. И., 2003).
Эритроцит – это высокоспециализированная постклеточная структура, выполняющая ряд важных функций в организме (Боровская М. К. и др., 2010). Мембрана эритроцита имеет толщину около 10 нм, на ней располагаются многочисленные рецепторы и белки-переносчики, которые выполняют гомеостатическую функцию (Трошкина Н. А., Циркин В. И., 2007; Li H., Lykotrafitis G., 2014). Цитоскелет эритроцита – это двумерная филаментная сеть, которая поддерживает форму и отвечает за подвижность и распределение интегральных мембранных белков в цитоплазме (Li H., Lykotrafitis G., 2014). В цитоплазме эритроцита находится гемоглобин, играющий важную роль в газообмене и стабилизации ее структуры (Блюменфельд Л. А., 1998; Cortese-Krott M. M., Kelm M., 2014). Молекула гемоглобина состоит из 4 ге-мов, а также 1, 2, 1 и 2 белковых цепей. Гем представляет собой порфи-риновый макроцикл, находящийся в гидрофобном участке белковой части гемоглобина (Hill R. J., 1962; Marengo-Rowe A. J., 2006). Железо гемопорфи-рина гемоглобина координационно связано с 4 атомами азота пиррольных групп порфиринового кольца, 5-я координационная связь соединяет атом железа с гистидином, а 6-я валентность может образовывать связь с молекулой кислорода. Таким образом, атом железа в дезоксигемоглобине имеет пять координационных связей, а в оксигемоглобине – шесть (Гуринович Г. П. и др., 1963; Fan J.-S. et al., 2013; Takayanagi M. et al., 2014).
Характеристика L-карнитина
L-карнитин (L--гидрокси--N,N,N-триметиламиномасляная кислота, левокарнитин) – природное энергообеспечивающее вещество, родственное витаминам группы В (рисунок 2), которое выполняет важную роль при транспорте длинноцепочечных жирных кислот в митохондриальный матрикс и регулирует метаболизм ацил-КоА (Сейфулла Р. Д., Орджоникидзе З. Г., 2003; Копелевич В. М., 2003, 2005; Титов В. Н., 2012; Czeczot H., Scibior D., 2005; L-carnitine, 2005).
Научные сотрудники кафедры медицинской химии Московского университета Владимир Сергеевич Гулевич и Робертс Кримберг впервые выделили L-карнитин в 1905 г. из экстракта мышечной ткани (Gulewitsch W., Krimberg R., 1905). Ученые дали данному соединению название карнитин (от лат. «саrne» – плоть, мясо). В 1927 г. при химическом синтезе была установлена молекулярная структура карнитина и оказалось, что это -амино--окси-масляная кислота (Tomita M., Sendju Y., 1927). В середине ХХ столетия Г. Френкель установил, что необходимым фактором роста для развития червей и личинок (в частности, мучного червя Tenebrio molitor) является L-карнитин, вследствие чего вещество получило название витамин Вт (Копелевич В. М., 2003; Bhattacharyya P. K. et al., 1952, 1955; Wolf G., 2006). Однако гипотеза, что карнитин является витамином, оказалась неточной, так как в 1961 году было обнаружено, что карнитин синтезируется в организме (Wolf G., Berger C. R., 1961). I. B. Fritz в 1958 г. установил, что в митохондриях L-карнитин увеличивает скорость окисления жирных кислот (Fritz I. B. et al., 1958). Это исследование явилось основой для изучения фундаментальной роли L-карнитина в метаболизме жиров (Верткин А. Л., 2012; Harmeyer J., 2002).
Карнитин имеет оптически активный центр и существует в виде двух пространственных изомерных форм – L- и D-стереоизомеров (Спасов А. А., Иежица И. Н., 2005). В природе оптический D-изомер карнитина не обнаружен, он может быть образован химическим путем. В результате многочисленных научных работ было установлено, что D-форма является биологически неактивной и даже оказывает отрицательное воздействие на обмен веществ (Спасов А. А. и др., 2006; Rebouche C. J., 1977; Seim H., Starck E., 1977; Whitmer J. Т. et al., 1978; Spasov A. A. et al., 2006). Согласно данным литературы, D-изомер затрудняет окисление жирных кислот (Borum P. R., 1991), оказывает конкурентное ингибирование при усвоении L-формы карнитина тканями и органами, препятствует проникновению в скелетную и сердечную мышечную ткань (Steiger B. et al., 1995; Shennam D. B. et al., 1998), а также вызывает нарушение синтеза L-карнитина в печени, почках (Tsoco M. et al., 1995). Результаты клинических и экспериментальных исследований показали, что прием D-карнитина оказывает токсическое действие на сердечную и скелетную мышечную тканьвызывая миастению и сердечные аритмии (Paulson D. J., Shug A. L., 1981; Maccari F., Ramacci M. T., 1981). Так как биологически эффективной является только L-форма карнитина, D-карнитин и смесь D- и L-карнитина для производства фармацевтических препаратов, как правило, не используются (Яковлева Л. В. и др., 2011; Maier J. et al., 1987; Rebouche C. J., Paulson D. J., 1986; Snchez-Hernndez L. et al., 2010). Однако в рассмотренной отечественной литературе также есть информация о том, что D-изомер в составе L-D-карнитина не причиняет организму вреда, а его рацемическая смесь даже эффективнее L-карнитина (Кузин В. М., 2003; 2003).
L-карнитин является веществом, которое выполняет важную роль в транспорте жирных кислот в митохондриальный матрикс, где происходит их -окисление (Ключников С. О., 2007; Eaton S. et al., 1996). Свободные длинноцепочечные жирные кислоты из цитоплазмы клетки не могут перейти через митохондриальную мембрану. В матриксе митохондрии они могут оказаться только после того, как будут подвержены ряду ферментативных превращений (Спасов А. А., Иежица И. Н., 2005; Jacob C., Belleville F., 1992; Carter A. L. et al.,1995).
На первом этапе свободные жирные кислоты активируются коэнзимом А (КоА) до образования ацил-КоА (КоА – производное жирной кислоты). Данный процесс энергозатратный (АТФ расщепляется на АМФ и неорганический фосфат) и осуществляется при помощи ацил-КоА-синтетазы – фермента, который локализуется на наружной мембране митохондрий (рисунок 3). КоА-эфиры жирных кислот не способны проникать через внутреннюю мембрану митохондрий, для этого на внутренней поверхности наружной мембраны находится фермент карнитинацилтрансфераза I, которая катализирует перенос ацильного остатка жирной кислоты с КоА на L карнитин, в результате образуется эфир – ацилкарнитин (Lee K. et al., 2011), который затем транспортируется с помощью карнитинацил карнитинтранслоказы через внутреннюю митохондриальную мембрану в обмен на свободный L-карнитин матрикса, переходящий из митохондрии в цитозоль клетки (Асташкин Е. И., Глезер М. Г., 2012; Borum P. R., 1993). На следующем этапе остаток жирной кислоты (ацильная группа) переносится от L-карнитина на внутримитохондриальный КоА при участии карнитинацилтрансферазы II, которая локализуется на внутренней митохондриальной мембране (рисунок 3).
Существует классификация карнитинацилтрансфераз, которые различаются по длине переносимых ацильных групп. Так, карнитинпальми-тоилтрансфераза переносит жирнокислотные остатки с длиной цепи (более С12); карнитиноктоноилтрансфераза – среднецепочечные ацилы (С5–С12); карнитинацетилтрансфераза – короткоцепочечные ацилы (С2–С5). Карни-тинацетилтрансфераза – это матриксный фермент митохондрий, который образует эфиры короткоцепочечных жирных кислот с L-карнитином (Креме-нецкая Т. В. и др., 2001; Асташкин Е. И., Глезер М. Г., 2012). Особая роль этого фермента в регуляции метаболизма в митохондриях связана со снижением отношения ацетил-КоА/свободный КоА в результате переноса ацетильных остатков на карнитин и увеличением уровня свободного КоА – процессом «регенерации КоА» (Noland R. C. et al., 2009; Sharma S. et al., 2008, 2009). Кроме основной транспортной функции в окислении жиров, согласно данным литературы, L-карнитин выполняет в организме ряд других важных функций (Яковлева Л. В. и др., 2011; Steiber A. et al., 2004; Witte K. K., Clark A. L., 2006):
– участвует в образовании соединений с токсичными промежуточными продуктами окислительных процессов и выходит из клеток в виде ацилкар-нитинов (Накостенко Т. Н. и др., 2007; Noland R. C., 2009), принимает участие в реакциях конъюгации с ксенобиотиками (Rebouche C. J., Seim H., 1998; Czeczot H., Scibior D., 2005);
– принимает участие в метаболизме углеводов при регуляции активности пируватдегидрогеназного комплекса, поддерживает энергетический гомеостаз клеток (Дамброва М. и др., 2014; Lopaschuk G. D., 2001; Stephens F. B. et al., 2007);
– оказывает гепатопротекторное, кардиопротекторное, а также нефро-протекторное действие (Eknoyan G. et al., 2003; Calvani M. et al., 2004);
– стимулирует сперматогенез, подвижность сперматозоидов, улучшает качество и количество спермы (Гамидов С. И. и др., 2010; Фарбирович В. Я. и др., 2012; Иванов Н. В., Ворохобина Н. В., 2012; Галимов Ш. Н. и др., 2012; Галимова Э. и др., 2014; Ng C. M. et al., 2004; Mongioi L. et al., 2016);
– стимулирует мозговую деятельность, улучшает процессы передачи нервного импульса в синапсах и аксонах путем повышения синтеза холина и ацетилхолина, оказывает нейропротекторное действие (Яковлева Л. В. и др., 2011; Студеникин В. М. и др., 2011; Ribas G. S. et al., 2014);
– способствует улучшению нервно-психического и физического развития, иммунной и эндокринной систем у детей (Воробьева О. В. и др., 2011; Балыкова Л. А. и др., 2014, 2016; Подобед В. М., 2015; Неудахин Е. В., 2015; Шалькевич Л. В., Малаш А. В., 2016; Famularo G. et al., 2004; Stanley С. A., 2004); – оказывает антиоксидантное и антигипоксическое действие (Яковлева Л. В. и др., 2011)
Влияние статической и динамической физической нагрузки на гематологические показатели крови и конформационные свойства гемопорфирина гемоглобина эритроцитов
Известно, что интенсивная физическая нагрузка не только сопровождается изменениями со стороны мышечной системы, но и характеризуется интенсификацией деятельности практически всех систем организма, и в первую очередь дыхательной и сердечно-сосудистой систем. У нетренированных организмов увеличение потребления кислорода тканями очень быстро превышает адаптивные возможности указанных систем. В связи с этим исследование гематологических показателей у подопытных животных, и в первую очередь изучение кислород–связывающих свойств гемопорфирина гемоглобина, приобретает особое значение при оценке степени адаптации животных к модельным физическим нагрузкам.
Гемограмму и показатели конформационных свойств гемопорфирина гемоглобина мышей, которые подвергались физической нагрузке и получали исследуемые препараты, изучали на следующий день после последнего эксперимента (на 11-е сутки после начала опыта). Полученные данные сравнивали с соответствующими показателями мышей контрольной группы и показателями интактных животных, которые находились в условиях стандартной двигательной активности.
Сведения, полученные о составе крови мышей, подвергавшихся статической физической нагрузке, приведены в таблице 5.
При анализе данных таблицы 5 установлено, что воздействие ежедневных статических упражнений в течение 10 суток не оказывает влияния на большую часть гематологических показателей периферической крови лабораторных животных. Однако у мышей к концу периода тренировок отмечается снижение средних показателей содержания и концентрации гемоглобина в эритроците. Общее количество красных клеток в периферической крови при этом не снижается. Другим статистически значимым изменением состава крови в контрольной группе является увеличение содержания тромбоцитов.
Можно предположить, что отмеченные изменения являются следствием не столько физического перенапряжения животных, сколько последствиями стресса от регулярных ударов электрического тока, которые они получают, прежде чем забраться на диэлектрический стержень лабораторной установки. Учитывая данное обстоятельство, устранять выявленные выше изменения, видимо, будут способны препараты с максимально выраженными антистрессорными свойствами.
Согласно полученным нами данным, креатинфосфат не обладал способностью корригировать стресс-обусловленные изменения гемограммы подопытных животных. Карнитина хлорид, не влияя на показатели гемоглобина в эритроците, статистически достоверно предупреждал рост числа тромбоцитов в крови. Наиболее эффективным проявил себя L-карнитин, который в условиях данной модели не только предупреждал развивающийся тромбоцитоз, но и способствовал компенсации снижения среднего содержания гемоглобина в эритроците, что сопровождалось увеличением объема клетки. Снижение средней концентрации гемоглобина в эритроците, наблюдаемое в контрольной серии опытов, под влиянием L-карнитина становилось статистически недостоверным.
Изменения гемограммы в опытах на модели динамической физической нагрузки отсутствовало как в контрольной группе животных по сравнению с интактными мышами, так и во всех опытных группах по сравнению с контрольной группой, что нашло отражение в данных, представленных в таблице 6. На основании этого факта можно предположить, что на модели плавания стресс имеет гораздо меньшее значение как фактор, индуцирующий дезадаптивные изменения в составе крови животных.
Учитывая, что главным элементом эритроцитарной системы транспорта кислорода является гемоглобин, а также принимая во внимание факт чувствительности показателей содержания гемоглобина в эритроците к статической физической нагрузке, на следующем этапе исследования была поставлена задача исследовать конформационные состояния гемопорфирина гемоглобина методом спектроскопии комбинационного рассеяния света. Это оптический метод, который может обеспечить специфический анализ структуры и функции гемоглобина, мониторинг динамики гемоглобина, а также определение насыщения гемоглобина кислородом (Egawa T., Yeh S. R., 2005; Lu M. Z. et al., 2014). Гемопорфирин гемоглобина обладает довольно интенсивным комбинационным рассеянием света вследствие наличия в нем гетероциклов с сопряженными химическими связями. Спектр гемоглобина представляет собой совокупность полос, вызванных колебаниями связей в гемопорфирине. Данные о конформационных состояниях гемопорфирина гемоглобина в исследуемых группах животных на модели статической физической нагрузки представлены в таблице 7.
Анализ полученных данных свидетельствует, что в крови у животных, подвергавшихся статической нагрузке, отмечается увеличение относительного количества комплексов оксигемоглобина (на 6 %), при этом сродство гемоглобина к кислороду повышается на 15 %. Увеличивается выраженность асимметричных колебаний пиррольных колец гемопорфирина на 44 %, что указывает на изменения геометрии порфиринового макроцикла. Способность молекулы гемоглобина связывать и сбрасывать лиганды снижается под действием статической нагрузки на 23 % и 26 % соответственно. Следовательно, статическая физическая нагрузка существенным образом изменяет физико-химические свойства гемопорфирина гемоглобина, что может оказывать существенное влияние на газотранспортные свойства крови и процесс обмена кислородом между эритроцитами и альвеолярным воздухом, с одной стороны, и эритроцитами и скелетными мышцами подопытных животных, с другой стороны.
По данным спектроскопии комбинационного рассеяния света, действие исследуемых препаратов было различным. Наименьшую активность продемонстрировал креатинфосфат. Препарат не оказывал влияния на регистрируемые в ходе эксперимента спектры, измененные статической физической нагрузкой. Единственным статистически значимым его эффектом была нормализация сродства гемоглобина к кислороду.
Карнитина хлорид и L-карнитин в условиях данной экспериментальной модели проявили однотипные фармакологические свойства. Оба препарата повышали по сравнению с показателями контрольных животных способность гемоглобина связывать лиганды, при этом молекула становилась более стабильной, поскольку уменьшалась выраженность асимметричных колебаний пиррольных колец гемопорфирина. Сродство гемоглобина к кислороду под влиянием карнитина хлорида и L-карнитина возвращалось к уровню, характерному для интактных животных. Следует отметить, что L-карнитин, в отличие от карнитина хлорида, оказывает повышающий эффект на способность гемоглобина не только связывать, но и отдавать лиганды. Таким образом, препараты метаболического типа действия оказывают заметный компенсаторный эффект, устраняя негативные последствия тренировочного процесса в статическом режиме, на систему гемоглобина эритроцитов.
Данные о конформационных состояниях гемопорфирина гемоглобина при моделировании динамической физической нагрузки у представителей исследуемых групп животных приведены в таблице 8.
Следует отметить, что динамика изменения спектров гемопорфирина у животных, которые подвергались динамической физической нагрузке, было однонаправленным с теми изменениями, которые мы наблюдали у контрольной группы мышей, получавшей статическую нагрузку. У животных, подвергнутых нагрузке плаванием «до отказа», также снижалась способность гемоглобина связывать лиганды, что сочеталось с повышением нестабильности молекулы (это проявлялось усилением асимметричных колебаний пир-рольных колец). Увеличение доли комплексов оксигемоглобина, в отличие от модели статической нагрузки, сопровождалось также снижением доли комплексов дезоксигемоглобина.
Исследование морфологии скелетных мышц
На следующем этапе исследования перед нами стояла задача оценить влияние L-карнитина в дозе 100,0 мг/кг на морфологию скелетных мышц лабораторных грызунов в условиях моделирования динамической физической нагрузки. В качестве подопытных животных нами выбраны белые нелинейные крысы в связи с тем, что, по сравнению с мышами, они имеют более крупные мышцы задних конечностей, что является несомненным удобством для их выделения. Кроме того, следует учитывать, что в этом блоке нашей работы длительность плавания крыс была увеличена до 21 суток для более надежного воспроизведения морфологических изменений, вызванных физической нагрузкой.
При выборе объектов исследования нами было учтено, что скелетные мышцы человека и млекопитающих неоднородны по гистохимической, функциональной и метаболической природе. Состав мышечных волокон детерминирован генетически и уникален для каждого биологического вида и конкретной мышцы. В зависимости от силы, скорости сокращения и развития утомления мышечные волокна подразделяются на быстрые (белые, гликолитические) и медленные (красные, оксидативные), также между ними выделяют промежуточный тип мышечных волокон (Ямщиков Н. В., и др. 2011). Учитывая данное обстоятельство, мы приняли решение подвергнуть морфологическому исследованию мышцы крыс двух противоположных фенотипов. Известно, что камбаловидная мышца у всех млекопитающих в основном образована медленными мышечными волокнами, тогда как содержание волокон быстрого типа минимально (Зырянова Т. Ю., Марков А. Г., 2013; Punkt K., 2002). Напротив, подошвенная мышца в основном образована мышечными волокнами быстрого типа (Валиуллин В. В. и др., 2009). В связи с этим в диссертационном исследовании были изучены камбаловидная (m. soleus) и подошвенная (m. plantaris) мышцы. Первым шагом в исследовании этих двух видов скелетных мышц была оценка их относительной массы, что позволяет судить о наличии или отсутствии процесса мышечной гипертрофии у животных различных экспериментальных групп. Полученные результаты представлены в таблице 9.
Приведенные данные свидетельствуют о том, что использованный режим физической нагрузки не сказывается на величине относительной массы как камбаловидной, так и подошвенной мышцы. Если сеансы плавания поддерживаются внутрибрюшинным введением L-карнитина и креатинфосфата в дозе 100,0 мг/кг, то относительная масса обоих мышц также не претерпевает статистически достоверных изменений.
Однако для детального изучения свойств L-карнитина необходимы гистологические исследования, поскольку увеличение содержания мышечных белков в цитоплазме мышечных волокон теоретически может быть компенсировано снижением массы жировой, соединительной тканей в межмышечных прослойках. В этом случае масса мышц может не претерпевать заметных изменений при простом взвешивании. Для однозначного решения поставленной задачи нами был выполнен следующий этап работы с применением гистологических методов исследования.
Подошвенная и камбаловидная мышцы крыс интактной группы имеют типичное строение. На продольных сечениях (рисунок 8) видно, что обе мышцы образованы ориентированными параллельно друг другу экстрафузальными мышечными волокнами, разделенными узкими прослойками эндомизия. Границами пучков мышечных волокон является более толстый перимизий. Следует отметить, что в соединительной ткани эндомизия и перимизия достаточно регулярно отмечались зоны небольшого или умеренного интерстициального отека.
В обеих мышцах находятся более мелкие интрафузальные мышечные волокна, окруженные соединительнотканной капсулой. Цитоплазма экстрафузальных мышечных волокон имеет выраженную ацидофилию. По периферии каждого волокна располагаются базофильно окрашенные овальные ядра.
В поперечном сечении мышечные волокна имеют округлую, овальную или неправильную форму (рисунок 8). У животных из группы интактного контроля мы не наблюдали существенных отклонений от универсальных закономерностей строения скелетной мышечной ткани в обеих исследуемых мышцах.
Поперечная исчерченность выявлялась нами весьма редко, поскольку окраска гематоксилином и эозином не является специфической для идентификации чередования изотропных и анизотропных дисков в составе скелетной мышечной ткани.
В перимизии достаточно регулярно обнаруживались кровеносные сосуды, стенки которых имели типичное строение и не имели признаков лимфоцитарной инфильтрации или участков разрушения.
Морфология экстрафузальных мышечных волокон подошвенной и камбаловидной мышц крыс, подвергнутых динамической физической нагрузке, в целом соответствует строению миосимпласта животных группы интактного контроля, но имеет ряд характерных особенностей (рисунок 9).
В составе подошвенной и камбаловидной мышц крыс находятся мышечные волокна, имеющие участки разрыва саркоплазмы и волокна измененных формы и размера. В частности, мы обнаруживали резко гипертрофированные мышечные волокна, которые на поперечном срезе имели почти правильную округлую форму. Их диаметр достигал 80–100 мкм, тогда как диаметр типичных мышечных волокон находился в диапазоне 30–50 мкм.
Интрафузальные мышечные волокна характеризуются значительно меньшим диаметром. Они располагаются группами по 2–5 волокон, имеют оксифильную цитоплазму. Их ядра также занимают периферическое положение, но могут иметь не овальную, а округлую форму. Пучок интрафузальных волокон окружен сравнительно тонкой соединительнотканной оболочкой и располагается недалеко от нервного волокна.
Кровеносные сосуды имеют умеренное кровенаполнение, периваскулярная зона иногда содержит лейкоциты. Отек перимизия в обеих исследуемых мышцах обычно был более выражен, чем у животных, которые находились в условиях стандартной двигательной активности и без фармакологической поддержки.
На следующем этапе работы мы исследовали строение подошвенной и камбаловидной мышц крыс, подвергнутых динамической физической нагрузке и получавших препарат креатинфосфат в дозе 100,0 мг/кг. Большинство экстрафузальных мышечных волокон имеет выраженную ацидофилию саркоплазмы и типичную структуру, характерную для крыс интактной группы (рисунок 10). Однако, как и у животных, подвергнутых контрольным заплывам с введением плацебо, отдельные мышечные волокна выглядели резко гипертрофированными с почти правильным округлым поперечным сечением. Отдельные экстрафузальные мышечные волокна имели участки полной или частичной прерывистости. Интрафузальные мышечные волокна, напротив, не претерпевали заметных изменений в сравнении с их морфологией у уже описанных нами выше двух групп животных.
Кровеносные сосуды исследуемых мышц животных данной экспериментальной группы имеют неповрежденные стенки. Зона лейкоцитарной инфильтрации в окружающей сосуды соединительной ткани либо отсутствует, либо имеет незначительную степень. Просвет кровеносных сосудов не заполнен тромбоцитарными массами и либо свободен, либо имеет умеренное кровенаполнение.
Интенсивность отека эндомизия и перимизия существенно варьирует. Наряду с зонами незначительной отечности, на микропрепаратах можно обнаружить также зоны умеренного и обширного интерстициального отека. В целом можно констатировать, что у животных, подвергнутых принудительному плаванию «до отказа» и получавших референтный препарат креатин-фосфат в дозе 100,0 мг/кг, характер морфологических изменений в скелетной мышечной ткани в m. plantaris и m. soleus во многом напоминает морфологическую картину, наблюдаемую у крыс группы контрольной физической нагрузки с назначением плацебо. Следовательно, препарат креатинфосфат в указанной дозе, на наш взгляд, не может быть признан эффективным корректором негативных морфологических изменений в скелетной мышечной ткани.