Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Строение, развитие, инволюция лимфоидной ткани кишечника 9
1.2. Клеточный состав лимфоидной ткани стенки кишечника 15
1.3. Морфология лимфоидной ткани брыжеечных лимфатических узлов (строение, развитие, цитоархитектоника) 18
1.4. Пробиотические препараты и их влияние на морфологию кишечной стенки и GALT 24
1.5. Влияние пробиотических препаратов на иммунологические показатели неспецифической резистентности крови животных 26
2. Собственные исследования 27
2.1. Материал и методы исследований 27
2.2. Морфологические параметры лимфоидных бляшек стенки тонкой кишки поросят под влиянием штамма L. paracasei 32
2.3. Цитоморфология лимфоидных узелков стенки кишечника поросят в возрасте 64 суток под влиянием штамма L. paracasei 44
2.4. Цитоморфология лимфоидных узелков стенки кишечника поросят в возрасте семь месяцев под влиянием штамма L. paracasei 63
2.5. Цитоморфология мезентериальных лимфатических узлов поросят в возрасте 64 суток под влиянием L. paracasei 81
2.6. Цитоморфология мезентериальных лимфатических узлов свиней в возрасте семь месяцев под влиянием штамма L. paracasei 94
2.7. Иммунологические показатели крови поросят в ходе опыта по применению штамма L. paracasei 107
3. Обсуждение результатов исследований 115
Заключение 133
Список условных сокращений 134
Список использованной литературы 135
- Морфология лимфоидной ткани брыжеечных лимфатических узлов (строение, развитие, цитоархитектоника)
- Цитоморфология лимфоидных узелков стенки кишечника поросят в возрасте 64 суток под влиянием штамма L. paracasei
- Цитоморфология мезентериальных лимфатических узлов поросят в возрасте 64 суток под влиянием L. paracasei
- Иммунологические показатели крови поросят в ходе опыта по применению штамма L. paracasei
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Ветеринарная наука непрерывно
реализует комплексное изучение на стыках теоретической и прикладной
сфер. Глубинные исследования морфологии и физиологии организма
животных необходимы для решения практических задач. Так в практике
передовых стран мира наблюдается ужесточение требований к
экологичности продукции свиноводческой отрасли. В качестве решения
усматривается разработка новых экологически безопасных препаратов
(Самуйленко А.Я., 2016). Считается, что пробиотические препараты, помимо
экологической чистоты физиологичны и могут быть назначены животным
любого возраста, включая новорожденных (Зинченко Е.В.; Панин А.Н., 2000;
Стегний Б.Т., 2005; Панин А.Н.; Малик Н.И., 2006). В связи с новыми
разработками неизбежно встат вопрос изучения влияния на организм
резкого введения в просвет кишечника большого количества микробных
клеток нового штамма. Доказано, что изменения в рационе питания,
микробиоте или патогене могут изменить гистохимический состав стенки
кишечника, е морфологию (Sharma et al, 1995; Cruz Sanchez et al, 2008; Che
et al, 2009). Примечательно, что до одной трети всех веществ, участвующих в
процессах метаболизма организма – хозяина, имеет микробное
происхождение. (McFall-Ngai et al, 2013). Это показывает – на сколько
организм человека и животных зависим от состояния кишечного микробиота
и механизмов его контроля, таких как кишечно-ассоциированная
лимфоидная ткань (GALT). Многие исследователи сообщают, что процесс
гистологического созревания всех слов пищеварительного канала,
происходит быстрее и эффективнее в группах животных, получающих с
кормом пробиотические препараты. (Dalloul et al., 2003; Babinska et al., 2005;
Scharek et al., 2007; Roselli et al., 2009; Pirarat et al., 2011; Deng et al., 2012; Lee
et al., 2010; Levkut et al., 2012; Bai et al., 2013). Известно и то, что разные
штаммы, используемые в пробиотических препаратах, по-разному
воспринимаются иммунной системой органов пищеварения.
Иммуномодулирующий эффект от их применения в различных условиях проявляется по-разному, или не проявляется вовсе. Реакция на каждый пробиотический препарат отличается индивидуальностью, так – как зависит не только от штамма, но и от состояния собственной микробиоты хозяина и его иммунной системы (Корниенко Л.Н. с соавт., 2015). В связи с этим, особый интерес представляет изучение реакции лимфоидной ткани кишечника сельскохозяйственных животных под воздействием новых пробиотических препаратов. (Панфилов А.Б. 2002; Пономарев И.Н. 2010).
Степень разработанности проблемы. В настоящее время наукой не достаточно изучены морфология и цитоархитектоника лимфоидной ткани кишечника, крайне мало сведений о е реактивных изменениях при применении пробиотиков. Остаются актуальными задачи по выявлению
новых штаммов и по совершенствованию методов их испытаний. В поиске перспективных пробиотических препаратов сотрудники ФГБОУ ВО «Вятский государственный университет» получили из пищеварительного канала свиней штамм L. paracasei. Первые проведнные испытания с применением биопрепарата на его основе дали хорошие результаты: у поросят нормализуется видовой и количественный состав микрофлоры кишечника, а в группе получавшей жидкую форму биопрепарата к 60 суткам опыта на 3,0% увеличивается прирост живой массы (Позолотина Н.В., 2017). Совместная работа наших исследовательских коллективов позволила раздвинуть границы изучаемых аспектов при оценке влияния штамма L paracasei на организм свиней. Проведнные исследования расширяет наше представление о морфологии лимфоидных образований стенки кишечника и мезентеральных лимфатических узлов, а также, представляют огромную практическую значимость, давая характеристику влияния конкретного штамма на организм животных.
Цель и задачи исследования. Целью исследования явилось изучение реактивных изменений лимфоидной ткани стенки кишечника поросят и связанных с ней мезентериальных лимфатических узлов под влиянием пробиотического штамма Lactobacillus paracasei B-11821. Для достижения цели поставили следующие задачи:
–оценить лабильность морфологических характеристик лимфоидных бляшек стенки тонкой кишки поросят при применении штамма L. paracasei. –пронаблюдать показатели иммунных реакций крови (БАСК, ОФР) свиней на разных этапах эксперимента по применению штамма L. paracasei; –изучить цитоархитектонику морфофункциональных зон лимфоидных узелков стенки кишечника и мезентериальных лимфатических узлов свиней после применения пробиотического штамма L. paracasei;
–сравнить изменения морфологических характеристик лимфоидной ткани кишечника и иммунных реакций крови (БАСК, ОФР) свиней на разных этапах эксперимента по применению пробиотического штамма L. paracasei. –сравнить влияние лиофинизированной и жидкой форм пробиотического штамма L. paracasei на изучаемые в опыте показатели;
–выявить последствия применения штамма L. paracasei для морфологии лимфоидной ткани кишечника по достижении животными возраста планового убоя.
Научная новизна.
–впервые от отъма до планового убоя животных изучены реактивные изменения морфологии лимфоидных бляшек стенки кишечника поросят под влиянием пробиотического штамма L. paracasei;
–впервые получены данные о реактивных изменениях цитоархитектоники
морфофункциональных зон лимфоидных узелков стенки кишечника и
мезентериальных лимфатических узлов свиней после применения
пробиотического штамма L. paracasei и по достижению животными возраста планового убоя;
–впервые выявлены различия реактивных изменений морфологии
лимфоидной ткани кишечника и иммунных реакций крови (БАСК, ОФР) поросят под влиянием лиофинизированной и жидкой форм пробиотического штамма L. paracasei.
Теоретическая и практическая значимость работы. По результатам
исследований уточнены и дополнены имеющиеся знания о возрастных
изменениях состава клеток лимфоидного ряда в морфофункциональных
зонах лимфоидных узелков стенки кишечника и мезентериальных
лимфатических узлов. Полученные данные о влиянии лиофинизированной и
жидкой форм штамма L. paracasei на клеточный состав
морфофункциональных зон лимфоидных узелков стенки кишечника и мезентериальных лимфатических узлов могут учитываться при разработке пробиотического препарата на его основе. Отработанная нами методика может применяться в дальнейшем, при испытании новых штаммов для перспективных пробиотических препаратов. Полученные результаты могут быть использованы в учебном процессе при освещении морфологии, физиологии и иммунологии, а также, учитываться практикующими ветеринарными специалистами при применении пробиотических препаратов.
Методология и методы исследования. Объектом исследования выбран молодняк свиней крупной белой породы. Предметом исследования являлись морфологические параметры сгруппированных лимфоидных узелков стенки тонкой кишки, цитоархитектоника морфофункциональных зон лифоидных узелков стенки кишечника и мезентериальных лимфатических узлов, иммунные показатели крови поросят после применения лиофинизированной и жидкой форм пробиотического штамма Lactobacillus paracasei.
За методологическую основу взяты работы Панфилова А.Б. (2002),
Пономарва И.Н. (2010) Окуловой И.И. (2009). При проведении работы
применялись методы научного поиска, гомологичных групп,
морфометрические, гистологические, иммунологические, статистический анализ.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Морфология лимфоидных бляшек стенки тонкой кишки свиней при применении лиофинизированной и жидкой форм пробиотического штамма L. paracasei;
-
Цитоархитектоника морфофункциональных зон лимфоидных узелков стенки кишечника и мезентериальных лимфатических узлов свиней после применения лиофинизированной и жидкой форм пробиотического штамма L. paracasei;
-
Иммунные показатели крови (БАСК, ОФР) поросят при применении лиофинизированной и жидкой форм пробиотического штамма L. paracasei.
Личный вклад соискателя. Личное участие автора охватывает все
представленные в работе исследования. Автором самостоятельно выполнен
анализ научной литературы, сформулированы основные положения
диссертации, взят биоматериал от животных. Морфометрический анализ
выполнен автором на кафедре диагностики, терапии, морфологии и
фармакологии факультета ветеринарной медицины ФГБОУ ВО Вятская
ГСХА. Гистологические исследования и лабораторный анализ осуществлялся
соискателем на оборудовании лаборатории ветеринарии ФГБНУ
«Всероссийский научно-исследовательский институт охотничьего хозяйства и звероводства им. проф. Б.М. Житкова.
В публикации совместной с соавторами, значительная часть работы выполнена диссертантом, соавторы не возражают против использования представленных результатов для написания научных работ.
Апробация и реализация результатов работы. Диссертационная работа представлена, обсуждена и одобрена на расширенном заседании кафедры диагностики, терапии, морфологии и фармакологии Вятской ГСХА.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на 15-й и 16-й научных конференциях аспирантов и молодых учных «Науке нового века – знания молодых» Вятской ГСХА (2015, 2016гг.); научно-практической конференции молодых ученых: «Наука и инновации в АПК ХХI века», посвященной 145-летию Казанской ГАВМ имени Н.Э. Баумана (2018).
Публикации. По теме диссертации опубликовано пять работ, в материалах Всероссийских и Международных конференций, центральных журналах и отдельных изданиях. Из них две в научных изданиях рекомендованных перечнем ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 158
страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы,
материалов собственных исследований, обсуждения полученных
Морфология лимфоидной ткани брыжеечных лимфатических узлов (строение, развитие, цитоархитектоника)
Лимфатические узлы у млекопитающих являются универсальными биологическими фильтрами, которые обеспечивают антигенный контроль тканевой жидкости и лимфы, формируют в различных частях организма скопления или лимфоцентры, специализированные и адаптированные к особенностям потенциального регионального антигенного прессинга (Ikomi e.a., 2012; Jafarnejad e.a., 2015; Houston e.a., 2016). В лимфатических узелках, происходит клональная пролиферация В-лимфоцитов и образование клеток памяти (Rouse e.a., 1984; Palm e.a., 2016). Лимфатические узлы свиней в анатомическом плане представляют собою специфическую структуру, которая называется перевернутой. Они разделяют эту «привилегию» с гиппопотамами, носорогами, слонами и некоторыми морскими млекопитающими (Rothktter, 2009). Лимфатические узлы закладываются в конце второго – начале третьего месяца эмбрионального развития. Процесс начинается с накопления мезенхимных клеток вокруг кровеносных сосудов. Наружный слой мезенхимы дифференцируется в соединительнотканную капсулу, от которой внутрь узла отходят перегородочные тяжи — трабекулы. Капсула и трабекулы образуют коллагеновый каркас лимфатического узла (Вылков И.Н., 1980; Бородин Ю.И. с соавт., 1992; Андреева С.Д., 2007). Его внешний слой образован преимущественно плотной волокнистой неоформленной соединительной тканью, а внутренний – гладкой мускулатурой (Taher e.a., 1989; Abdel-Magied, 2001; Zidan M., Pabst R., 2012). Лимфатические узлы млекопитающих имеют дольчатую структуру (Gretz, 1997; Willard-Mack, 2006; Sainte-Marie, 2010). Она формируется в процессе эмбриогенеза в результате внедрения множества мезенхимных почек в просвет лимфатических синусов (Mebius, 2003). На сегодня не существует универсального термина для обозначения структурных единиц паренхимы лимфатических узлов. Ряд авторов называет структурно-функциоанльные единицы паренхимы «компартментами» от англ. compartment – отсек, отделение (Горышина Е.Н., Чага О.Ю., 1990 Belisle, Sainte-Marie, 1981; Sainte-Marie, 2010), но другие обозначают их как «лимфоидные дольки» (Kelly, 1975; Gretz e.a., 1997; Willard-Mack, 2006). Необходимо отметить, что термин «лимфоидная долька» является более предпочтительным и используется не только в морфологии, но и в области патологии и онкологии (Elmore, 2006; Chandrasekaran, King, 2014; Shipman e.a., 2017). Каждой дольке паренхимы сформированного лимфатического узла соответствует один афферентный лимфатический сосуд (Sainte-Marie, 2010). Общепринятое на сегодня представление о лимфоидной дольке (компартменте) лимфатических узлов было разработано на основе исследования зональной структуры паренхимы данных органов у приматов и некоторых видов лабораторных животных (Belisle, Sainte-Marie, 1981; Ikomi e.a., 2012; Butler e.a., 2016). Характерными чертами строения данных субъединиц являются четко выраженная морфологическая полярность с локализацией лимфатических узелков и мозговых тяжей по противоположным полюсам лимфоидных долек и их упорядоченное линейное расположение вдоль краевого синуса узла, что придает паренхиме лимфатических узлов слоистую структуру (Gunnes e.a., 1998; Iwasaki e.a., 2016; Butler e.a., 2016). Такая структура лимфатических узлов является морфологическим проявлением целого комплекса процессов иммунологической реактивности: миграции, кооперации, клональной пролиферации различных типов иммунокомпетентных клеток, а также антителообразования (Kowala, Schoefi, 1986; Margaris, Black, 2012). Известно также, что разноуровневый или гнездовой принцип локализации «компартментов» в лимфатических узлах свиньи домашней связан со специфической структурой капсулы узлов, которая образует многочисленные складки и инвагинации, глубоко внедряющиеся в их паренхиму. Кроме того, внутри складок капсулы располагаются лимфатические цистерны и интратрабекулярные лимфатические каналы, которые обеспечивают одномоментное равномерное поступление лимфы, как в поверхностные, так и в глубокие синусы узлов (Hoshi e.a., 1986; Gavrilin e.a., 2014).
Непосредственно под капсулой находится краевой синус, сюда поступает лимфа по афферентным (приносящим) лимфатическим сосудам. Из краевого синуса лимфа поступает в синусы промежуточные, которые в свою очередь пронизывают всю толщу лимфатического узла. Из промежуточных синусов лимфа собирается в эфферентном (выносящем) лимфатическом сосуде, который, выносит ее в грудной проток. Место выхода сосуда называется воротами узла. Здесь же в воротах лимфатического узла проходят и кровеносные сосуды. У различных видов животных степень развития капсулы неодинакова (Галактионов В.Г., 2005; Чумаков В.Ю., 2008). Архитектоника сетей ретикулярных волокон краевых участков паренхимы, непосредственно граничщих с синусами, расположенными вдоль трабекул, аналогична ретикулярным сетям в корковом плато (интерфолликулярной зоне) лимфатических узлов у большинства видов млекопитающих. Интерфолликулярная зона вместе с паракортикальными тяжами именуется ещ зоной транзита и межклеточного взаимодействия (взаимодействие лимфоцитов с антигенпрезентирующими клетками). Для данной зоны характерна среднепетлистая ретикулярная сеть с большим количеством грубых волокнистых тяжей, которые пронизывают перитрабекулярные синусы и достигают внутреннего слоя трабекул. В зоне транзита располагаются многочисленные широкие сосуды, представляющие собою венулы с высоким эндотелием (De Bruyn, Cho, 1990; Ruddle, 2016). Под капсулой располагается корковое вещество лимфатического узла, содержащая преимущественно В-лимфоциты, это тимуснезависимая зона. Для коркового слоя характерна компактная укладка большого скопления малых лимфоцитов в лимфоидные узелки, в которых происходит пролиферация В-лимфоцитов и антителообразование.
В ходе иммунного ответа первичные фолликулы значительно увеличиваются в размере за счет пролиферации клеток, при этом образуется герминативный центр, или как его называют – зародышевый центр или центр размножения (Кульберг А.Я., 1985; Манько В.М., 2011). Развитие зародышевых центров происходит только под влиянием антигенной стимуляции. При прекращении поступления антигенов с лимфой размеры герминативного центра уменьшаются, а через 15 недель он и вовсе исчезает (Сапин М.Р., 1987). В герминативных центрах в основном концентрируются В-лимфоциты (Медуницин Н.В., 1980). Внешне герминативный центр представляет собою сферообразную структуру, которая формируются вдоль лимфатических синусов на основе коркового плато. В цитологическом понимании, это зона митотического деления, пролиферации антигенстимулированных В - лимфоцитов (В-зависимая зона). Далее, ближе к центру паренхимы лимфатических узлов располагаются относительно крупные образованиями глубокой коры (Т-зоны), которые непосредственно не контактируют с системой внутриузловых синусов (Kaldjian e.a., 2001; Katakai e.a., 2004; Palm e.a., 2016). Также эти образования именуются паракортикальной зоной (Галактионов В.Г., 2005). Образованная диффузной лимфоидной тканью эта зона относится к тимусзависимой и заполнена Т лимфоцитами. Как и в случае с GALT эти Т-лимфоциты принадлежат к рециркулирующему фонду клеток. (Петров Р.В., 1987). Участки паренхимы, называемые зоной пролиферации Т-лимфоцитов вместе с паракортикальными тяжами, которые находятся на их периферии, формируют так называемые единицы глубокой коры (Belisle, Sainte-Marie, 1981). В этой зоне (глубокой коре) выделяет центр и периферию. Они отличаются друг от друга морфологическими свойствами. В центре глубокой коры почти нет ретикулярных волокон, а на периферии они образуют плотную сеть. В обеих подзонах зонах содержатся, главным образом, малые лимфоциты. В паракортикальной зоне встречаются особые разновидности макрофагов – интердигитальные клетки. Они обладают уникальными морфологическими особенностями стромальных элементов, имеют многочисленные сплетающиеся пальцевидные отростки. Также считается, что с помощью особых гликопротеидов эти клетки индуцируют пролиферацию и дифференциацию Т-лимфоцитов в эффекторные клетки клеточного иммунитета (Пол У., 1987). Транзит лимфоцитов в периферические участки глубокой коры (паракортикальные тяжи), и в корковом плато осуществляется через стенки венул с высоким эндотелием. Так-же в этих зонах происходит взаимодействие (премирование) лимфоцитов с антигенпрезентирующими клетками (De Bruyn, Cho, 1990; Platt, Randolph, 2013; Ruddle, 2016; Ager, 2017).
Цитоморфология лимфоидных узелков стенки кишечника поросят в возрасте 64 суток под влиянием штамма L. paracasei
Изменения клеточного состава морфофункциональных зон сгруппированных лимфоидных узелков начали отслеживать сразу по окончании второго курса дачи поросятам штамма L. paracasei в возрасте животных 64 суток.
Во взятом от кишечной трубки биоматериале рассматривали изменения клеточного состава морфофункциональных зон лимфоидного узелка, именуемых купол и герминативный центр (рисунки 11, 12). Анатомически купол выступает в кишечный просвет и отделн от него покрывающим пластом кишечных энтероцитов. Из всех морфофункциональных зон лимфоидного узелка, это участок наиболее плотного контакта с внешней средой.
Цитоархитектоника купола лимфоидного узелка организована клетками лимфоидного ряда, основными из которых являются лимфоциты (рисунок 13). В нашем эксперименте приоритетный интерес представляла общая цитоархитектоника функциональных зон, поэтому данная группа клеток рассматривалась под общим названием и учитывались единым пулом. Лимфоциты – это округлые клетки диаметром от 5 до 14 мкм, иногда слегка вытянутые за счт перераспределения цитоплазмы. Основной внутренний объм занимает округлое, слегка вытянутое ядро. В ядре содержится одно ядрышко, гетерохроматин в большинстве свом тяготеет к кариолемме и собран в крупные глыбки. Цитоплазма cлабобазофильная, узкая, е структура не всегда просматривается. Лимфоцитами представлено порядка 90% всей ткани купола лимфоидных узелков во всех отделах кишечника. На долю оставшихся 10% клеток, в зависимости от отдела кишечника, в различном количестве приходятся иммуно- и плазмобласты, зрелые и незрелые плазматические, ретикулярные клетки, макрофаги, митотически делящиеся, тучные, недифференцированные клетки.
Герминативный центр представляет интерес как зона - индикатор антигенного поступления. Это тимуснезависимая зона, основная масса лимфоидной ткани здесь представлена лимфоцитами, их доля варьирует вокруг значения 80%, в зависимости от участка кишечного тракта (рисунок 10). Суммарная доля остальных типов клеток в герминативном центре составляет порядка 20% (таблицы 4-9).
Наиболее крупные клетки лимфоидного ряда – иммунобласты. Имеют правильную округлую форму с четкими контурами. Большую часть внутреннего объма занимает крупное, слегка вытянутое ядро, в центре которого находится одно интенсивно окрашенное ядрышко, реже может быть два ядрышка. Хроматин распределен по объему ядра сравнительно равномерно. При световой микроскопии цитоплазма представляет собою очень узкую полосу вокруг ядра. Наибольшее количество этих клеток встречается в герминативных центрах лимфоидных узелков двенадцатиперстной кишки –9%. Плазмобласты - довольно крупные, практически всегда округлые клетки, примерно 20 мкм в диаметре. Ядро чаще расположено центрально, занимает значительную часть внутреннего объма клетки, содержит от 1 до 3 ядрышек. Кариоплазма светлая, бедная гетерохроматином. Цитоплазма базофильная не широкая, характерной е особенностью у плазмобласта является перинуклеарная зона просветления. Количество этих клеток сильно варьируется в зависимости от участка кишечника. Максимальное их количество отмечено в герминативных центрах лимфоидных узелков ободочной кишки – более 14 %, хотя на других участках они представлены в значительно меньшей степени (таблицы 4-9).
Незрелые плазматические клетки (проплазмоциты) имеют округлое, иногда овальное ядро центрально расположенное. Хроматин рыхлый, эу- и гетерохроматин перемешаны, но мелкие глыбки гетерохроматина сосредоточены возле кариолеммы. Цитоплазма развита хорошо, окружает ядро широкой полоской. Просматриваются цитоплазматические включения. Максимальное количество данного типа клеток обнаружено в герминативных центрах лимфоидных узелков стенки двенадцатиперстной кишки – 2,2 % (таблицы 4-9), в других отделах кишечника они встречались значительно реже.
Зрелые плазматические клетки (плазмоциты) являются маркерами, сигнализирующими о наличии иммунного ответа организма на вторжение инфекционного или вирусного антигена. Обнаружение их в несвойственных органах расценивается как заболевание. Но именно лимфоидные узелки стенки кишечника являются характерными местами локализации плазмоцитов. Зрелые плазматические клетки имеют не крупное ядро, с большим количеством конденсированного хроматина. Ядро смещено к одному из полюсов. Ядрышки встречаются не всегда. Гетерохроматин формирует характерную колесовидную картину. Цитоплазма развита очень хорошо, основная е масса собрана на противоположном от ядра полюсе. Просматриваются цитоплазматические включения. Данный тип клеток также как их предшественники, встречается в максимальном количестве в герминативных центрах лимфоидных узелков, где их содержание варьирует около значения 2,5% (таблицы 4-9).
Ретикулярные клетки, являясь основой стромального каркаса, всегда присутствовали в рассматриваемых нами структурах у всех групп животных на всех отделах кишечной трубки, хотя их количеств редко достигало 3% (таблицы 4-9). Ретикулярные клетки имеют вытянутое, не правильной формы ядро с 1-2 ядрышками. Основное количество гетерохроматина сконденсировано вдоль кариолеммы. Эухроматин равномерно распределен по объму ядра. Цитоплазма широкая, хорошо развитая. Просматриваются цитоплазматические включения. Обнаруживаются участки гранулярной эндоплазматической сети. В цитоплазме проявляются секреторные гранулы. При световой микроскопии цитоплазматические отростки просматриваются слабо, их число от трх до семи.
Макрофаги лимфоидных узелков стенки кишечника - это крупные клетки, имеющие четкие границы и неровные края. Ядро макрофага крупное, округлое или слегка вытянутое. Кариоплазма содержит крупные глыбки гетерохроматина. Цитоплазма хорошо развита, просматриваются цитоплазматические включения. Также в цитоплазме обнаруживается до 20 секреторных пузырьков. Эти клетки присутствуют в герминативных центрах, где на их долю приходится в среднем 1,4% в зависимости от участка кишечника (таблицы 4-9).
Тучные клетки имеют овальную форму, с четкими контурами. Ядро занимает значительную часть клеточного объма. Оно может быть расположено в центре, но чаще смещено. Содержание гетерохроматина умеренное. Цитоплазма хорошо развита, просматриваются цитоплазматические включения. Характерной особенностью является наличие в цитоплазме множества пенистых секреторных гранул. Плазмолемма не ровная, имеет выпячивания и инвагинации. Данный тип клеток встречается в куполе лимфоидного узелка. Их максимально количество - 0,8%, обнаружено в куполе лимфоидного узелка стенки тощей кишки (таблица 5).
Митотически делящиеся клетки можно встретить в любой зоне лимфоидных образований и на любом участке кишечника. Максимальное их количество -0,6% отмечено в герминативном центре лимфоидного узелка стенки двенадцатиперстной кишки (таблица 4). Однако встречались лимфоидные узелки, где данные клетки не обнаруживались ни в куполе, ни в герминативном центре.
Данные по цитоархитектонике сгруппированных лимфоидных узелков стенки двенадцатиперстной кишки 64-суточных поросят, собранные во время опыта по применению экспериментального штамма L. paracasei В-11821, представлены таблице 4. В куполе отмечено снижение количества ретикулярных клеток в опытных группах: 1,8±0,37 в опытной №1 и 1,6±0,24 в опытной №2, против 2,6±0,24 в контрольной. Отличие показателя опытной группы №2 от контроля вошло в рамки критерия статистической значимости при p0,05. Незначительное снижение отмечано в содержании клеток с фигурами митоза - 0,2±0,2 в опытной №1 и нет в опытной №2 против 0,4±0,24 в контрольной. Данные изменения не вошли в рамки критерия статистической значимости при p0,05. Наблюдаемое относительное снижение количества ретикулярных клеток и клеток с фигурами митоза сопровождалось увеличением количества макрофагов: 0,6±0,24 в опытных группах №1 и №2 против нуля в контрольной. Данные по обеим опытным группам вошли в рамки критерия статистической значимости при p0,05. Незначительно возросло содержание: зрелых плазматических клеток-1,2±0,20 в опытной №1 и 1,4±0,24 в опытной №2, против 1,0 в контрольной; и плазмобластов- 1,0 в опытной №2 против 0,6±0,24 в опытной № 1 и контрольной. Данные различия не вошли в рамки критерия статистической значимости при p0,05.
Цитоморфология мезентериальных лимфатических узлов поросят в возрасте 64 суток под влиянием L. paracasei
Изменения клеточного состава морфофункциональных зон мезентеральных лимфатических узлов начали отслеживать сразу по окончании второго курса дачи поросятам штамма L. paracasei в возрасте животных 64 суток.
В брыжейке на 1,5-2,0 см выше стенки тощей кишки находится 10-15 полинодозных лимфатических узлов (рисунок 18). Они представляют собою крупные лентовидные конгломераты длиною до 50 см, содержащие по 10-40 nodes (узлов) в каждом. Форма лимфатических nodes (узлов), входящих в полинодозный лимфатический узел округлая, цвет белсый. В средней части кишки полинодозные лимфатические узлы длиннее расположенных краниальнее и каудальнее. Брыжейка тонкая, прозрачная, без кровоизлияний и затемнений.
Лимфатические узлы ободочной кишки (рисунок 17)располагаются в подвздошно-слепо-ободочной связке на расстоянии 1,0-1,5 см от стенки кишки. Их количество варьирует от 12 до 23. Все узлы мононодозные, округлой формы, белого цвета, окружены тонкой капсулой и погружены в развитую соединительную и жировую ткань. При гистологическом исследовании видно, что корковое вещество представлено первичными и вторичными лимфоидными узелками. Окружающая лимфоидные узелки корона состоит из нескольких рядов малых лимфоцитов. На гистосрезе от взятого биоматериала лимфатических узлов наблюдали изменения клеточного состава морфофункциональных зон именуемых: корковое вещество (кора); герминативный центр; паракортикальная зона; мозговое вещество. Цитоархитектоника всех зон лимфатического узла представлена клетками лимфоидного ряда, гладкими миоцитами, эндотелиоцитами, клетками фибробластического ряда. В нашем эксперименте учитывались только клетки лимфоидного ряда. Основной тип клеток данного ряда -лимфоциты рассматривалась под общим названием и учитывались единым пулом. Лимфоциты – округлые клетки диаметром от 5 до 14 мкм, иногда слегка вытянутые за счт перераспределения цитоплазмы. Основной внутренний объм занимает округлое, слегка вытянутое ядро. В ядре содержится одно ядрышко, гетерохроматин в большинстве свом тяготеет к кариолемме и собран в крупные глыбки. Цитоплазма cлабобазофильная, узкая, е содержимое просматриваются слабо. Лимфоциты составляет более 90% клеток лимфоидного ряда коры, паракортикальной зоны и мозгового вещества лимфатических узлов тощей и ободочной кишок. В герминативных центрах их доля чуть больше 80% (таблицы 16-19). Оставшиеся менее 20% включают иммуно- и плазмобласты, зрелые и незрелые плазматические, ретикулярные клетки, макрофаги, митотически делящиеся, тучные, а также недифференцированные клетки.
Наиболее крупные клетки лимфоидного ряда – иммунобласты. Имеют правильную округлую форму с четкими контурами. Большинство внутреннего объма занимает крупное, слегка вытянутое ядро, в центре которого находится одно интенсивно окрашенное ядрышко, реже может быть два ядрышка. Весь хроматин распределен по объему ядра сравнительно равномерно. При световой микроскопии цитоплазма представляет собою очень узкую полосу вокруг ядра, е содержимое просматриваются слабо. Максимальное количество иммунобластов у контрольной группы обнаружено в лимфатических узлах тощей кишки - в герминативных центрах 2,2 ±0,20%, а в лимфатических узлах ободочной кишки - в парокортикальной зоне 1%. (таблицы 16-19).
Плазмобласты - довольно крупные, округлые клетки. Ядро чаще расположено центрально, занимает значительную часть внутреннего объма клетки, содержит от 1 до 2 ядрышек. Кариоплазма светлая, бедная гетерохроматином. Цитоплазма базофильная, не широкая, не однородная. Характерной е особенностью у плазмобласта является перинуклеарная зона просветления. Их количество сильно варьируется в зависимости от участка кишечника. Максимальное количество плазмобластов у контрольной группы обнаружено в герминативных центрах лимфатических узлов: 10,4±0,51% тощей и 8,6±0,68% ободочной кишки (таблицы 16-19).
Незрелые плазматические клетки (проплазмоциты) имеют округлое, иногда овальное ядро центрально расположенное. Хроматин рыхлый, эу- и гетерохроматин перемешаны, но мелкие глыбки гетерохроматина сосредоточены возле кариолеммы. Цитоплазма развита хорошо, окружает ядро широкой полоской, не однородна. Максимальное количество незрелых плазматических клеток у контрольной группы обнаружено в герминативных центрах лимфатических узлов: 1,4±0,40% тощей и 1,2±0,20% ободочной кишки (таблицы 16-19).
Зрелые плазматические (плазмоциты) – клетки являющиеся маркерами, сигнализирующими о наличии иммунного ответа организма на вторжение инфекционного или вирусного антигена. Лимфатические узлы являются характерными местами локализации плазмоцитов. Зрелые плазматические клетки имеют не крупное ядро, с большим количеством конденсированного хроматина. Ядро смещено к одному из полюсов. Ядрышки встречаются не всегда. Гетерохроматин формирует характерную колесовидную картину.
Цитоплазма развита очень хорошо, основная е масса собрана на противоположном от ядра полюсе, не однородна, заполнена гранулярной эндоплазматической сетью. Максимальное количество зрелых плазматических клеток у контрольной группы обнаружено, в герминативных центрах и паракортикальных зонах лимфатических узлов тощей кишки 1,61,2±0,24% а в лимфатических узлах ободочной кишки в паракортикальных зонах 1,2±0,20% и мозговом веществе 1,2±0,37% (таблицы 16-19).
Ретикулярные клетки, являясь основой стромального каркаса, присутствуют во всех морфофункциональных зонах лимфатических узлов у всех групп животных. Максимальное их процентное соотношение у контрольной группы обнаружено в корковом веществе лимфатических узлов 4,6±0,51% тощей и 4,8 ±0,51% ободочной кишки (таблицы 16-19). Ретикулярные клетки имеют вытянутое, не правильной формы ядро с 1-2 ядрышками. Основное количество гетерохроматина сконденсировано вдоль кариолеммы. Эухроматин равномерно распределен по объму ядра. Цитоплазма широкая, хорошо развитая, не однородная. В цитоплазме проявляются секреторные гранулы. При световой микроскопии цитоплазматические отростки просматриваются слабо, их число от трх до семи.
Макрофаги лимфатических узлов - это крупные клетки, имеющие четкие границы, и неровные края. Ядро макрофага крупное, округлое или слегка вытянутое. Кариоплазма содержит крупные глыбки гетерохроматина. Цитоплазма хорошо развита, не однородна. В ней обнаруживается до 20 секреторных пузырьков. Максимальное их количество у контрольной группы обнаружено в герминативных центрах мезентериальных лимфатических узлов 4,6±0,51% тощей 2,6±0,51% ободочной кишки (таблицы 16-19).
Клетки на стадии митотического деления у контрольной группы обнаруживаются не всегда. В мезентериальных лимфатических узлах тощей кишки максимальное их количество 1,06±0,32% отмечено в паракортикальных зонах. В мезентериальных лимфатических узлах ободочной кишки максимальное их количество 0,8±0,20% отмечено в герминативных центрах (таблицы 16-19). Данные по цитоархитектонике морфофункциональных зон мезентериальных лимфатических узлов тощей кишки 64 суточных поросят, собранные во время опыта по применению экспериментального штамма L. paracasei В-11821, представлены таблицах 16-17.
В корковом веществе при сравнении показателей в опытных группах заметно относительное снижение процентного соотношения ретикулярных клеток – 3,6±0,24 в опытной №1 и 2,2±0,37 в опытной №2, против 4,6±0,51 в контрольной. Показатель от опытной группы №2 вошел в рамки критерия статистической значимости при p0,05. Заметно увеличилось содержание макрофагов - 0,2±0,20 в опытной №1 и 1,4±0,24 в опытной №2 против 0,0 в контрольной. Данные опытной группы №2 соответствуют критерию статистической значимости при p0,05. (таблица 16)
Иммунологические показатели крови поросят в ходе опыта по применению штамма L. paracasei
Измерение бактерицидной активности сыворотки крови поросят в эксперименте провели по четырм возрастным периодам. Полученные результаты сведены в таблицу 24. На их основе построен график (рис. G.1.), наглядно демонстрирующей динамику изменения показателей БАСК по группам и возрастам животных, участвующих в опыте по применению штамма L. paracasei.
Первое измерение бактерицидной активности сыворотки осуществили у животных возрастом 29 суток, сразу после того, как сформировали контрольную и опытные группы, до дачи животным экспериментального штамма L. paracasei В-11821. Показатель угнетения роста и развития микроорганизмов в сыворотке крови контрольной группы составил 77,3±1,65, от опытных групп получили значения близкие к этому (таблица 24, рисунок 20).
Второе измерение провели после окончания первого курса дачи животным экспериментального штамма L. paracasei В-11821, в возрасте животных 40 суток. Здесь показатель угнетения роста и развития микроорганизмов в сыворотке крови контрольной группы составил 72,86±1,34, а значения опытных групп № 1 и 2 составили 75,28±1,07 и 76,15±1,14 (таблица 24). На графике (рисунок 20) отображено, что при возрасте поросят 40 суток, показатели опытных групп № 1 и 2 выше контроля, но при статистической обработке, их разница не соответствует критерию статистической значимости при Р0,05.
Третьим этапом измерения стало окончание второго курса дачи поросятам экспериментального штамма L. paracasei В-11821, в возрасте животных 64 суток. Значения показателя угнетения роста и развития микроорганизмов в сыворотке крови в экспериментальных группах составили 55,59±1,17 в опытной №1, и 58,59±1,29 в опытной №2, против 51,43±1,71 в контрольной (таблица 24, рисунок 20). Отличие показателя опытной группы №2 от контроля вошло в рамки критерия статистической значимости при p0,05.
Заключительный этап измерения БАСК соответствует достижению животными возраста планового убоя - 7 месяцев. Здесь показатель угнетения роста и развития микроорганизмов в сыворотке крови контрольной группы составил 40,76±1,31, а значения опытных групп № 1 и 2 составили 42,24±1,45 и 43,38±1,40 (таблица 24). На графике (рисунок 20) отображено, что при возрасте поросят 7 месяцев, показатели опытных групп № 1 и 2 не значительно выше контроля. При статистической обработке установлено, что разница значений опытных и контрольной групп не соответствует критерию статистической значимости при Р0,05.
Измерение активности фагоцитов крови в ОФР (рисунки 21, 24) поросят в эксперименте проводили одновременно с измерением БАСК по четырм возрастным периодам. Результат учитывали по среднему фагоцитарному числу и опсоно –фагоцитарному индексу. Полученные в эксперименте данные сведены в таблицу 25.
На основе полученных данных построены графики (рисунки 22, 23), демонстрирующие динамику изменения показателей ОФР по группам и возрастам животных, участвующих в опыте по применению штамма L. paracasei.
Первую постановку ОФР провели на крови животных возрастом 29 суток, сразу после формирования опытных и контрольной групп, до дачи животным штамма L. paracasei. В контрольной группе среднее число фагоцитированных частиц на нейтрофил составило 6,74±0,48, ОФИ дал результат 21,75±0,75 (таблица 25). На графиках (рисунки 22, 23) отображено, что в возрасте поросят 29 суток, показатели опытных групп № 1 и 2 выше контроля. При статистической обработке установлено, что разница значений опытных и контрольной групп не соответствует критерию статистической значимости при Р0,05.
Второе измерение провели после окончания первого курса дачи животным штамма L. paracasei, в возрасте животных 40 суток. Диаграмма (рисунок 22) иллюстрирует число фагоцитированных частиц на нейтрофил: 12,42±0,26 в опытной группе № 1 и 12,64±0,19 в опытной группе №2, против 11,8±0,26 в контрольной. Отличие показателя опытной группы №2 от контроля вошло в рамки критерия статистической значимости при p0,05 (таблица 25).
На диаграмме (рисунок 23) представлен учт реакции по ОФИ. В возрасте животных 40 суток получены различия групп: 27,60±0,93 в опытной №1, и 28,4±0,93 в опытной №2, против 26,8±0,73 в контрольной. После математической обработки отличия показателей ОФИ опытных группы от контроля не вошли в рамки критерия статистической значимости при p0,05 (таблица 25).
Третье измерение провели после окончания второго курса дачи животным штамма L. paracasei, в возрасте животных 64 суток. Диаграмма (рисунок 22) иллюстрирует число фагоцитированных частиц на нейтрофил в этом возрасте: 9,05±0,45 в опытной группе № 1 и 9,480,27 в опытной группе №2, против 7,84±0,24 в контрольной. Отличие показателей опытных группы от контроля вошло в рамки критерия статистической значимости при p0,05 (таблица 25). На диаграмме (рисунок 23) отражено заметное различие значений ОФИ опытных групп от контроля в возрасте животных 64 суток: 23,4±1,03 в опытной группе № 1, и 25,4±0,51 в опытной группе №2, против 22,0±0,45 в контрольной. После математической обработки различия показателей ОФИ опытной группы №2 от контрольной дали соответствие критерию статистической значимости при p0,05 (таблица 25).
Заключительная постановка ОФР соответствует достижению животными возраста планового убоя - 7 месяцев. На диаграмме (рисунок 22) отмечено снижение разности в опытных и контрольной группах числа фагоцитированных частиц в этом возрасте: 8,39±0,42 в опытной № 1 и 8,62±0,36 в опытной №2, против 8,07±0,16 в контрольной. Отличие показателей опытных группы от контроля не вошло в рамки критерия статистической значимости при p0,05 (таблица 25). На диаграмме (рисунок 23) отражены значения ОФИ опытных групп от контроля в возрасте животных 7 месяцев: 24,6±0,93 в опытной № 1, и 25,0±0,71 в опытной №2, против 23,2±0,37 в контрольной. Отличия показателей опытных группы от контроля не вошли в рамки критерия статистической значимости при p0,05 (таблица 25).
Анализируя динамику изменения иммунологических показателей крови поросят в опыте по применению штамма L. paracasei, получили следующие выводы:
Отмечено статистически значимое, в сравнении с контролем, усиление БАСК 64 суточных поросят опытной группы №2 - получавшей жидкую форму препарата.
Отмечено статистически значимое, в сравнении с контролем, усиление ОФР у 40 и 64 суточных животных - во время и сразу после окончания прима ими штамма L. paracasei.
Степень усиления иммунологических реакций крови поросят зависит от этапа дачи штамма/.. paracasei:
- наибольшая отмечена у 64 суточных животных, закончивших второй курс прима штамма L. paracasei.
Степень усиления иммунологических реакций крови поросят зависит от формы дачи штамма/., paracasei:
- наибольшая отмечена у животных, получавших жидкий штамм L. paracasei.
По достижении животными возраста 7 месяцев, различия показателей иммунологических реакций крови обеих опытных групп от контрольной, статистически не значимы.