Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 13
1.1 Значение трансплантации эмбрионов в воспроизводстве крупного рогатого скота 13
1.2 Морфофункциональная характеристика яичников коров-доноров при индукции полиовуляторной реакции гонадотропными препаратами 15
1.3 Извлечение эмбрионов у коров-доноров 23
1.4 Морфофункциональная оценка эмбрионов крупного рогатого скота 26
1.5 Нехирургическая пересадка эмбрионов и причины эмбриональной смертности 29
Глава 2 Материалы и методы исследований 36
Глава 3 Результаты исследований и их обсуждение 47
3.1 Эхографическая характеристика яичников коров-доноров эмбрионов 47
3.2 Эффективность индукции суперовуляции у коров-доноров эмбрионов при применении различных схем введения препарата фолликулостимулирующего гормона 53
3.3 Оценка результативности вымывания эмбрионов в зависимости от метода извлечения и суперовуляторной реакции яичников коров–доноров эмбрионов 71
3.4 Сравнительная морфологическая оценка эмбрионов коров-доноров мясного и молочного направления продуктивности 80
3.5 Оценка применения устройства для аппликации эмбрионов крупного рогатого скота при эмбриотрансфере 105
3.6 Обсуждение полученных результатов 111
Заключение 123
Практические рекомендации 125
Список литературы 127
Приложения 155
- Морфофункциональная характеристика яичников коров-доноров при индукции полиовуляторной реакции гонадотропными препаратами
- Эхографическая характеристика яичников коров-доноров эмбрионов
- Оценка результативности вымывания эмбрионов в зависимости от метода извлечения и суперовуляторной реакции яичников коров–доноров эмбрионов
- Обсуждение полученных результатов
Введение к работе
Актуальность проблемы. Актуальной проблемой современного
животноводства является полное удовлетворение потребностей населения высококачественными продуктами питания. По прогнозам ученных к 2030 году население земли достигнет 9,5 млрд. людей, что в свою очередь подтолкнет на увеличение мирового производства продуктов питания с меньшими ресурсами и как следствие, повлечет за собой большое количество проблем связанных с их производством (Keyzer M.A., Merbis M.D., 2005; Capper, 2011; Thorne, W.J., 2013).
Для увеличения производства мясомолочной продукции необходимо использовать биотехнологические методы ускоренного воспроизводства крупного рогатого скота, а так же проводить строгий отбор и выбраковку животных с учетом их генетического потенциала (Самоделкин, А.Г. и соавт., 1996; Курманов Б.А., Балуанов А.К., 2012; Thorne W.J., 2013). Но при увеличении высокопродуктивного поголовья крупного рогатого скота существует значимое препятствие, выражающееся в малоплодии и длительном периоде протекания стельности. При этом, самки крупного рогатого скота обладают огромным генеративным потенциалом, который измеряется сотнями тысяч яйцеклеток, но только незначительная их часть реализуется до конца хозяйственного пользования животного (Сковородин Е.Н., 1989, 1996; Еремин С.П., 1990; Джамалова Г.А. и соавт., 1996; Воробьев Д.Н., 2005; Некрасов Г.Д., 2007; Байтлесов Е.У., 2008).
Трансплантация эмбрионов открывает огромные возможности в
реализации репродуктивно-биологического потенциала животных, при
использовании индивидуально-направленного генетического резерва с
хозяйственнополезными признаками, с заданными фенотипическими и генотипическими характеристиками, а так же последующего максимального тиражирования их в стадах реципиентов с наименее ценными показателями.
В трансплантации эмбрионов по технологии in vivo главным звеном
являются полученные в результате индукции полиовуляции яйцеклетки,
прошедшие оплодотворение, образование зиготы и е дальнейшее развитие в
течение стадий дробления и бластуляции. Знания морфологии яичников и
эмбрионов позволяет прогнозировать эмбриопродуктивность донора,
контролировать процесс эмбриосбора при извлечении зародышей и служит критерием оценки качества эмбрионов с помощью, которой определяется дальнейшая судьба эмбриона (Сергеев В.А., 1997; Баймишев Х.В., 1999; Бабинцева Т.В. и соавт., 2012; Полянцев Н.И., Афанасьев А.И., 2012).
Несмотря на достигнутые успехи в технологии трансплантации эмбрионов, актуальными остаются вопросы изыскания новых методов отбора доноров и реципиентов, индукции суперовуляции с более высоким выходом эмбрионов, снижения трудоемкости процесса и стресс воздействия на животных.
Рекомендации к широкому внедрению в практику трансплантации эмбрионов новых методов и приемов эмбриотрансфера возможно только после
досконального изучения их воздействия на уровень эмбриопродуктивности, эмбриосбора, качества и приживляемости эмбрионов.
На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что проведение морфологических исследований яичников и эмбрионов, усовершенствование технического оборудования для извлечения, сбора и пересадки эмбрионов являются актуальными при трансплантации эмбрионов.
Степень разработанности темы. В настоящее время значительно возрос интерес к исследованию морфологии яичников и эмбрионов крупного рогатого скота. Большая часть работ посвящена изучению структурно-функциональным изменениям яичников и эмбрионов (Kayacik V., 2005; Mapletoft R. J., 2006, 2015; Бабинцева Т.В., 2012).
Однако, работ по комплексному изучению морфофункциональных особенностей яичников и эмбрионов коров–доноров, исключающих инвазивное вмешательство, мы не встретили, что и предопределило направление наших исследований.
Цель работы состояла в изучении морфологии яичников, эмбрионов крупного рогатого скота мясного и молочного направления продуктивности, полученных в процессе трансплантации эмбрионов с использованием усовершенствованных схем индукции полиовуляции, инструментов и оборудования для извлечения, сбора и пересадки эмбрионов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1.тОпределить достоверность метода ультразвуковой визуализации, как инструмента изучения морфологии яичников, структур фолликулогенеза и лютеогенеза у доноров на этапе суперовуляции и возможность использования эхографических данных в качестве критериев для прогнозирования потенциала эмбриопродуктивности и фактического эмбриосбора;
2.тОпределить влияние метода индукции полиовуляции у коров-доноров,
обеспечивающего пролонгацию действия фолликулостимулирующих
препаратов на морфологию яичников и качество эмбрионов;
3.тРазработать метод оценки жизнеспособности зародышей при культивации эмбрионов с помощью множественной бластографии;
4.тПодтвердить физиологичность, малоинвазивность, экономическую
целесообразность способов индукции полиовуляции с использованием
пролангатеров у коров – доноров, а также усовершенствованных способов извлечения, оценки качества и пересадки эмбрионов.
Научная новизна. В результате исследований на фактическом материале, получены новые, теоретически обоснованные и апробированные в условиях производства данные по морфологии яичников и эмбрионов, полученных от коров-доноров при усовершенствованных способах индукции полиовуляции, извлечения, сбора и пересадки эмбрионов.
Полученные данные ультразвуковой визуализации яичника,
характеризующие функциональную активность гаметогенного органа,
позволили использовать их в качестве критерия потенциального уровня
эмбриопродуктивности, а также в качестве критерия эмбриосбора перед вымыванием.
Полученные данные по морфологии эмбрионов с помощью
множественной бластографии при культивировании, позволили использовать их в качестве экспресс-метода определения жизнеспособности извлеченного зародыша.
Выявлены различия в морфологии и скорости развития эмбрионов, полученных от коров молочного и мясного направления продуктивности.
С использованием данных по морфологии яичников и эмбрионов доказана
физиологичность, пониженная стрессорность, технологическая и
экономическая эффективность метода полиовуляции с использованием пролонгатора и авторских устройств усовершенствующих эмбриосбор, поиск и пересадку эмбрионов.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты работы представляют научный и практический интерес, так как изучены морфология яичников коров-доноров и функциональный ответ на введенные гонадотропные препараты, с последующей морфологической оценкой эмбрионов на стадии деления и бластуляции.
С помощью ультразвуковой эхографии получены новые сведения о морфофункциональном состоянии яичников коров-доноров при полиовуляции. Данные о структуре эмбрионов при культивировании на стадии деления и бластуляции могут быть положены в основу экспресс-метода определения жизнеспособности.
Результаты исследования могут быть использованы для разработки новых методических подходов и схем индукции полиовуляторной реакции яичников коров-доноров эмбрионов, извлечения, оценки и пересадки эмбрионов.
Основные результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс и используются в научно-исследовательской работе кафедры незаразных болезней животных факультета ветеринарной медицины Оренбургского аграрного университета, факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Западно-Казахстанского аграрно-технического университета имени Жангир хана, в производственной деятельности ряда лабораторий по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота России, Белоруссии и Казахстана.
Методология и методы исследования. В процессе исследований
применяли современный методологический подход к изучению морфологии
яичников коров-доноров и эмбрионов на стадиях дробления и бластуляции. С
целью изучения была проведена серия опытов с использованием
экспериментальных животных. Индукцию полиовуляции у коров-доноров
контрольной группы проводили при использовании восьмикратного введения
гонадотропных препаратов, а в опытных группах, с использованием
пролонгирующих веществ, таких как поливиниловый спирт и
полиэтиленгликоль с гонадотропином вводили однократно. Морфологическую
оценку полиовуляторной реакции яичников коров-доноров осуществляли с помощью эндоректальной пальпации ультразвуковой визуализации.
Извлечение зародышей у коров-доноров осуществляли тремя способами: гравитационным, шприцеванием и замкнутого цикла циркуляции с помощью авторского устройства для извлечения эмбрионов. Морфологию полученных зародышей оценивали микроскопией с помощью бинокулярного микроскопа Nicon при увеличении Х 80. Определение жизнеспособности эмбрионов оценивали методом множественной бластографии при кратковременном культивировании в условиях биостанции «Nicon Bio Statio IMQ». Пересадку зародышей осуществляли нехирургическим способом катетерами Кассу и авторским катетером для аппликации эмбрионов.
Методологической основой изучения проблемы является комплекс
морфологических методов, включающий ряд биологических, клинических,
эхографических, морфометрических и светооптических исследований.
Цифровой материал, полученный в процессе исследования, обработан методами парной корреляции и вариационной статистики (Базаров М.К., Огородников П.И., 2008) на ПК с использованием пакета программы Microsoft Excel 2010 и Statistica 6. Достоверность различных сравниваемых показателей оценивалась по t-критерию Стьюдента.
Положения, выносимые на защиту:
1.тМорфофункциональное состояние яичников, определенное с помощью
клинических и эхографических методов у коров-доноров при подготовке
животных к полиовуляции и во время осеменения, а также перед извлечением
эмбрионов, является информативным критериев потенциальной
эмбриопродуктивности.
2.тМорфологические данные о эмбрионах, полученных с помощью множественной бластографии при культивировании являются критерием экспресс-метода определения их жизнеспособности.
3.тДанные о морфологии яичников коров-доноров и полученных от них эмбрионов свидетельствуют, о высокоэффективности и физиологичности применяемых усовершенствованных авторских приемов в трансплантации эмбрионов.
Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследования получены на современном сертифицированном оборудовании с использованием комплекса методов сбора и обработки информации. Оценка степени достоверности, представленных в диссертационной работе результатов основывается на соответствии теоретических заключений и статистических расчетов комплекса проведенных исследований.
Основные положения диссертации доложены, прошли обсуждение и одобрены на международных научно-практических конференциях: Инженерно-технического факультета КНАУ им. К.И. Скрябина. – (Бишкек, 2012); Западно-Казахстанского аграрно-технического университета имени Жангир хана (Уральск, 2012, 2013); Оренбургский ГАУ (2013, 2014, 2015, 2016); XVII Российская агропромышленная выставка «Золотая осень - 2016» за разработку,
была присуждена золотая медаль и диплом (Москва, 2015); Международная специализированная выставка животноводства и племенного дела «АгроФарм-2016» в номинации «За лучшую научную разработку» за сконструированное и апробированное устройство получил гран-при, а также присуждены кубок и диплом (Москва, 2015); XVIII Российская агропромышленная выставка «Золотая осень - 2016» за разработку устройства, была присуждена бронзовая медаль и диплом (Москва, 2016); Международная специализированная выставке животноводства и племенного дела «АгроФарм-2017» в номинации «За лучшую научную разработку» за сконструированное и апробированное устройство получил гран-при, а также присуждены кубок и диплом (Москва, 2017).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации
опубликовано 7 патентов на изобретение и полезные модели, 8 печатных научных работ, из которых 4 – статьи в журналах, включенных ВАК России и список изданий, рекомендованных для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидат наук.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 155 страницах машинописного текста компьютерного набора. Структура диссертации состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Иллюстрирована 30 рисунками, 13 таблицами и 7 приложениями. Список литературы включает в себя 213 источников, из них 118 отечественных и 95 зарубежных источника.
В главе изложены данные научной литературы по технологии трансплантации эмбрионов, морфологической оценке яичников коров-доноров и эмбрионов на стадии дробления.
Морфофункциональная характеристика яичников коров-доноров при индукции полиовуляторной реакции гонадотропными препаратами
Яичники – парные половые железы самок. Они, выполняют генеративную функцию, то есть являются местом, где развиваются и созревают женские половые клетки, а так же являются железами внутренней секреции и вырабатывают стероидные гормоны. Яичник состоят из стромы (соединительной ткани) и коркового вещества в котором находятся фолликулы (Сковородин Е.Н., 1989, 1996; Еремин С.П., 2004; Шарипов А.Р., 2004). Яичники у здоровых коров и телок имеют следующие размеры длина 2-5 см, ширина 1,5 см, толщина 1 см и располагаются в тазовой полости (Рубинский И.А., 2005). По данным Бабинцевой Т.В. и соавт. (2012), яичники, зачастую имеют овальную форму, их масса составляет 15-19 гр., объем 17-22 см3 и длина 2,-4,5 см., а площадь 15-23 см2. Обильное снабжение яичников кровью из яичниковой артерии и ветвей маточной артерии помогают гонадам морфологически быстро перестраиваться (Бабинцева Т.В. и соавт., 2012).
Функция яичников в организме самок заключается в управлении, координации и проявлении безусловных половых рефлексов, половых циклов, генеративной и эндокринной функциях, а также образования временной железы внутренней секреции – желтого тела (Середин В.А., 1997; Семиволос А.М., 2011, 2014). При этом, функциональная активность яичника полностью зависит от секреции гонадотропных гормонов, а его реакция на ЛГ и ФСГ зависит от наличия специфических рецепторов на поверхности различных типов его клеток (Вареников М.В. и соавт., 2014).
Фолликул яичника – структурный компонент яичника, состоящий из яйцеклетки, окруженной слоем эпителиальных клеток и двумя слоями соединительной ткани (Голубец Л.В. с соавт., 2011).
В зависимости от стадии развития различают четыре типа фолликулов: примордиальные, первичные, вторичные и антральные, при этом антральные в свою очередь подразделяются на растущие и доминантные. Также фолликулы подразделяют на стадии: I-я размер 0,1 - 0,2 см; II-я размеры от 0,5 - 0,6 см, эта стадия нередко совпадает с началом течки; III-я размеры 0,8 – 1 см, при наличии 2 - 5 фолликулов происходит начало половой охоты; IV-я стадия, при наличии одного реже двух фолликулов размер варьирует от 1,2 до 1,5 см и в предовуляторный период за 6 - 8 часов до овуляции фолликулы начинают флюктуировать (Баймишев Х.В., 1999; Рубинский И.А., 2005). В своих исследованиях Липинский Б.В. (1965) отмечает, что если размер доминантного фолликула менее 20 мм, а количество ЛГ-рецепторов в клетках-теки и гранулезы, недостаточно, то данный фолликул подвергается атрезии.
При наступлении половой зрелости животного в яичнике количество примордиальных фолликулов составляет порядка 300 тысяч, при этом гипофиз, вырабатывая эндогенный фолликулостимулирующий гормон, самостоятельно может поддерживать развитие от 5 до 15 примордиальных фолликулов, но при переходе на последующие стадии развития фолликулов, количество их уменьшается, так как более слабые фолликулы атрезируются. Как отмечают ряд авторов (Смирнова Т.А., Панкратова А.В., 2012), фоликулогенез и овуляция это циклически продолжающийся процесс, который происходит в яичниках до тех пор, пока не иссякнут запасы зародышевых Z клеток.
В зависимости от стадии роста, формирования и развития фолликулов, изменяется чувствительность, и восприимчивость клеток внутренней теки и гранулезы фолликула к гипофизарным и гипоталомическим гормонам (Гончаров В.П., 1995; Панкратова А.В. и соавт., 2012).
По данным Горпичиенко Е.А. (2008), основополагающим моментом, определяющим успех стимуляции яичников и половой цикличности, является точная дифференцированная характеристика функционального состояния желтого тела в период формирования, роста и лютеонизации.
Впервые предположение о желтом теле как об эндокринной железе высказал Пренант в 1898 году, но подтверждение данной гипотезы было отображено в публикациях спустя год Fraenkel A. (1899). В последствие они были дифференцированы на желтые тела циклические, беременности и персистентные. Все виды желтых тел имеют однотипное строение, при этом, механизмы функционирования и лизиса практически не отличаются друг от друга, но могут иметь цитометрические различия (Gasse Н., 1983).
По данным ряда исследователей (Сковородин Е.Н., 1996; Шарипов А.Р., 2004; Бабинцева Т.В. и соавт., 2012), в течении полового цикла желтое тело закономерно макроскопически меняет свою конфигурацию, но как отмечает Hansel, J. Dowd (1986), увеличение массы желтого тела после овуляции происходит не за счет увеличения числа лютеоцитов, а за счет увеличения их размеров.
По данным Пташинской М. (2009), рост и созревание фолликулов характеризуется наличием двух или трех последовательных фолликулярных волн по 3-6 фолликулов на цикл эструса. В каждой фолликулярной волне, происходит отбор доминантного фолликула, который продолжает расти в момент предовуляторной фазы, в то время как остальные подвергаются атрезии. С целью сохранения количественно-качественного состава фолликулов в яичниках коров, проводят введение экзогенных гонадотропных гормонов. Это обусловлено тем, что все фолликулы, растущие в виде когорты, имеют специфические рецепторы к ФСГ и нуждаются в гонадотропине, который необходим для роста. Зачастую данную стадию именуют ФСГ-зависимой. Введение гонадотропных препаратов, позволяет индуцировать множественный рост фолликулов и полиовуляторную реакцию яичников (Пташинская М., 2009).
Гормональная индукция полиовуляторной реакции яичников у коров-доноров эмбрионов является основой трансплантации эмбрионов – технологии повышения плодовитости по материнской линии. Успех данного метода напрямую зависимы от правильно подобранных гормональных препаратов, индивидуальных доз и проведенной процедуры индукции суперовуляции.
Литературные данные свидетельствуют о том, что вопросы, связанные с индуцированием полиовуляторной реакции яичников изучались многими исследователями. За период изучения данного направления накопился огромный объем научно-практического материала, однако, нестабильность результатов на введенные экзогенные гонадотропины в среднем варьирует у 30% обработанных животных, не дающих положительного ответа на введенные гонадотропные препараты. Стоит отметить, что даже высокий уровень полиовуляторной реакции яичников не гарантирует высокий выход пригодных для пересадки эмбрионов (Мадисон В.В., Мадисон Л.В., 1988; Анзоров В.А. с соавт., 2005; Бабенков В.Ю., 2010; Гавриков А.М., 2012; Мамукаев М.Н. ссоавт.,2013).
Применение гонадотропных препаратов для индукции суперовуляции у крупного рогатого скота обусловлено высоким репродуктивным потенциалом животных в виде абдоминальных фолликулов, и при соблюдении режима протоколов создаются условия для множественного роста полостных фолликулов, их овуляции и выхода качественных яйцеклеток. Коровы, в течение всей своей репродуктивной жизни, используют не более 5-7 фолликулов, а остальные подвергаются атрезии (Завертяев Б.П., 1989; Ahmad N. et al., 1998). Индукция полиовуляции у коров стала возможной после открытия в 1930 году ученых Cole H.H. и Hart G.H. (1930), гонадотропинов обнаруженных в сыворотке крови у жеребых кобыл – ГСЖК, после чего в 1934 году группой ученых под руководством М.М. Завадовского были разработаны теоретические и практические основы гормональной индукции суперовуляции у сельскохозяйственных животных (Завадский М.М. с соавт., 1936; Завадский М.М., 1963). Как было установлено, гонадотропин СЖК продуцируется специализированными клетками трофобласта между 36 и 40 днями беремености кобыл. Он обладает свойствами как фолликулостимулирующего, так и лютеинизирующего гормона, что обуславливает после его экзогенного введения, множественный рост фолликулов с последующей их овуляцией (Gordon I. et al., 1962).
Высокое содержание молекул карбогидратов и сиаловых кислот, препятствуют инактивации и обеспечивает более длительное выведение данного гормона из организма животного. При экзогенном введении, промежуток периода полураспада ГСЖК в крови обработанного животного достигает 6 дней (Cole H.H., et al., 1967), но также существуют данные, что и на 10 день введения он также присутствует в крови животного, что пагубно сказывается на жизнеспособности и развитии зародышей (Saumande J., 1978; Schams D. et al., 1978). До 1980 года ГСЖК был основным гормоном для индукции суперовуляции, который применялся в фолликулярную фазу полового цикла в дозе от 1000 до 2000 ИЕ (Scanlon P.F.,1972; Lampeter Von W.W., 1978; Rehsock F. et al., 1986; Лубош Г., 1987).
В исследованиях начиная с конца 60-тых годов, наряду с ГСЖК, применялись гипофизарные экстракты, которые были так же эффективны, а по некоторым показателям превосходили сывороточный гонадотропин (Милованов В.К., Соколовская И.И., 1968).
На сегодняшний день во всем мире используют гипофизарные препараты фолликулостимулирующего гормона в сочетании с лютеотропным (Пташинская М., 2012). За счет присутствия в препаратах ФСГ сиаловой кислоты, обеспечивается его активное действие (Эрнст Л.К. и Сергеев Н.И., 2007). Для индукции суперовуляции чаще всего используют очищенный гормон гипофизарного происхождения свиней, получаемый из гипофиза свиней с соотношением ФСГ и ЛГ 1:1; 1:2 (Ахмедов Н.М. с соавт., 1986; Семиволос А.М., 2014).
Эхографическая характеристика яичников коров-доноров эмбрионов
С целью прогнозирования потенциального реакционного ответа яичников на введенные гонадотропные препараты и эмбриопродуктивность коров-доноров, нами было проведено определение морфометрических показателей яичников и желтых тел с последующей постпрессинговой обработкой эхограмм репродуктивных органов коров, полученных на десятый день полового цикла (рисунок 6).
Измерение показателей длины, ширины яичников и желтых тел, позволили нам определить их площадь, соотношение размера желтого тела к размеру яичника. Морфометрические показатели линейных размеров, площади яичников и желтых тел коров-доноров представлены в таблице 1, 2.
Средние показатели площади яичников по группам показали следующие величины: наибольшая площадь зафиксирована в группе I (7,9 ± 0,94 см2), среднюю по величине площадь отметили в группе II (5,7 ± 0,78 см2), а наименьшую в группе III (3,5 ± 0,06 см2). Разница данного показателя у животных I группы недостоверно превышала соответствующий показатель животных II на 2,2 см2 (Р 0,05) и достоверно превышала площадь яичников у животных III группы и на 4,3 см2 (Р 0,001).
Также были установлены средние показатели площади желтых тел, значение которых также варьировали у животных разных групп. Так, показатель по группе I составил 4,5±1,21 см2 и был недостоверно выше, чем размер желтого тела коров доноров II группы на 2,08 см2 (Р 0,05), и превышал соответствующий показатель животных в группе III на 3,43 см2 (Р 0,05).
Нами была также проведена сравнительная оценка соотношения размеров площадей желтых тел, к размерам площади яичников у каждого животного и в среднем по группам (таблица 3).
Данный расчетный показатель характеризующий размер функционально активного желтого тела перед индукцией полиовуляции показал, что величину яичников, формирует размер лютеальной ткани. У животных с наименьшим размером желтого тела, его лютеиновые структуры составили всего 30,2% от размера яичников, что достоверно меньше соответствующих показателей у животных II и III групп на 12,0 см2 (Р0,01) и 27,0 см2 (Р 0,001) соответственно.
На рисунке 7, эти соотношения средних показателей площадей желтых тел и яичников, изображены графически, в разрезе групп.
В дальнейшем, эхографическая визуализация яичников проводилась вовремя эструса перед осеменением (нулевой день полового цикла) и перед извлечением эмбрионов у коров-доноров на седьмой день после осеменения. Полученные эхограммы были подвержены постпрессинговой обработке для определения динамики, изменений происходящих в яичниках в ответ на стимуляцию ФСГ и экзогенного введения лютеолитических препаратов. При этом, учитывалась морфометрия яичников и количественно-качественный состава фолликулов и желтых тел, выражающих полиовуляторную реакцию яичников (рисунок 8, 9).
Анализом данных по эндоректальной пальпации яичников с последующей ультразвуковой визуализацией и постпресинговой обработки эхограмм установлено, что уровень полиовуляторной реакции и оплодотворения зависит от качества желтого тела в середине L-фазы, в момент предшествующий началу гонадотропной стимуляции у коров-доноров (табл. 4).
Так, в группе I при соотношении площади желтого тела к тому же показателю яичника (57,1±3,01%), количество желтых тел составило 11,6±1,26 штук, при этом, средний выход зародышей был равен 9,3±1,23 при пересчете на одного обработанного животного.
У животных II группы при показателях соотношения площади желтого тела к площади яичника равного 42,1±2,9%, перед вымыванием фиксировались желтые тела в количестве 5,7±1,24 и было извлечено 4,6±1,01 зародыша на одно вымывание. И самый низкий результат эмбриосбора (менее одного эмбриона на вымывание), был отмечен у животных III группы при относительном размере желтого тела (30,2±2,56%) и средним числом желтых тел 1,8±0,18. Результаты, отраженные в таблице 4, графически изображены на рисунке 10.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что постпрессинговая обработка эхографических изображений является методом прогнозирования эмбриопродуктивности коров-доноров эмбрионов на десятый день полового цикла до начала обработки животного гонадотропными препаратами фолликулостимулирующего гормона и использоваться в качестве критерия отбора животных в группу потенциальных доноров.
Так у животных с желтыми телами классифицированные по третьему качеству, т.е. с площадью более 50%, получили реакционный ответ яичников 11,6±1,26 желтых тел со средним выходом 9,3±1,23 зародыша на одно обработанное животное.
Оценка результативности вымывания эмбрионов в зависимости от метода извлечения и суперовуляторной реакции яичников коров–доноров эмбрионов
Результативность трансплантации эмбрионов, как основного биотехнологического метода ускоренного воспроизводства крупного рогатого скота, складывается из ряда этапов формирующих общий конечный результат. Но, к сожалению, в последнее время наблюдается тенденция того, что ряду важнейших этапов данной технологии уделяется недостаточно внимания, в связи с чем, результативность трансплантации эмбрионов претерпевает застой количественного выхода эмбрионов на фоне значительного подъема реакционного ответа яичников на применяемые новые протоколы индукции множественного роста фолликулов и как следствие суперовуляторной реакции.
Эффективность извлечения и соотношение количества вымытых зародышей к числу овуляций, показатель весьма субъективный, так как в отличие от хирургического метода, число овуляций определяется только ректальной пальпацией желтых тел на поверхности яичников (Бабенков В.Ю., 2004).
Несоответствие в реакционном ответе яичников и получение соответствующего количественного числа зародышей после их извлечения обусловлено тем, что способы вымывания и применяемые инструментарии, не позволяют извлечь в полной мере все имеющиеся в матке донора зародыши, включающие в себя не только качественные и дегенерированные эмбрионы, но и неоплодотворенные яйцеклетки, формирующие в комплексе общий эмбриосбор донора. По сообщению ряда авторов, эффективность извлечения зародышей колеблется в пределах 70-76% и в редких случаях достигает 90% (Бабенков В.Ю., 2004; Мадисон В.В. и Мадисон Л.В., 1988). Это объясняется тем, что при увеличении числа суперовуляторной реакции яичников, способы, применяемые на сегодняшний день для извлечения зародышей, не могут в полной мере обеспечить условия, при которых все имеющиеся зародыши в матке животного будут успешно извлечены.
Нами был проведен опыт по вымыванию эмбрионов у 216 коров доноров эмбрионов при использовании трех способов извлечения. Было сформировано три группы коров-доноров эмбрионов по принципу аналога. В первой группе вымывание эмбрионов проводили согласно гравитационному способу «закрытой системы самотека» (Мадисон В.В. и Мадисон Л.В., 1988), который заключается в поступлении промывочной жидкости в рога матки самопроизвольно под гидравлическим давлением созданным разницей уровней жидкости. Во второй группе применялся способ «шприцевания» основанный на принципе нагнетания промывочной жидкости в рога матки за счет давления на поршень шприца оператором проводящего процедуру вымывания эмбрионов. В качестве добавочного оснащения в группе I и II использовали двух и трехканальные катетеры модификации Фоллея, фирмы «Нойштадт» производство Германия и устройства для сбора эмбрионов производства Франция. В третьей группе, процедуру вымывания эмбрионов проводили с применением разработанного нами устройства для нехирургического извлечения эмбрионов у животных (Патент: №156767, №156768) с использованием способа нехирургического извлечения эмбрионов с замкнутым контуром цикла циркуляции промывочной жидкости. При этом, совместно с устройством мы использовали, так же разработанные нами трехканальные катетеры (Патенты: №160216; 160215.) и устройство для сбора эмбрионов (Патент: №153867).
Результаты проведенных исследований отражены в таблице 9.
Из таблицы 10 видно, что во всех трех группах, число коров-доноров эмбрионов положительно отреагировавших на индукцию суперовуляции, по лимиту числа овуляции распределились следующем образом: в первой группе - (12, 33, 15 и 6), во второй - (19, 51, 20 и 7) и в третьей - (11, 21, 17 и 4), что в процентном соотношении составило (18,2/50,0/22,7/9,1%), (19,6/52,6/20,6/7,2%) и (20,8/39,6/32,1/7,5%) соответственно.
При пересчете среднего числа желтых тел на одного положительно отреагировавшего донора во всех трех группах было установлено, что в первой группе среднее число составило – 4,1; 7,3; 15,2; 22,9, во второй – 4,0; 6,9; 14,5; 24,6, и в третьей – 4,3; 7,8; 15,7; 23,4.
После проведения процедуры извлечения эмбрионов у коров-доноров был проведен общий сбор эмбрионов по группам и в зависимости от подгрупп он составил в первой группе – 34; 178; 144; 102, во второй – 59; 265; 206; 133, и в третьей – 43; 153; 232; 81. Так же нами был проведен и сравнительный подсчет среднего числа полученных зародышей на одного положительно отреагировавшего донора в зависимости от способа извлечения и составил в первой группе – 2,8; 5,4; 9,6; 17,0, во второй группе – 3,1; 5,2; 10,3; 18,0, и в третьей – 3,9; 7,3; 13,7; 20,3, что в процентном выражении составляет (68,3/74,0/63,2/74,2%), (77,5/75,4/71,0/73,2%) и (90,7/93,6/87,3/86,6%).
В связи с этим, можно сделать вывод, что результативность вымывания эмбрионов зависит не только от суперовуляторной реакции яичников коров-доноров, но и от метода извлечения. Так, сравнительный анализ результатов показал, что средний процент выхода зародышей в первой группе, где извлечение проводили с использованием гравитационного способа «с закрытой системой самотека» составил – 69,9%, во второй группе, где ту же процедуры проводили с применением способы «шприцевания», данный показатель составил – 74,9%, а в третьей группе, проводили вымывание эмбрионов с использованием устройства для нехирургического извлечения эмбрионов животных новым способом замкнутого цикла, который обеспечивает непрерывность циклов циркуляции промывочной жидкости при проведении процедуры вымывания эмбрионов из матки животного с использованием системы для нехирургического извлечения эмбрионов с замкнутым контуром, и был равен 89,0%, что на 19,1 и 15,0% превышал по выходу зародышей две предыдущие группы (рисунок 17).
Достоверно доказано, что разница между группами I и III, а так же II и III равна p 0,01. Достоверной разницы между группами I и II не наблюдалось (таблица 10).
Это объясняется тем, что при проведении процедуры извлечения эмбрионов с использованием гравитационного способа «с закрытой системой самотека» и «шприцевания» существует ряд недостатков, которые приводят к потере извлекаемых эмбрионов у коров-доноров.
Общим недостатком, этих двух способов является то, что и в том и в другом случае процедура вымывания эмбрионов проводиться не менее 20-30 минут на одного животного. В течение этого времени у животного снижается действие анестезии и повышается его чувствительность к ректальным манипуляциям оператора и к наличию катетера в матке, приводящему к сокращению матки животного, и, как следствие, к раздражению ее слизистой оболочки, к кровотечению в матке и в прямой кишке животного, и, к вынужденному прекращению процесса вымывания эмбрионов. Так, при низкой температуре окружающей среды, промывочная жидкость, проходя через сеть трубопроводов либо находясь в шприце, теряет необходимую температуру и приводит к термошоку у эмбрионов, снижающих их жизнеспособность.
В случае первой группы, где использовался способ «с закрытой системой самотека» причинами потерь эмбрионов служит постоянное прерывание циклов циркуляции промывочной жидкости, при котором после проведения каждого из циклов он должен быть закончен и начат заново. Это обусловлено тем, что система, при которой проводиться процедура извлечения эмбрионов, проводиться через сложно конструктивную систему трубопроводов, зажимов, клапанов и тройников. Это приводит к постоянному прерыванию циклов циркуляции промывочной жидкости, усложняя и увеличивая количество манипуляций с конструктивными элементами системы. В процессе многократно повторяющихся манипуляций оператора с трубопроводами и положениями зажимов «закрыто-открыто», увеличивается риск потери эмбрионов. Это может привести к повторному вливанию не профильтрованной промывочной жидкости вместе с эмбрионами обратно в матку животного, либо к сливанию жидкости без проникновения в матку непосредственно в емкость для сбора промывочной жидкости.
В случае второй группы, где использовался способ «шприцевания» так же существует ряд недостатков, которые выражаются в том, что при данном способе используется шприц объемом 50-150 мл, то есть шприц после подачи и забора жидкости необходимо каждый раз отсоединять от катетера либо от системы, для слива промывочной жидкости вместе с эмбрионами и набора последующей порции промывочной жидкости для повторной манипуляции. Так как общий объем используемой жидкости на один рог матки, для его качественного промывания, необходимо использовать не менее 300-500 мл, следовательно, для проведения вымывания, отсоединять и повторно подсоединять шприц необходимо не менее 8-10 раз, что определяет способ как не замкнутый. А не замкнутость системы приводит к потере эмбрионов, так как любая капля, потерянная при данных манипуляциях, может нести в себе не один эмбрион.
Так как, оператор при проведении процедуры вымывания эмбрионов, одной рукой ректально проводит манипуляции с маткой животного, то корпус шприца объемом от 50 до 150 мл, который имеет большой размер, не может качественно провести подачу и забор промывочной жидкости, в связи с этим для проведения данной процедуры необходимо привлекать ассистента для подачи промывочной жидкости из шприца, что является малоэффективным и менее целесообразным, так как в место одного человека данную процедуру проводят двое.
Обсуждение полученных результатов
При увеличении поголовья крупного рогатого скота существует значимое, заложенное в генотипе, препятствие, выражающееся в малоплодии и длительном периоде протекания беременности. При этом, самки крупного рогатого скота обладают огромным генеративным потенциалом, который измеряется сотнями тысяч яйцеклеток, но только незначительная их часть реализуется до конца хозяйственного пользования животного (Сковородин Е.Н., 1989; Еремин С.П., 1990; Джамалова Г.А. и соавт., 1996; Воробьев Д.Н., 2005; Некрасов Г.Д., 2007; Байтлесов Е.У., 2008).
Трансплантация эмбрионов, как биотехнологический метод ускоренного воспроизводства, открывает огромные возможности в реализации репродуктивно-биологического потенциала животных, при использовании индивидуально-направленного генетического резерва с хозяйственнополезными признаками, с заданными фенотипическими и генотипическими характеристиками, а так же последующего максимального тиражирования их в стадах реципиентов с наименее ценными показателями. Но, несмотря на достигнутые успехи в технологии трансплантации эмбрионов, актуальными остаются вопросы изыскания новых методов отбора доноров и реципиентов, индукции суперовуляции с более высоким выходом эмбрионов, снижения трудоемкости процесса и стресс воздействия на животных (Эрнст Л.К. и соавт, 1987, 2007; Гордон А., 1988; Мадисон В.В. и Мадисон Л.В., 1988; Завертяев Б.П., 1989; Бабенков В.Ю., 1994, 2004; Канатбаев С.Г., 1995; Лебедев В.И., 2001, 2005; Пташинская М., 2009; Байтлесов Е.У., 2007, 2008; Гавриков А.М., 2012; Hansel W., 1986; Seidel G.E., 1981, 1989; Gordon I, 2003; Mapletoft R. J., 2006, 2015).
Трансплантация эмбрионов является многоэтапной технологией, первым звеном которой является отбор коров-доноров с целью индукции полиовуляторной реакции яичников. Данному этапу технологии, уделяется малозначительная роль, которая сводиться к племенной ценности и гинекологическому здоровью, без учета потенциального проявления реакционного ответа на введенные гонадотропные препараты. В связи с этим, и наблюдается тенденция нестабильного проявления полиовуляторной реакции на введенные экзогенные гонадотропины у коров-доноров. По данным Мадисона В.В. и Мадисон Л.В. (1988), отсутствие полиовуляции в среднем наблюдается у 30% обработанных животных, не дающих положительного ответа на введенные гонадотропные препараты. В связи с этим, первым этапом нашего исследования являлось изыскание метода прогнозирования эмбриопродуктивности животного, позволяющего выявить и исключить животных с низким, либо же с полным отсутствием ответной реакции на введенные гонадотропные препараты, на этапе отбора животных в качестве доноров эмбрионов, до момента введения экзогенных гонадотропинов.
Оптимальным объектом изучения по определению генеративной функции, а как следствие потенциальной эмбриопродуктивности животных, могут служить яичники, как единственные гаметогенные железы. По нашему мнению доступным, неинвазивным методом получения объективной информации в режиме on-line по определению уровня функциональной активности и морфометрической характеристики яичников, является эхографическая ультразвуковая визуализация. Использование данного метода получения информации по морфологии яичников у коров и телок сдерживается отсутствием сонографической информации о структурах фолликулогенеза и лютеогенеза при отборе потенциальных доноров, прогнозирования эмбриопродуктивности и эмбриосбора. В связи с этим, нами была поставлена задача: определить достоверность метода ультразвуковой визуализации, как инструмента изучения морфологии яичников, структур фолликулогенеза и лютеогенеза у доноров на этапе подготовки и проведения суперовуляции, и возможность использования эхографических данных для прогнозирования эмбриопродуктивности и эмбриосбора.
В процессе обработки полученных эхографичеких данных нами использовалась постпрессинговая обработка эхограмм с целью определения морфометрии яичников и структур фолликулогенеза и лютеогенеза у коров-доноров. По сообщениям Kayacik V. et. al. (2005), постпрессинговая обработка изображенных структур на эхограммах, позволяет судить о высокой эффективности данного метода при определении морфометрических показателей.
Сопоставление данных о размере желтых тел, на момент предшествующей индукции полиовуляции и данных характеризующих эффективность проведенной суперовуляции и эмбриосбора, свидетельствуют что животные, с желтыми телами классифицированные по третьему качеству, т.е. с площадью более 50%, позволяют получить высокий реакционный ответ яичников (11,6±1,26 желтых тел и 9,3±1,23 зародыша на одно извлечение). При этом, стоит отметить, что по данным ряда авторов (Эрнст Л.К. и соавт, 1987, 2007; Гордон А., 1988; Мадисон В.В. и Мадисон Л.В., 1988; Завертяев Б.П., 1989; Канатбаев С.Г., 1995; Сергеев В.А., 1997; Лебедев В.И., 2001, 2005; Полянцев Н.И., 2012), средний выход зародышей составляет 5-6 штук на одного обработанного животного.
В связи с этим, на основании полученных морфологических данных можно сделать вывод, что проводимая до начала обработки животного препаратами фолликулостимулирующего гормона ультразвуковая визуализация и постпрессинговая обработка эхографических изображений является высокоэффективным методом прогнозирования эмбриопродуктивности коров-доноров эмбрионов.
Одним из самых нестабильных звеньев технологического процесса трансплантации эмбрионов является схемы индукции полиовуляторной реакции яичников на введенные гонадотропные препараты. Большинство исследователей считают, что наиболее эффективными индукторами реакционного ответа яичников, являются экзогенные гонадотропины гипофизарного происхождения, вводимые дробно, на протяжении четырх-пяти дней (Anderson G.B. et. al., 1976; Betteridge K.J., 1980; Эрнст Л.К. и соавт, 1987, 2007; Hansel, W., Hiskey G., 1988; Гордон А., 1988; Мадисон В.В. и Мадисон Л.В., 1988; Завертяев Б.П., 1989; Бабенков В.Ю., 1994, 2004; Канатбаев С.Г., 1995; Лебедев В.И., 2001, 2005; Пташинская М., 2009; Гавриков А.М., 2012; Hansel W., 1986; Seidel G.E., 1981, 1989; Gordon I, 2003; Mapletoft R. J., 2006, 2015).
Учитывая тот факт, что при индукции суперовуляции, многократные инъекции гипофизарных гонадотропных гормонов, приводят к стрессу обрабатываемых животных, а так же труднопрогнозируемости результатов ответной реакции яичников на вводимые препараты, необходимо проводить поиск и разработку новых, эффективных и надежных веществ пролонгирующих действие препаратов гонадотропных гормонов, способных уменьшить количество манипуляций до одной, при введении препаратов ФСГ, и давать наиболее стабильный и высокий результат по числу качественных эмбрионов у крупного рогатого скота (Кириллова Н.И. с соавт., 1986; Тарасенко Н.В., Крохин В.А., 1989). Как отмечают Бабенков В.Ю. с соавт., (2009) и Косовский Г.Ю. с соавт. (2015, 2016), для минимизации стресс факторов и снижения трудоемкости процесса обработок животных, необходимо использовать вещества пролонгирующие действия препаратов ФСГ.
На сегодняшний день, наиболее распространенными веществами для пролонгации экзогенно введнных биологически активных веществ, используют биологически деградируемые полимеры и сополимеры с различной молекулярной массой (Ямамото Казумитис соавт., 2007; Шериф-Шейк Ролан с соавт., 2010; Ким Йоунг-Мин с соавт., 2004), пептиды (Игари Ясутакас соавт., 2002), а так же растительные полисахариды, такие как декстранты (Будевич А.И. с соавт., 2004). Для пролонгирования действия гонадотропинов зачастую используют биоразлагаемые полимеры в виде гелиевых композиций (Чен Гуохуа с соавт., 2009), и имплантатов (Пелле Марк, Рум Шанталь, 1999).
В связи с этим, нами был проведен опыт по определению полиовуляторной реакции яичников коров-доноров эмбрионов на введенные гипофизарные гонадотропины и количественно-качественный состав эмбриосборов в зависимости от применяемых гормональных схем.
В процессе исследования нами проведено сравнение эффективности общепринятой четырех дневной восьмикратной (через каждых 12 часов) схемы, введения препарата «ФСГ-супер» (группа I, n=78), и схем, где в качестве фармацевтических композиций использовался препарат тот же гонадотропный препарат в смеси с пролонгирующими веществами, такими как, поливиниловый спирт (группа II, n=55) и полиэтиленгликоль (группы III, n=62), вводимые однократно в начале схемы индукции полиовуляции.