Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
Мезенхимные стволовые клетки 14
Cтромально-васкулярная фракция 22
Стволовые клетки лимба 25
Собственные исследования 28
Материал и методы исследования 28
Результаты собственных исследований и их обсуждение 33
Морфологические и морфометрические характеристики роговицы
Глазного яблока кролика в контроле 33
2. Клинические и морфологические особенности заживления
Роговицы глаза у животных контрольной группы (самопроизвольное заживление) 37
2.1. Клиническая картина 37
2.2. Результаты морфологических исследования 40
3. STRONG Заживление роговицы глаза кролика при использовании аллогенных стволовых клеток лимба
(лимбальных стволовых клеток – ЛСК) STRONG 45
3.1. Клиническая картина 45
3.2. Результаты морфологических исследований 47
4. Заживление роговицы глаза кролика при использовании аллогенных мезенхимных стволовых клеток жировой ткани (ММСК)
4.1. Клиническая картина 54
4.2. Результаты морфологических исследований 56
5. Результаты применения стромально-васкулярной фракции 62
5.1. Клиническая картина 62
5.2. Результаты микроскопических исследований клиническая апробация 72
Заключение 77
Рекомендации по использованию научных выводов 79
Сведения о практическом использовании результатов
Список работ, опубликованных по теме диссертации список использованной литературы:
- Cтромально-васкулярная фракция
- Результаты морфологических исследования
- Результаты морфологических исследований
- Результаты микроскопических исследований клиническая апробация
Введение к работе
В последние десятилетия неуклонно растет число животных, страдающих офтальмопатиями различного генеза. Среди них особое место занимают длительно незаживающие и рецидивирующие язвы роговицы (Шилкин А.Г., 2000; Gelatt K., 1982). Данная патология может иметь травматическую этиологию, а также может быть вызвана снижением трофики роговицы, анатомическим лагофтальмом, ожогами и другими факторами, приводящими к повреждению эпителия и более глубоких слоёв роговицы.
Одним из направлений в регенеративной медицине является
использование клеточных продуктов различного происхождения с целью
замещения дефекта в поврежденном органе. В медицине человека при
тяжелых повреждениях роговицы клеточная терапия показывает
обнадеживающие результаты, как в эксперименте, так и на практике, что отражено во многих современных источниках. Вместе с тем, большинство подобных методов находится на стадии лабораторных и клинических испытаний. Как известно, стволовые клетки обладают способностью оптимизировать цитокиновый статус в клеточном микроокружении после их локальной трансплантации в органы или ткани (Moore M.A. 2002., Ченцова Е.В., 1996, Борзенок С.А., 2010).
Следует подчеркнуть, что в ветеринарной офтальмологии клеточные технологии до настоящего времени используют только в клинических исследованиях, не имеющих экспериментального обоснования, о чем свидетельствует проведенный нами анализ отечественной и зарубежной литературы (A. Kovca Janjatovi et al, 2015).
Исходя из вышеизложенного, нами на модели травматического повреждения роговицы у кролика было предпринято исследование по оценке возможности и эффективности применения клеток стромально-васкулярной фракции клеток, мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани и лимбальных стволовых клеток в регенеративной медицине, путём введения их суспензированной взвеси субконъюнктивально.
Цель настоящего экспериментального исследования — установить
закономерности и особенности заживления моделированного
травматического повреждения роговицы у кролика при использовании разных типов клеточных продуктов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решение ряда конкретных задач:
1. В условиях моделированного травматического повреждения роговицы у кролика выявить пролиферативный потенциал клеточных
продуктов следующих типов: аутологичной стромально-васкулярной фракции, аллогенных стволовых клеток лимба, аллогенных мезенхимных клеток жировой ткани.
2.Установить сравнительные морфологические показатели динамики репаративной регенерации поврежденного эпителия роговицы при использовании клеточных продуктов указанных типов.
3.На основании клинико-морфологических данных, определить тип клеточного продукта, оптимальный по регенераторным свойствам.
4.Выявить источники репаративного морфогенеза роговицы в условиях экспериментального повреждения и обосновать применение стволовых клеток как индуктора клеточного пролиферативного потенциала ткани роговицы при замещении ее дефекта;
5.Провести клиническую апробацию терапевтической эффективности
стволовых клеток при лечении животных с повреждениями роговицы и
установить целесообразность и эффективность применения их
трансплантации при данной патологии.
Научная новизна
Научно и экспериментально обоснована возможность использования
клеточных продуктов разных типов в ветеринарной офтальмологии для
восстановления анатомической целостности роговицы, что подтверждается
установленными у подопытных животных ее морфологическими
характеристиками.
Впервые оценено влияние клеток стромально-васкулярной фракции на регенерацию роговицы при ее повреждениях у экспериментальных животных.
Результаты гистологического исследования позволяют заключить, что скорость и качество заживления дефекта роговицы глаза у животных после применения клеточных продуктов превосходят таковые у животных при спонтанном заживлении, что может свидетельствовать о пролиферативных потенциях стволовых клеток.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Установлено, что изучаемые типы клеточных продуктов после их трансплантации экспериментальным животным инициируют восстановление анатомической целостности и функциональной состоятельности тканей роговицы в области повреждения.
На основании данных микроморфометрии выявлены морфологические показатели, подтверждающие, что клеточные продукты могут выступать в качестве индуктора репаративной регенерации повреждённых тканей глаза.
Установлены закономерности и особенности регенераторного
потенциала тканей роговицы в условиях моделированного повреждения с последующей трансплантацией клеточных продуктов. Разработаны критерии оценки течения репаративного процесса.
Сравнительный анализ регенераторного влияния изученных нами разных типов стволовых клеток показал, что эпителизация зоны дефекта роговицы у животных после введения лимбальных стволовых клеток
происходила активнее в сравнении с животными, которым вводили другие клеточные продукты.
Представлено научное обоснование терапевтической эффективности клеточных продуктов различных типов при повреждениях роговицы различной этиологии.
Методология и методы исследования
Научное обоснование установления регенераторных свойств клеточных продуктов на модели травматического повреждения роговицы глаза определило целесообразность использования комплексного методического подхода, включающего: микрохирургическое моделирование дефекта роговицы, биомикроскопичекое исследование роговицы в динамике репаративного процесса с применением витальных красителей, макро- и микроморфометрию, обзорную световую микроскопию гистологических срезов и статистическую обработку полученных цифровых данных.
Положения, выносимые на защиту:
-
Закономерности и особенности репаративного гистогенеза ткани роговицы в условиях моделирования ее повреждения.
-
Морфологические показатели динамики репаративной регенерации поврежденного эпителия роговицы в сравнительной оценке восстановительных свойств.
-
Клеточные продукты, как индуктор пролиферативного потенциала тканей роговицы при замещении ее дефекта.
-
Клиническая апробация трансплантации стволовых клеток и установление их терапевтической эффективности у животных при лимбальной недостаточности.
Степень достоверности, апробация и публикация результатов исследования
В работе использован комплексный методический подход, включающий экспериментальное моделирование повреждения роговицы, офтальмическое обследование зоны повреждения, морфологические методы исследования и статистический анализ полученных цифровых данных.
Материалы исследований представлены на XIX Московском
международном ветеринарном конгрессе в рамках секции студентов,
аспирантов и молодых ученых (Москва, 2011); III Международной Научно-
практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи –
путь к обществу, основанному на знаниях» в рамках XI Всероссийской
выставки научно-технического творчества молодежи НТТМ-2011, 30-ой
Международной Гаванской выставке-ярмарке «FIHAV» (Куба, Гавана, 2012),
Ежегодной научно-практической конференции МГАВМиБ имени
К.И. Скрябина «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии», проводимой в рамках Всероссийского фестиваля науки (Москва, 2012), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений
Минсельхоза России в номинации «Ветеринарные науки» – первое место, (Москва, 2013), Международной выставке Salon L’Etudiant (Франция, Париж, 2014); Ежегодной научно-практической конференции МГАВМиБ имени К.И. Скрябина «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии», проводимой в рамках Всероссийского фестиваля науки (Москва, 2015), XXIV Московском международном ветеринарном конгрессе в рамках секции студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва, 2015); Санкт-Петербургской ветеринарной офтальмологической конференции (Санкт-Петербург, 2015), Конференции «Outlook of Stem cells application in veterinary ophthalmology» (Перу, Лима, 2016), X Международной научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2017).
По результатам исследования опубликовано 5 научных статей, из них 3 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Cтромально-васкулярная фракция
Одним из главных назначений ниши в тканях взрослого организма является ограничение пролиферации стволовых клеток и поддержание гомеостаза. Другое назначение ниши - создание условий для максимальной защиты стволовых клеток от экзогенных воздействий. Так, стволовые клетки эпителия кишечника находятся в нижней части крипт, в волосяном фолликуле стволовые клетки локализуются под сальной железой, стволовые клетки роговицы - в области лимба[8,9]. Переход стволовых клеток в состояние покоя повышает их устойчивость к внешним воздействиям[17].
Длительное время существовало убеждение, что транзиторные клетки необратимо выходят из компартмента стволовых клеток [3], однако постепенно стали появляться данные, утверждающие, что между стволовыми и транзиторными клетками отсутствует резкая граница, а скорее имеется постепенный переход. В то время как стволовые клетки в результате деления дают начало транзиторным клеткам, последние еще некоторое время могут сохранять свойства стволовых. Поттен (2002г) называет их потенциальными стволовыми клетками и считает, что в норме они принадлежат к транзиторной популяции, но при определенных условиях, например, гибели предсуществующих стволовых клеток, могут заместить последние [94]. Представляют интерес экспериментальные данные относительно большой пластичности транзиторных клеток[4]. Транзиторные клетки эпителия роговицы находятся в ее центральной части и легко могут быть отделены от стволовых клеток, которые локализованы в области лимба [7].
Было установлено, что транзиторные клетки эпителия роговицы кролика могут быть перепрограммированы при взаимодействии с дермой эмбрионов мыши (дорсальной, верхней губы и подошвы). Полученные результаты показывают, что клетки роговицы взрослого животного отвечают на специфические стимулы эмбриональной дермы[75]. Сначала появляется новый базальный слой клеток, в котором не экспрессируются кератины роговицы, а затем появляются пилосебацейные единицы, или потовые железы, в зависимости от типа дермы, и наконец в верхних слоях клеток появляется экспрессия кератинов эпидермального типа. Таким образом, происходит перепрограммирование клеток роговицы. [94]
Вследствие того, что многие типы стволовых клеток длительное время находятся в состоянии покоя, они редко делятся и имеют большую продолжительность клеточного цикла. Например, в эпидермисе мыши можно выделить как минимум две субпопуляции клеток, различающихся по скорости пролиферации. Моррис и Поттен установили, что в дорсальном эпидермисе и волосяных фолликулах взрослых мышей стволовые клетки могут находиться в покое в течение 8-10 недель [94].
Благодаря такой структуре клеточной популяции в организме поддерживается гомеостаз эпидермиса за счет очень небольшого числа делений стволовых клеток. Транзиторные клетки проходят несколько делений, находясь в базальном слое эпидермиса, прежде чем дают начало комитированным клеткам, которые переходят в супрабазальные слои эпидермиса, выходят из клеточного цикла и терминально дифференцируются. Это обеспечивает быстрое обновление эпидермиса при относительно небольшом числе делений стволовых клеток. В других случаях стволовые клетки могут иметь очень короткий цикл. Например, пролиферативный цикл стволовых клеток крипты тонкого кишечника равен приблизительно 24 часам. В общем, можно сказать, что в тканях взрослого организма стволовые клетки пролиферируют сравнительно медленно, но это не является обязательным свойством стволовых клеток[17].
Стволовые клетки способны вырабатывать дочерние клетки, которые дают начало различным линиям дифференцированных клеток. Моррисон с соавторами считают, что стволовые клетки способны производить все дифференцированные клетки, которые возможны в конкретной ткани и в конкретное время [111]. Стволовые клетки способны к «мультипотентности» - это обозначает, что они способны производить дочерние клетки, которые дифференцируясь в разных направлениях, дают начало разным линиям клеток. Так, кроветворные стволовые клетки дают начало всем линиям клеток крови. Но могут быть стволовые клетки, которые дифференцируются только в одном направлении (монопотентность), например герминативные стволовые клетки, производящие гаметы одного пола [110].
Для клеточных технологий, которые можно использовать в клинической практике, в первую очередь представляют интерес "взрослые" (постнатальные) стволовые клетки. Существенным моментом является то, что стволовые клетки, например эпидермиса человека, можно длительное время культивировать in vitro и таким образом наращивать большое количество клеток. При этом стволовые клетки сохраняют свой пролиферативный потенциал и могут быть трансплантированы реципиенту [4, 94].
Впервые большой успех в использовании клеточных технологий связан с успешной трансплантацией выращенного эпителия на полнослойные раны у двух пациентов, один из которых после тяжелых ожогов потерял 80%, а другой частично или полностью 40% общего покрова [25].
Особенность стволовых клеток интегрироваться в трехмерные тканевые структуры организма под контролем микроокружения реципиента делает их использование идеальным подходом для цитозаместительной терапии. Первые хорошие результаты клеточных технологий были связаны с гистотипическим восстановлением дефектов кожного покрова с помощью тканевой инженерии. Были разработаны трехмерные клеточные конструкции, состоящие из внеклеточного матрикса и аутологичных или аллогенных клеток, названные "живыми эквивалентами дермы и кожи", которые использовали для трансплантации на ожоговые поверхности, длительно незаживающие раны и язвы разной природы. Успешно используются методы тканевой инженерии для лечения ожогов и язв роговицы[23].
Результаты морфологических исследования
На 3 сутки после введения гомологичных ЛСК у животных был выраженный блефароспазм, сочетающийся с острым блефаромейбомиитом (рис. 10Е) и гиперемия конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии (рис. 10Б). Сильный окулярный дискомфорт наблюдали только в одном случае, у остальных животных признаки болезненности и фотофобии отсутствовали. Окрашивание роговицы флюоресцеином было слабой выраженности, а степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого составляла от 1 до 4 баллов. Рис. 10. Макроморфология глаза животных после введения суспензии лимбальных стволовых клеток на 3 сутки наблюдения.
А, В - видны четкие границы трепанационной зоны, флюоресцеиновая проба отрицательная, степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 1-2 балла; Б - гиперемия пальпебральной и бульбарной конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии (стрелка); Г, Д -слабоположительная флюоресцеиновая проба в зоне повреждения, степень помутнения по шкале Войно-Ясенецкого 2-4 балла; Е - слабоположительное флюоресцеиновое окрашивание, отек роговицы в зоне повреждения, острый блефаромейбомиит (стрелка).
На 7 сутки после введения ЛСК степень выраженности воспаления пальпебральной конъюнктивы была менее выражена, чем в предыдущие сроки наблюдения, но гиперемия в зоне введения ЛСК сохранялась (рис 11 Б,В, стрелки). Явления блефарита, а также степень окулярного дискомфорта нивелировались. Поверхностное окрашивание роговицы флюоресцеином наблюдали только у одного животного (рис. 11В), а степень её помутнения по шкале Войно-Ясенецкого составила от 1 до 4 баллов. А, Б - окулярный дискомфорт и окрашивание роговицы флюоресцеином отсутствуют, видны четкие границы трепанационной зоны, имеет место гиперемия бульбарной конъюнктивы в месте введения клеточной суспензии; В - слабоположительная флюоресцеиновая проба, сильная гиперемия пальпебральной конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии (стрелка) На 14 сутки после введения ЛСК окулярный дискомфорт у всех животных отсутствовал, гиперемия конъюнктивы и явления блефарита сохранялись только у одного животного (рис. 12А,Б). Флюоресцеиновая проба была отрицательна. Границы зоны трепанации были нечёткими, было выявлено лишь центральное помутнение роговицы в виде нубекулы (рис. 12А,Б), а степень её помутнения по шкале Войно-Ясенецкого составила от О до 4 баллов.
Рис. 12. Клиническая картина глаза кроликов после введения ЛСК на 14 сутки. А, Б - окулярный дискомфорт отсутствует, границы трепанационной зоны размыты, степень помутнения по шкале Войно-Ясенецкого 2-4 балла, сохранена воспалительная реакция век (стрелка) и гиперемия конъюнктивы (стрелка); В - окулярный дискомфорт полностью отсутствует, степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 0 баллов.
При морфологическом исследовании области повреждения через 7 суток выявлено полное закрытие дефекта роговицы регенератом, имеющим соединительнотканную и эпителиальную части. В центральной части регенерата (рис.13 А) в структуре эпителиального пласта насчитывалось 3-4 слоя уплощенных клеток, боуменова мембрана была представлена рыхло упакованными пучками коллагеновых волокон с расширенными кровеносными сосудами. В собственном веществе роговицы дифференцировалась зрелая грануляционная и фиброзная ткань с веретеновидными фибробластами и тонкими пучками коллагеновых волокон.
В периферической части регенерата (рис.13 Б) в эпителиальном пласте количество слоёв возрастало до 8-10, они характеризовались признаками вертикальной анизоморфии. Соединительнотканная часть регенерата представлена тонковолокнистой фиброзной тканью, богатой фибробластами. Примечательно разнонаправленная ориентация пучков коллагеновых волокон, резко отличающееся от характерного для нормы взаимопараллельного расположения.
А – эпителиальный пласт (1) с уменьшенным количеством слоев. Собственное вещество роговицы (2) сформировано плотно упакованными пучками коллагеновых волокон, среди которых видны фибробласты. Субэпителиально видны расширенные капилляры (стрелки).
Б – эпителиальный пласт с признаками вертикальной анизоморфии (1), уплотнение расположения пучков коллагеновых волокон и увеличение количества фибробластов в области боуменовой оболочки (2), фиброзная ткань с разнонаправленными пучками коллагеновых волокон в собственном веществе роговицы (3).
Через 14 суток наблюдений выявлено уплотнение и истончение центральной части роговицы без выраженных признаков отёка. Восстановление эпителиального пласта выражалось в присутствии 5-6 слоёв эпителиоцитов. Собственное вещество роговицы сформировано фиброзной тканью, в поверхностных слоях которой обнаружен диффузный клеточный инфильтрат.
В периферической зоне регенерата визуализировали эпителиальный пласт, боуменова мембрана не обнаружена. Собственное вещество роговицы образовано фиброзной тканью с признаками отёка и диффузной клеточной инфильтрацией, структера десцеметовой мембраны и заднего эпителия были восстановлены. Субэпителиально выявлена зона незрелой фиброзной ткани. Рис. 14. Состояние центральной2зоны роговицы кролика на 14 сутки после введения ЛСК. Гематоксилин и эозин, А, Б - об.20, ок.10. В - об.40, ок.10. A - общий вид: 1 - эпителиальный пласт, 2 - фиброзная ткань регенерата, 3 -собственное вещество роговицы, 4 - десцеметова мембрана, 5 - внутренний эпителий. Б - в собственном веществе роговицы (2) выражен отёк и диффузная клеточная инфильтрация. 1 - наружный эпителий. А Б В области лимба эпителиальный пласт был сохранен, в субэпителиальной рыхлой соединительной ткани обнаружены расширенные кровеносные и лимфатические сосуды, умеренная клеточная инфильтрация. В собственном веществе роговицы выявлены сосуды микроциркуляторного русла, незначительный отёк межклеточного вещества и диффузная клеточная инфильтрация.
Результаты морфологических исследований
А, В - видны четкие границы трепанационной зоны, флюоресцеиновая проба отрицательная, степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 1-2 балла; Б - гиперемия пальпебральной и бульбарной конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии (стрелка); Г, Д -слабоположительная флюоресцеиновая проба в зоне повреждения, степень помутнения по шкале Войно-Ясенецкого 2-4 балла; Е - слабоположительное флюоресцеиновое окрашивание, отек роговицы в зоне повреждения, острый блефаромейбомиит (стрелка).
На 7 сутки после введения ЛСК степень выраженности воспаления пальпебральной конъюнктивы была менее выражена, чем в предыдущие сроки наблюдения, но гиперемия в зоне введения ЛСК сохранялась (рис 11 Б,В, стрелки). Явления блефарита, а также степень окулярного дискомфорта нивелировались. Поверхностное окрашивание роговицы флюоресцеином наблюдали только у одного животного (рис. 11В), а степень её помутнения по шкале Войно-Ясенецкого составила от 1 до 4 баллов. А, Б - окулярный дискомфорт и окрашивание роговицы флюоресцеином отсутствуют, видны четкие границы трепанационной зоны, имеет место гиперемия бульбарной конъюнктивы в месте введения клеточной суспензии; В - слабоположительная флюоресцеиновая проба, сильная гиперемия пальпебральной конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии (стрелка)
На 14 сутки после введения ЛСК окулярный дискомфорт у всех животных отсутствовал, гиперемия конъюнктивы и явления блефарита сохранялись только у одного животного (рис. 12А,Б). Флюоресцеиновая проба была отрицательна. Границы зоны трепанации были нечёткими, было выявлено лишь центральное помутнение роговицы в виде нубекулы (рис. 12А,Б), а степень её помутнения по шкале Войно-Ясенецкого составила от О до 4 баллов.
Рис. 12. Клиническая картина глаза кроликов после введения ЛСК на 14 сутки. А, Б - окулярный дискомфорт отсутствует, границы трепанационной зоны размыты, степень помутнения по шкале Войно-Ясенецкого 2-4 балла, сохранена воспалительная реакция век (стрелка) и гиперемия конъюнктивы (стрелка); В - окулярный дискомфорт полностью отсутствует, степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 0 баллов.
При морфологическом исследовании области повреждения через 7 суток выявлено полное закрытие дефекта роговицы регенератом, имеющим соединительнотканную и эпителиальную части. В центральной части регенерата (рис.13 А) в структуре эпителиального пласта насчитывалось 3-4 слоя уплощенных клеток, боуменова мембрана была представлена рыхло упакованными пучками коллагеновых волокон с расширенными кровеносными сосудами. В собственном веществе роговицы дифференцировалась зрелая грануляционная и фиброзная ткань с веретеновидными фибробластами и тонкими пучками коллагеновых волокон.
В периферической части регенерата (рис.13 Б) в эпителиальном пласте количество слоёв возрастало до 8-10, они характеризовались признаками вертикальной анизоморфии. Соединительнотканная часть регенерата представлена тонковолокнистой фиброзной тканью, богатой фибробластами. Примечательно разнонаправленная ориентация пучков коллагеновых волокон, резко отличающееся от характерного для нормы взаимопараллельного расположения.
Структурная организация роговицы кролика после введения ЛСК на 7 сутки наблюдения. Центральная (А) и периферическая (Б) зоны регенерата. Толуидиновый синий, об.40, ок.10. А – эпителиальный пласт (1) с уменьшенным количеством слоев. Собственное вещество роговицы (2) сформировано плотно упакованными пучками коллагеновых волокон, среди которых видны фибробласты. Субэпителиально видны расширенные капилляры (стрелки). Б – эпителиальный пласт с признаками вертикальной анизоморфии (1), уплотнение расположения пучков коллагеновых волокон и увеличение количества фибробластов в области боуменовой оболочки (2), фиброзная ткань с разнонаправленными пучками коллагеновых волокон в собственном веществе роговицы (3).
Через 14 суток наблюдений выявлено уплотнение и истончение центральной части роговицы без выраженных признаков отёка. Восстановление эпителиального пласта выражалось в присутствии 5-6 слоёв эпителиоцитов. Собственное вещество роговицы сформировано фиброзной тканью, в поверхностных слоях которой обнаружен диффузный клеточный инфильтрат.
В периферической зоне регенерата визуализировали эпителиальный пласт, боуменова мембрана не обнаружена. Собственное вещество роговицы образовано фиброзной тканью с признаками отёка и диффузной клеточной инфильтрацией, структера десцеметовой мембраны и заднего эпителия были восстановлены. Субэпителиально выявлена зона незрелой фиброзной ткани. Состояние центральной2зоны роговицы кролика на 14 сутки после введения ЛСК. Гематоксилин и эозин, А, Б - об.20, ок.10. В - об.40, ок.10. A - общий вид: 1 - эпителиальный пласт, 2 - фиброзная ткань регенерата, 3 -собственное вещество роговицы, 4 - десцеметова мембрана, 5 - внутренний эпителий. Б - в собственном веществе роговицы (2) выражен отёк и диффузная клеточная инфильтрация. 1 - наружный эпителий. В области лимба эпителиальный пласт был сохранен, в субэпителиальной рыхлой соединительной ткани обнаружены расширенные кровеносные и лимфатические сосуды, умеренная клеточная инфильтрация. В собственном веществе роговицы выявлены сосуды микроциркуляторного русла, незначительный отёк межклеточного вещества и диффузная клеточная инфильтрация.
Микроморфологическая характеристика лимбальной зоны роговицы у животных на 14 сутки после моделирования дефекта и введения суспензии ЛСК. Гематоксилин и эозин. А,В – об.20, ок.10. Б – об.40, ок.10. А – общий вид: 1 - эпителиальный пласт, 2 – субэпителиальная соединительная ткань, 3 – собственное вещество роговицы, 4 – десцеметова мембрана, 5 – внутренний эпителий. Кровеносные сосуды указаны стрелками. Б – умеренная клеточная инфильтрация и отёк в субэпителиальной соединительной ткани (2), 1 – наружный эпителий. Таким образом, после трансплантации ЛСК через 7 суток в 100% случаев происходила полная эпителизация дефекта роговицы, в то время как в контрольной группе сохранялся поверхностный дефект, а в 50% -персистирующая эрозия. Через 14 суток в группе ЛСК выявлено формирование более нежного бельма роговицы по сравнению с контрольной группой (5 и 10 баллов по шкале Войно-Ясенецкого, соответственно). При этом степень васкуляризации в группе ЛСК по сравнению с контролем, составила 1 и 3 балла, а выраженность воспалительной реакции - 0 и 1 балл, соответственно. Морфометрические характеристики роговицы представлены в таблице 3.
Результаты микроскопических исследований клиническая апробация
В результате проведенных клиническо-офтальмологических и морфологических исследований выявлено, что у животных, которым вводили клеточные продукты, окулярный дискомфорт после нанесения дефекта в динамике наблюдения был менее выражен, чем у их контрольных аналогов. При проведении биомикроскопии роговицы щелевой лампой установлено, что в группе животных, с локальной трансплантацией гомологичных стволовых клеток лимба, эпителизация дефекта происходила быстрее и степень ее помутнения была наименее выражена, чем в других подопытных группах.
У животных, которым вводили аллогенные ММСК в 2 случаях отмечали неоваскуляризацию дефекта, что подтверждает их проангиогенную активность за счет стимуляции фактора роста эндотелия сосудов[33, 43]. У всех животных этой группы присутствовала выраженная воспалительная реакция конъюнктивы в месте введения клеточной суспензии, но в меньшей степени, чем в контрольной группе животных, что говорит о иммуносупрессивных свойствах ММСК[2, 118]. На 14 сутки отмечали формирование центрального рубца роговицы в виде нубекулы, интенсивность которой по шкале Войно-Ясенецкого варьировала от 3 до 7 баллов.
В группе животных, с трансплантированной локально стромально-васкулярной фракцией, воспалительная реакция конъюнктивы глаза в зоне введения суспензии была менее выражена, чем у их аналогов из других подопытных групп и окулярный дискомфорт практически отсутствовал. При оценке клинического состояния глаз животных на 14 сутки, наблюдали закрытие дефекта роговицы эпителием, за исключением одного животного, у которого сохранялось окрашивание флюоресцеином 1 на 1,5 мм в диаметре, при отсутствии блефароспазма, фотофобии и эпифоры. Степень помутнения роговицы была минимальной (от 0 до 3 баллов), при этом, центрально, визуализировали ее истончение. Есть основание полагать, что локальное применение аутологичной стромально-васкулярной фракции вызывает меньшую воспалительную реакцию, чем другие типы сравниваемых клеточных продуктов за счет гистосовместимости, а так же положительно влияет на репаративные процессы в тканях роговицы за счет своей секреторной активности и способности дифференцироваться[96, 8].
У контрольных животных отмечали выраженный окулярный дискомфорт на начальных сроках наблюдения. Присутствовала выраженная воспалительная реакция роговицы, при относительно спокойным состоянием конъюнктивы глаза. В 3 случаях регистрировали острый реактивный иридоциклит и в одном случае – кератомаляцию. У подопытных животных, которым вводили клеточные продукты, данные офтальмопатии не наблюдали. На 14 сутки наблюдений у животных контрольной группы отмечали формирование рубцовой ткани в зоне моделированного дефекта и эпителизацию центральной зоны, практически во всех случаях. Степень помутнения была наибольшей интенсивности, в сравнении с их опытными аналогами и составляла от 5 до 10 баллов по шкале Войно-Ясенецкого.
Анализ полученных данных позволил сделать заключение, что у животных, которым вводили стромально-васкулярную фракцию, субэпителиально происходило формирование фиброзной ткани, без признаков межволоконного отека, а в лимбальной зоне были выражены отек, диффузная клеточная инфильтрация с признаками склероза в собственном веществе роговицы. У животных группы ММСК заживление проходило по типу острой воспалительной реакции и неоваскуляризацией дефекта с субэпителиальным образованием грануляционной ткани, умеренным отеком и диффузной и очаговой клеточной инфильтрацией, а так же вазодилятацией в лимбальной зоне.
У животных, которым вводили лимбальные стволовые клетки эпителиальный пласт был восстановлен и количество эпителиальных слоев было приближено к норме. Собственное вещество роговицы сформировано фиброзной тканью, в её поверхностных слоях обнаружен диффузный клеточный инфильтрат, в то время как в контроле сохранялись дефекты эпителия и стромы. Кроме того, в группе контроля через 14 суток у всех животных, за исключением одного, наблюдали эпителизацию центральной области дефекта. Здесь в структуре регенерата роговицы присутствовал истонченный эпителиальный пласт, представленный 2-3 слоями клеток. Субэпителиально располагалась зрелая грануляционная ткань с признаками умеренной клеточной инфильтрации, содержащая кровеносные сосуды, а под ней - фиброзная ткань с плотно упакованными, параллельно расположенными пучками коллагеновых волокон и деструктивными очагами.
Сравнительный анализ регенераторного влияния изученных нами разных типов стволовых клеток показал, что эпителизация зоны дефекта роговицы у животных после введения лимбальных стволовых клеток происходила активнее и в более короткие сроки в сравнении с животными, которым вводили другие клеточные продукты. Лидером по степени прозрачности роговицы явились особи, которым вводили гомологичные стволовые клетки лимба.
По количеству слоев в центральной части роговицы опережали особи, которым вводили СВФ, а в группе животных с трансплантированными гомологичными стволовыми клетками лимба морфометрические показатели роговицы были наиболее приближены к норме, чем во всех остальных случаях. Обращает на себя внимание увеличение толщины роговицы в лимбальной зоне по морфометрическим показателям у животных, которым вводили клеточные продукты, за счет увеличения клеточного микроокружения в субэпителиальных слоях роговицы, в сравнении с контрольной и интактной группами, что может говорить об активации клеточной пролиферации и стимуляции регенеративных процессов после использования стволовых клеток и стромально-васкулярной фракции.
На сегодняшний момент, наши исследования направлены на выяснение тонких механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток, после трансплантации их на поверхность глаза. После подтверждения эффективности и безопасности нового метода лечения станет возможным его применение у пациентов с тяжелыми заболеваниями и повреждениями глаз, ранее неизбежно приводивших к значительному снижению зрительного восприятия и утрате зрительных функций.
При некоторых заболеваниях органа зрения нет острой необходимости прибегать к клеточной терапии, однако при ожоговой болезни глаз или при рецидивирующей эрозии роговицы стандартное лечение зачастую не приводит к желаемым результатам. Более того, позднее закрытие эпителиального повреждения заканчивается необратимыми изменениями в тканях роговицы. Поэтому в данных случаях трансплантация стволовых клеток не только желательна, но и необходима, ведь их внедрение в организм приводит к снижению помутнения роговицы, стимуляции процессов репаративного гистогенеза, затуханию воспалительного процесса и нормализации кровотока в конъюнктиве.