Криоконсервация и создание низкотемпературного банка спермы лососей Дальнего Востока Желтоножко, Олег Владимирович

Введение к работе

Актуальность. Усиливающееся антропогенное влияние на биосферу приводит к постоянному ухудшению условий существования животных и растений и, как следствие, к исчезновению не только отдельных видов, но и целых биоценозов. В первую очередь эта опасность угрожает водной среде: резко ухудшающаяся экологическая обстановка, строительство плотин, бесконтрольный сброс неочищенных стоков промышленных предприятий, экологические катастрофы, интенсификация рыбного промысла, селективный вылов наиболее крупных особей приводят к сокращению численности популяций рыб, обеднению генофонда и к полному исчезновению отдельных видов.

Одним из наиболее эффективных и дешевых' способов сохранения бйоразнообразия является криоконсервация гамет. Существование сети криобанков гамет редких, исчезающих и ценных видов рыб России могло бы создать определенный резерв генетического материала к тому моменту, когда, в стране появятся средства для восстановления редких и исчезающих видов и популяций рыб. В первую очередь это относится к Тихоокеанским лососям, нерестящимся в реках Камчатского полуострова (чавыча, кета, горбуша, нерка, кижуч, сима) и имеющих большое народнохозяйственное значение.

Создание низкотемпературного банка требует разработки методов криоконсервирования биологического материала.

Методология криоконсервации спермы рыб, и в частности, лососей в настоящее время интенсивно разрабатывается. Установлено, что наиболее эффективным криопротектором для спермы лососей является диметилсульфоксид (ДМСО) (Штайн Г., 1991., Gwo J.C, 1994), а наибольший процент подвижных спермиев (до 40%) получен при замораживании в парах жидкого азота или погружении в сухой лед с последующим хранением при -196С (Ott A.G. and Horton H.F., 1971, Штайн Г., 1991). Однако данные, полученные на тихоокеанских лососях в других

странах, не могут быть автоматически перенесены на рыб, нерестящихся в реках Камчатки, так они отличаются ареалом обитания, спектром питания и др.

Одной из существенных трудностей внедрения в практику криоконсервированной спермы рыб является широкий диапазон их видоспецифической толерантности к замораживанию (Kurokura Hisashi, 1994), поэтому актуальной задачей является разработка универсального метода.

Важную народнохозяйственную задачу - разработка метода криоконсервирования и создание низкотемпературного банка половых продуктов лососей Камчатки - целесообразно решать на основе фундаментальных исследований, направленных на выяснение биохимических механизмов, обеспечивающих подвижность спермы. Известно, что в активации и регуляции подвижности спермы лососей принимают участие ионы одно- и двухвалентных металлов, рН, і мембранный потенциал, цАМР (Brokaw С.J., 1987, Shapiro В.М. and Tombes R.M., 1989, Boitano S., and Omoto C.K., 1991, 1992), Однако конкретный механизм.активации спермиев остается не выясненным, а подобных исследований на тихоокеанских лососях до настоящего времени проведено не было!

Цель работы: на основе изучения подвижности спермиев при действии

факторов среды и низких температур _разработать метод

криоконсервировашія и создать низкотемпературный банк половых продуктов Тихоокеанских лососей, нерестящихся в реках Камчатки.

Задачи исследования:

1. Исследовать характер движения спермиев лососей в активирующих средах
. различного состава, рН и осмотического давления.

2. Изучить роль одно- и двухвалентных катионов в регуляции подвижности
спермиев.

1. Оценить взаимосвязь между дыхательной активностью и подвижностыо спермиев лососей в различных активирующих средах.

2. Изучить влияние режимов замораживания-отогрева на подвижность спермиев лососей в различных криозащитных средах.

3. Провести сравнительное исследование видовых различий подвижности и оплодотворяющей способности спермы нерки, кеты и чавычи при криоконсервации в различных средах.

4. Выяснить роль отдельных компонентов криозащитных сред в устойчивости спермы лососей к низкотемпературному воздействию.

5. Провести исследования по разработке универсального метода криоконсервирования спермы лососей Дальнего Востока, обеспечивающего сохранение подвижности и оплодотворяющей способности, а также позволяющего проводить заготовку материала в полевых условиях.

6. Создать низкотемпературный банк спермы Тихоокеанских лососей, нерестящихся в реках Камчатки.

Научная новизна. Основные результаты работы получены впервые. Установлено, что траектория движения спермиев изменяется в процессе активации и зависит от ряда факторов, таких как рН, осмотическое давление, присутствие в среде одно- и двухвалентных катионов. Впервые продемонстрирована активация спермиев в спермальной жидкости при действии высоких концентраций ионов Са²⁺ и Mg²⁺. Также впервые проведен ингибиторный анализ дыхания и установлено, что основным источником восстановительных эквивалентов для электрон-транспортной цепи митохондрий в составе сперматозоидов являются ЫАВ(Р)-зависимые субстраты и что при активации митохондрии функционируют в режиме максимальной активности. Выявлено существование взаимосвязи между подвижностью и скоростью дыхания спермы лососей. Впервые проведен сравнительный анализ влияния факторов и режимов криоконсервирования на сохранность спермы ряда видов Тихоокеанских лососей.

Теоретическая значимость работы. Общебиологическое значеній имеют данные о регуляции характера подвижности и дахательноі активности спермы рыб ионами К⁺, Na⁺, Са²⁺, Mg²⁺, Мп²⁺. Теоретичесю значимыми также являются результаты о роли ионной силы и осмотическоп давления криозащитной среды на устойчивость клеток к низкотемпературныл факторам.

Практическое значение имеет простой и дешевый метод криоконсерви рования спермы лососей, который во-первых, не требует применеюи программного замораживателя и дорогостоящих реактивов, во-вторых позволяет'производить заготовку материала в полевых условиях, в-третьих обеспечивает высокий процент подвижности и оплодотворяющеі способности деконсервированной спермы. Народнохозяйственное значенні имеет организация низкотемпературного банка спермы лососей Дальнеп Востока, в котором уже в настоящее время заложено на неограничен^ длительное хранение более 1000 образцов спермы трех видов рыб, чп исключает возможность их исчезновения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Подвижность и характер движения спермы Тихоокеанских лососєі регулируются соотношением концентраций одно- и двухвалентных катионов увеличение концентрации двухвалентных катионов позволяет активироват сперму в семенной жидкости.

2. Исследования, проведенные на средах различного состава, рН ; осмотического давления указывают на существование взаимосвязи межд подвижностью и дыханием спермы лососей, которое обусловлено окисление! NAD(P)-3aBHCHMbix субстратов в митохондриях.

3. Использование простой 4-х компонентной среды и режим
криоконсервирования, включающего замораживание со скоростью 3
С*мин'¹ до -70С, хранение в жидком азоте и быстрый отогрев, позволяе

проводить заготовку материала в полевых условиях и сохранить около 50% подвижных сисрмиев, способных к оплодотворению икры.

4. На базе Паратупского отделения Тихоокеанского Океанологического Института ДВО РАН создан низкотемпературный банк спермы Тихоокеанских лососей.

Объем и структура работы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, состоит из вступления, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, 3 глав собственных исследований с обсуждением полученных результатов, выводов, заключения. Включает 36 рисунков и 11 таблиц. Список использованной в работе литературы насчитывает 167 наименований.