Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Сохранение местных генетических ресурсов животных сельскохозяйственных видов 14
1.2. Горные породы лошадей как модель адаптации крупных млекопитающих к условиям высокогорной гипоксии 18
1.3. Алтайская порода лошадей 22
1.4. Карачаевская порода лошадей 25
1.5. Эволюция масти домашней лошади и древность происхождения пород 44
1.6. Молекулярно-генетические исследования генофондов пород и внутрипородных групп лошадей
1.6.1. Группы крови 47
1.6.2. Полиморфизм электрофоретических вариантов белков 49
1.6.3. Микросателлиты 52
1.7. Геномика и методы геномного сканирования 55
1.7.1. Тандемные и диспергированные повторы в геноме домашней лошади 57
1.7.2. ISSR-PCR маркеры 60
1.7.3. Маркеры IRAP-PCR 61
1.7.4. ДНК транспозон, хелитрон з
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 65
2.1. Объекты исследований 67
2.1.1. Внутрипородное разнообразие по фенотипическим признакам у представителей карачаевской породы лошадей 67
2.1.2. Представители разных пород и внутрипородных групп лошадей, включенные в исследования по полилокусному генотипированию (геномному сканированию) 79
2.2. Полилокусное генотипирование лошадей разных пород и внутрипородных групп 80
2.2.1. Подготовка биообразцов для геномного сканирования (полилокусного генотипирования) 80
2.2.2. Используемые для полилокусного генотипирования праймеры . 82
2.2.3. Проведение полимеразной цепной реакции 83
2.3. Математическая обработка данных 85
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследовании 87
3.1. Оценка выраженности фенотипической гетерогенности лошадей карачаевской породы 87
3.2. Сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами динуклеотидных микросателлитов AG и GA у представителей разных пород лошадей 95
3.3. Сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами тринуклеотидных микросателлитов GAG и СТС у представителей разных пород лошадей 103
3.4. Сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами LTR различных эндогенных ретровирусов у представителей разных пород лошадей 112
3.5. Генетическая дифференциация карачаевских лошадей гнедой и вороной мастей, оцененная по ISSR-PCR маркерам 122
3.6. Использование микросателлитов AG, GA и GAG для оценки внутрипородной консолидированности карачаевской породы лошадей 125
3.7. Полилокусное генотипирование лошадей алтайской и карачаевской пород с использованием в качестве праймера в ПЦР идентификационной последовательности ДНК транспозона хелитрона 127
Заключение
Предложения производству 136
Список литературы
- Горные породы лошадей как модель адаптации крупных млекопитающих к условиям высокогорной гипоксии
- Представители разных пород и внутрипородных групп лошадей, включенные в исследования по полилокусному генотипированию (геномному сканированию)
- Используемые для полилокусного генотипирования праймеры
- Сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами тринуклеотидных микросателлитов GAG и СТС у представителей разных пород лошадей
Горные породы лошадей как модель адаптации крупных млекопитающих к условиям высокогорной гипоксии
Популяционная генетика разных пород лошадей имеет особое значение еще и для выявления молекулярно-генетических механизмов адаптации крупных млекопитающих, в том числе и человека, к экстремальным условиям воспроизводства. В частности, это касается вопросов, связанных с адаптацией таких видов к условиям горной гипоксии.
Воспроизводство крупных травоядных на большой высоте над уровнем моря приводит к существенным физиологическим и метаболическим изменениям, связанным с интенсивным селекционным давлением окислительного стресса, UV радиации и других факторов, зависящих от специфических видовых характеристик. В этой связи особого внимания требуют исследования генетических структур горных пород лошадей, в частности, отечественной карачаевской породы, высоко адаптированных к горным условиям. Такие исследования могут способствовать не только консолидации генофондов пород, но и рассматриваться как модели для поисков генетических основ адаптации к высокогорным условиям разных видов, в том числе и человека. Так, известно, что человек, продвигаясь с Африканского континента, успешно колонизировал и адаптировался к широкому спектру различных ниш, в том числе и к проживанию на высоте более 3500 метров над уровнем моря, в условиях выраженной гипоксии. В работе Eichstaedt С.А. et al (2014), выполнен сравнительный анализ популяции людей, проживающих на такой высоте в провинции Colla Аргентинских Андах и равнинной группы провинции Wich. Генотипировано по 730,525 SNPs в каждой популяции 25 человек. В результате выполненного геномного сканирования по исследованию распространения гомозиготности по различным гаплотипам в популяции Collas, обнаружена их преимущественная локализация вокруг гена VEGFB, играющего существенную роль в ишемии сердца, и гена ELTD1 - другого гена, критического для развития сердечной мышцы и препятствующего ее гипертрофии. Более того, анализ метаболических путей показал, что в этой группе среди генов, отличающих горную группу от равнинной, преобладают гены, ассоциированные с формированием морфологии сердца. В процессы адаптации также вовлекаются системы, контролирующие васкуляризацию коры головного мозга. Полученные данные позволяют предполагать, что одним из механизмов адаптации к гипоксии является усиление работы сердечной мышцы без ее гипретрофии.
Недавние исследования популяций людей Тибета [145] выявили роль генов EPAS1 и EGLN1 в адаптации к высокогорной гипоксии. Обнаруженные варианты по этим генам, типичные только для популяций Тибета, оказались ассоциированы с уменьшенной концентрацией гемоглобина. Интересно, что такое же давление отбора на ген EGLN1 наблюдалось у популяций людей в Андах и Дагестане, хотя связь с концентрацией гемоглобина не была достаточно четко определена. В популяциях Квечуа (Quechua) и Аймара (Aymara) выявлены и другие гены, ассоциированные с адаптацией к гипоксии высокогорья, такие как SENP1 and ANP32D. Их транскрипция резко увеличена у индивидуумов с хронической горной болезнью (Chronic Mountain Sickness -CMS) по сравнению со здоровыми представителями Анд, что, по-видимому, по мнению авторов этой работы, вносит свой вклад в увеличенный гематокрит, типичный для такой дезадаптации.
Сравнительный анализ молекулярно-генетических механизмов адаптации к горным условиям воспроизводства крупных наземных млекопитающих позволил обнаружить определенное сходство между биохимическими системами, вовлекаемыми в этот процесс, у разных видов, в частности, человека и горных пород лошадей по гену EPAS1. В работе Hendrickson S.L. (2013) для выявления генов, вовлеченных в процессы адаптации к высокогорной гипоксии выполнено сравнение результатов геномного сканирования между одичавшей популяцией лошадей Андов, потомков завезенных из Испании в Анды в 1500 годах и пород их испанских родственников. В результате анализа 50-ти тысячных ДНК микроматриц с мононуклеотиднвми полиморфизмами (Single Nucleotide Polymorphism - SNPs) в геномах домашней лошади выявлено 131 ген - кандидаты на участие в адаптации к высокогорным условиям. Наиболее выраженное отличие обнаружено по гену the EPAS1 в метаболическом пути, индуцируемым гипоксией (hypoxia-induction-pathway - HIF), что обнаруживалось и ранее у популяций людей, адаптированных на протяжении многих поколений к проживанию в условиях высокогорья, что подтверждает успешность такого подхода и свидетельствует об особой важности этих генов в адаптации к гипоксии. Отличия обнаружены также в семействе генов цитохрома Р450 ЗА, которые могут объясняться влиянием таких факторов, как особенности эндемической растительности в условиях высокогорья, используемых лошадьми в качестве корма. Отличия по гену тенуерину (tenuerin 2 - TENM2) с рядом других генов, продукты которых существенны для функции нервной системы, свидетельствуют о том, что нервная деятельность также важна для адаптации к высокогорью. На основании анализа полиморфизма по копийности коротких геномных участков (Copy Number Variability - CNV) обнаружено сходство между высокогорными породами лошадей (в том числе и монгольской лошади) и их отличие от равнинных; отмечается, что в повышенную частоту CNV у горных пород вовлекаются районы локализации 7-ми генов, продукты которых участвуют в связывании гема, метаболизме ретинола, а также в том же метаболическом пути HIF [168]. Интересно отметить, что в результате сравнительного анализа геномов разных пород лошадей и близкородственного вида лошади Пржевальского по CNV позволили прийти к выводу о том, что полиморфизм именно по этому типу маркеров чаще всего позволяет выделить породоспецифичные характеристики [116].
В общем, полученные данные свидетельствуют о том, что для крупных млекопитающих при их адаптации к высокогорью универсальную для разных видов и определяющую роль играет метаболический путь HIF, однако в этот процесс могут вовлекаться и другие метаболические пути в связи с особенностью эволюции вида и уникальной экологией высокогорья.
Таким образом, накопленные литературные данные свидетельствуют о том, что генофонды отечественных горных пород лошадей могут представлять специальный интерес для выяснения генетических особенностей, связанных с адаптацией разных видов крупных млекопитающих к условиям высокогорной гипоксии. К представителям местных отечественных пород относятся такие, как карачаевская и алтайская.
Представители разных пород и внутрипородных групп лошадей, включенные в исследования по полилокусному генотипированию (геномному сканированию)
Исследования по полилокусному генотипированию выполнены на образцах крови лошадей различной породной принадлежности и происхождения.
Периферическую кровь забирали в вакуумные пробирки с калийными солями ЭДТА (Vacuette K3EDTA). После взятия проб крови их сохраняли на холоде (не замораживая). Для анализа ДНК подходит все - кровь, волосяные луковицы, сперма, слюна, органы и любой другой биологический материал, содержащий хотя бы несколько клеток, из которых можно выделить ДНК. Обычно для проведения работы с ДНК в лабораторию используют 5-15мл цельной крови, взятой с ЭДТА. Гепарин, многие считают добавлять не нужно, так как он препятствует выделению ДНК. При сборе крови удобно использовать 2. подготовка и проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР или PCR) с использованием разных вариантов праймеров;
Выделение ДНК проводили фенол-хлороформным, сорбентным и прочими методами. Геномную ДНК выделяли с помощью коммерческого набора реагентов «ДНК-Экстран-1» (Синтол, Россия). Процесс выделения включал стандартные процедуры для данного набора реагентов. Концентрацию ДНК в растворе определяли с помощью спектрофотометра. Как образцы цельной крови, так и выделенную ДНК можно хранить в морозильнике при -80 С на протяжении нескольких лет. 2.2.2. Используемые для полилокусного генотипирования праймеры.
Все писпользованные нами праймеры были синтезированы по нашему заказу фирмой Синтол, Россия.
В качестве праймеров были использованы ди- и тринуклеотидные коровые мотивы микросателлитов с якорными нуклеотидами - ISSR-маркеры. По этим маркерам в качестве праймеров в полимеразной цепной реакции использовали участки микросателлитов (AG)gC, (GA)gC, (GAG C и (СТС)бС. ISSR-PCR праймеры имели следующий состав: (AG)gC - AGA-GAG-AGA-GAG-AGA-GAG-C, (GA)gC - GAG-AGA-GAG-AGA-GAG-AGA-C, (GAG C - GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-GAG-C, (СТС)бС - CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-CTC-C IRAP-PCR маркеры - фрагменты ДНК, фланкированные терминальными участками длинных концевых повторов (Long Terminal Repeats, LTR) эндогенных ретровирусов (Endogenous Retroviruses, ERV) растений и млекопитающих. Для геномного сканирования (полилокусного генотипирования) геномов лошадей применяли в качестве праймеров терминльный участок ретротранспозона SIRE-1, составляющего пятую часть генома кукурузы (GCAGTTATGCAAGTGGGATGAGCA), относящегося к роду Sirevirases, представителю семейства Pseudoviridae, члены которого предположительно могут содержать env-подобный ген [103], участок ретротранпсозона PawS 5 (AACGAGGGGTTCGAGGCC), относящиегося к семейству R173, в геноме диплоидной ржи он часто ассоциирован с другими ретротранспозонами [148]. В качестве праймеров также использовали участки эндогенных ретровирусов млекопитающих - праймер р-3 (GGACCTTCTCCTTCAAGGC), последовательность его гомологична терминальному участку эндогенного ретровируса крупного рогатого скота (Bovine endogenous retrovirus р-3, BERV р-3); праймер k-1 (TATCAGGCCTCTCCGCATG) гомологичен терминальному участку Bovine endogenous retrovirus Kl, BERV К 1). BERV р-3 и BERV К 1 относятся к роду Betaretroviras и кодируют 4 основных протеина GAG, PRO, POL, и ENV [97,169].
Для полилокусного генотипирования фрагментов ДНК, которые находятся между двумя ДНК транспозонами - хелитронами, включенными в альтернативные цепи ДНК, в качестве праймера использовали последовательность 3 фланга хелитрона (TCCCGTGCGATGCACGGGA), которая является идентификационным признаком ДНК транспозонов этого семейства [163].
ПНР-анализ проводили по методике, предложенной Зеткевичем с соавт. [173]. Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 20 мкл с использованием коммерческого набора реагентов ПЦР-РВ (Синтол, Россия). Состав реакционной смеси: ДНК - 2 мкл (около 150 нг), дезоксинуклеозидтрифосфаты (2,5 мМ) - 2 мкл, 10-кратный ПЦР буфер - 2 мкл, MgCb (25 мМ) - 2 мкл, Taq ДНК-полимераза с ингибирующими активность фермента антителами (5 Е/мкл) - 0,2 мкл, праймер (10 пкмоль/реакцию) - 2 мкл, деионизированная вода - 10 мкл.
Программа амплификации: первичная денатурация (t = 94С, 2 мин.); денатурация (t = 94С, 30 с), отжиг (t = 55С, 30 с), элонгация (t = 72С, 2 мин.) - 35 циклов; финальная элонгация (t = 72 С, 10 мин.), ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технологии, Россия). Проведение электрофореза в агарозном геле. Продукты амплификации разделяли в горизонтальном 1,5% агарозном геле в 1х ТВЕ-буфере. Перед нанесением в гель ПЦР-продукт смешивали с красителем - бромфенолом в равных количествах. Напряжение источника тока во время электрофореза составляло 100 В, длительность разделения 80 мин. Окрашивание гелей проводили бромистым этидием концентрацией 0,5 мкг/мл [15].
Визуализация результатов электрофореза в УФ свете. Для визуализации фрагментов ДНК использовали трансиллюминатор УВТ-1 (Биоком, Россия). Для определения длины фрагментов ДНК определяли при помощи маркера молекулярных масс 100 bp+1.5 Kb+3 Kb (12 фрагментов от 100 до 3000 bp) М27 (СибЭнзим, Россия). 2.3. Математическая обработка данных.
Выявление наиболее полиморфных и консервативных фрагментов. В работе были использованы традиционные программы: Adobe Photoshop, Microsoft Excel, TFPGA. Полиморфизм фрагментов определяли по наличию-отсутствию ампликона соответствующей длины в спектрах.
Расчет индекса PIC (Polymorphic Information Content) выполнялся по формуле для диаллельных локусов исходя из закона Харди-Вайнберга. PIC=2f(l-f), где f - частота одного из двух аллелей. Используемые нами маркеры ISSR-PCR, IRAP-PCR и фрагменты ДНК, фланкированные инвертированным повтором идентификационной последовательности хелитрона, имеют доминантный характер. Значение f рассчитывали по формуле: f = vR, где R-частота встречаемости животных, у которых отсутствовал фрагмент ДНК данной длины. Значение R - доля гомозигот по рецессивному аллелю [19].
Индексы генетического сходства и генетические дистанции между изученными породами и внутрипородными субпопуляциями по формулам, предложенным М.Неем (1972). С этой целью использовали один из методов, позволяющих вычислять генетическое расстояние (D) и коэффициент генетического сходства (г) по Нею [20]. Метод определения генетических расстояний основан на вычислении показателя генетической идентичности (I), которую определяют как:
Используемые для полилокусного генотипирования праймеры
Результаты обсчета показателей воспроизводства кобыл этих разных типов, представленные в таблице 3.5, свидетельствуют о том, что кобылы, относящиеся к густому типу, характеризуются более высокими значениями благополучной выжеребки. Это является очень важным показателем при использовании лошадей в продуктивном коневодстве.
Таким образом, результаты выполненных исследований свидетельствуют о том, что по фенотипическим характеристикам внутри карачаевской породы сохраняется выраженная гетерогенность, и у современных представителей лошадей карачаевской породы наблюдается подразделенность на густой и характерный типы породы.
В то же время, сопоставление промеров свидетельствует о достаточно высокой внутригрупповой и внутрипородной гетерогенности по фенотипическим признакам исследованных групп животных. Так, в предполагаемом густом типе именно те промеры, которые дифференцируют один тип от другого, в группе карачаевских лошадей в разные годы отличаются друг от друга почти так же, как внутри одной временной группы. В группе густого типа в период с 1940-х по 1960-е гг. обхват груди и обхват пясти были 182,2±1,175 и 20,1±0,090, соответственно, у характерного типа - 176,3±0,970 и 19,4±0,124, а в группе в период с 1970-х по настоящее время - у густого типа те же параметры - 188,9±0,902 и 20,4±0,089, у характерного - 181,7±1,128 и 19,7±0,092. Обхват пясти не изменился, но в разные временные периоды по обхвату груди лошади, принадлежащие одному и тому же типу, существенно отличаются друг от друга примерно так же, как разные типы в один и тот же временной период.
Это в очередной раз свидетельствует о сложности генетической и паратипической компонент изменчивости фенотипических признаков, в частности, таких, как промеры различных параметров у лошадей. Кроме того, баланс между этими компонентами меняется в различных условиях содержания и кормления. Это хорошо известно для представителей пород животных разных сельскохозяйственных видов. Оценка племенной ценности быков по молочной продуктивности дочерей голштинской породы существенно отличаются в Люксембурге и Тунисе, причем доля генетической компоненты изменчивости по характеристикам молочной продуктивности выше в Люксембурге, а паратипической — в Тунисе. Ранговые корреляции у одних и тех же быков были низкими и недостоверными между оценками, полученными для них по молочной продуктивности их дочерей в разных странах [120,121,122]. Показана необходимость учета зависимости продуктивности животных от факторов окружающей среды [96].
Именно сложность и динамичность баланса между генетической и паратипической компонентой изменчивости приводит к необходимости поиска более надежных характеристик, позволяющих выявлять и использовать генетическую гетерогенность карачаевской лошади в целях облегчения и ускорения селекционной работы в желательном направлении.
Задачи сохранения генетических ресурсов и ускорения селекции требуют специального подхода к контролю их генофондов. В этих целях достаточно давно использовали различные поколения молекулярно-генетических маркеров полиморфизма отдельных участков ДНК. С их помощью решали исследовательские задачи, такие как реконструкция истории и генеалогии пород, их распространения, выяснение специфики их генофонда; разработка генетически обоснованных программ устойчивого использования местных пород и их сохранения; картирование главных генов количественных признаков в целях геномной селекции. Эти маркеры использовались также для решения таких прикладных задач, как исключение ошибок происхождения, разработка методов прогноза количества и качества конечной продукции, устойчивости к условиям содержания и к инфекционным агентам, контроль наличия наследственных заболеваний и инфицированности патогенами [43,69].
В то же время, необходимо подчеркнуть, что в связи с особой важностью сохранения генофондов местных пород, которое нарастает, в частности, в связи с известными изменениями глобальных климатических и экологических условий разведения животных сельскохозяйственных видов, увеличивается необходимость разработки новых геномных технологий полилокусного генотипирования животных (геномного сканирования), позволяющих сравнивать и выявлять множественные генотипы и гаплотипа по большому количеству геномных элементов [130,133].
Особой интерес привлекают маркеры полиморфзима геномных участков, связанных с микросателлитными локусами, но представляющие их определенную часть с известными структурными особенностями -микросателлиты, имеющие в одной цепи инвертированные повторы, расположенные на относительно коротком расстоянии (150 - 2000 пар нуклеотидов) друг от друга. Этот метод был разработан достаточно давно [173], получил название метода геномных ISSR - PCR маркеров (ISSR - inter-simple sequence repeat) которое на русском языке переводится буквально как межмикросателлитный полиморфизм. Это название не совсем точно отражает особенности маркеров, поскольку особую важность имеет тот факт, что в полимеразной цепной реакции идет амплификация коротких участков ДНК, заключенных между инвертированным повтором того микросателлита, который используется в качестве праймера. Наличие инвертированного повтора на флангах на относительно коротких расстояниях свидетельствует о том, что эти фрагменты предрасположены к формированию таких неканонических структур ДНК, как петли, которые достаточно давно обсуждаются как один из регуляторных элементов, участвующих в регуляции транскрипции, репликации и рекомбинаций [159].
В литературе имеются данные об эффективности использования ISSR-PCR маркеров для выявления межпородной дифференциации разных пород лошадей [7]. Важным недостатком этого метода является то, что фрагменты ДНК, фланкированные инвертированным повтором микросателлита, «анонимны» по своему нуклеотидному содержанию и хромосомной локализации, доминантны по характеру своего проявления при генотипировании (гомозиготу по присутствию фрагмента нельзя отличить от гетерозиготы), и, кроме того, применение в качестве праймеров разных микросателлитов приводят к получению в ПЦР совершенно разных спектров как по количеству продуктов амплификации, так и по их полиморфизму. Очевидно, что это связано с разной представленностью микросателлитов в геноме домашней лошади [166]. Причем, судя по доле инвертированных повторов среди таких как SINE, только около 5% из представленных в геноме микросателлитов с определенной нуклеотидной последовательностью могут давать продукты амплификации [109].
Из этого следует, что использование ISSR-PCR маркеров с целью выявления породных и внутрипородных особенностей генофондов различных групп лошадей требует предварительного анализа использования определенного микросателлита в качестве праймера для полилокусного генотипирования. Анализ эффективности использования различных микросателлитов в качестве праймера в ПЦР для полилокусном генотипировании лошадей разных пород представлен в последующих разделах настоящей работы.
Сравнительный анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами тринуклеотидных микросателлитов GAG и СТС у представителей разных пород лошадей
В целях выявления наиболее полиморфных генетических элементов, удобных для «адресного» полилокусного генотипирования, позволяющего выявлять небольшие генофондные отличия между внутри- и межпородными группами лошадей, выполнен анализ полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированным повтором идентификационной последовательности ДНК транспозона хелитрона. Этот транспозон привлекает особое внимание исследователей в последние годы, поскольку предполагается, что он принимает широкое участие в горизонтальном переносе (ГП) генетического материала между видами. Считается, что ГП является существенной частью жизненного цикла некоторых транспозирующихся элементов (ТЕ), обусловленной необходимостью избегать коэволюционирующие механизмы хозяина, направленные на подавление транспозиций ТЕ. Особое место среди таких ТЕ занимают ДНК транспозоны, которые реплицируются по типу «катящегося кольца», получившие название хелитронов. Идентификационным признаком хелитронов является присутствие нуклеотидов 5 ТС и 3 CTRR на конце, а также палиндрома длиной в 16 или 20 пар оснований (п.о.) близко от 3 конца. Присутствие таких последовательностей выявлено у разных таксонов, от грибов до позвоночных [163]. Последовательности палиндрома (TCCCGTGCGATGCACGGGA) и фланги высоко консервативны, внутренняя часть часто включает фрагменты других генетических элементов, в том числе, и других хелитронов. Показана их способность к горизонтальному переносу ДНК между удаленными таксонами. Хелитроны, в отличие от большинства других ДНК транспозонов, вместо транспозазы для репликации ДНК используют собственный белок, PIF1 подобную ДНК геликазу, объединяющую все хелитроны. Этот белок имеет высокую степень гомологии с бактериальным белком RC (rolling-circle), известным своим участием в горизонтальном переносе генов устойчивости к антибиотикам между разными бактериями. Как и их бактериальные «родственники», некоторые хелитроны функционируют как «машины перетасовки экзонов». У кукурузы, например, выявлено около 20000 фрагментов разных генов, которые были перетасованы с участием хелитрона [170]. В этой работе представлены данные, свидетельствующие о том, что хелитроны способны рекомбинировать и встраиваться в вирусы насекомых, которые, по-видимому, могут быть посредниками в их горизонтальном переносе. В работе [163] подобраны консервативные последовательности у разных хелитронов и показано присутствие гомологичных к ним последовательностей у различных таксонов, включая млекопитающих. В наших исследованиях мы использовали последовательность 5 GCA-ACG-CGT-GGCCGG3 , (Хел-1), выбранную на основании опубликованных идентификационных последовательностей хелитронов, интегрированных в геномы позвоночных, в качестве праймера, позволяющего в ПЦР амплифицировать геномные участки ДНК, фланкированные его инвертированным повтором, у лошадей алтайской и карачаевской пород. В анализ были включены геномная ДНК, выделенная из образцов крови алтайской породы лошадей (48 образцов из хозяйства СПК «Энчи» и 48 образцов из СПК «Чингиз») и группы лошадей карачаевской породы (34 образца), вошедших в ГПК и разводимых у частного коннозаводчика Алиева А. (Карачаево-Черкесская Республика).
Использование в качестве праймера идентификационной последовательности хелитрона (Хел-1) позволило в ПНР получить продукты амплификации участков геномной ДНК лошадей, в спектрах которых насчитывалось четко и воспроизводимо идентифицируемых 11-18 фрагментов ДНК. Не было обнаружено выраженных внутрипородных отличий по этим спектрам. Однако при сравнении спектров ампликонов между двумя породами лошадей выявляются заметные отличия по присутствию фрагментов ДНК, особенно в районах легких участков (рис. 3.8). По-видимому, выявленные отличия спектров, в определенной степени, могут быть связаны с существенными различиями в условиях обитания этих местных пород лошадей.
В пользу этого предположения свидетельствуют выполненные Н.В. Бардуковым исследования по сравнению таких спектров, полученных на геномной ДНК древних и современных реинтродуцированных популяций овцебыков. Результаты этих исследований свидетельствуют об относительной консервативности по длинам спектров ампликонов ДНК, фланкированных инвертированным повтором Хел-1, на протяжении десятков тысяч лет у овцебыков, обитавших в одних и тех же эколого-географических условиях, и существенных отличиях таких спектров у популяций, воспроизводившихся в разных условиях [9].
Примеры спектров праймера Хел-1, полученных на геномной ДНК двух пород лошадей. 1, 2, 3 - карачаевская порода; 4, 5, 6 - алтайская порода. Использование такого высоко изменчивого геномного элемента как хелитрон для полилокусного генотипирования животных сельскохозяйственных видов может иметь ограниченное значение именно в связи с широкой распространенностью, высокой изменчивостью и наличием определенной зависимости от среды обитания животных.
В пределах каждой группы молекулярно-генетических маркеров присутствуют варианты, по разному дифференцирующие породы и внутрипородные группы. Так, среди IRAP-PCR маркеров наибольшая межгрупповая изменчивость у исследованных групп лошадей обнаруживается по спектрам фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами участков эндогенных ретровирусов, впервые описанных у однодольных и двудольных растений. Спектры праймера эндогенного ретровируса млекопитающих LTR BERV (3-3 отличаются у исследованных групп лошадей относительно большим полиморфизмом, по сравнению со спектрами праймера LTR BERV к 1. Спектры продуктов амплификации, фланкированные инвертированным повтором идентификационной последовательности ДНК транспозона хелитрона существенно отличаются у разных пород лошадей, но относительно низко полиморфны внутри пород.
Среди ISSR-PCR маркеров спектры праймера (GA)9C, по-видимому, в большей степени отражают близость происхождения животных, по сравнению со спектрами маркеров IRAP-PCR. В этой связи, подбор молекулярно-генетических маркеров для полилокусного генотипирования (геномного сканирования) лошадей может существенно отличаться в зависимости от цели исследования. В случае выяснения генофондной консолидированности для контроля и совершенствования местных пород лошадей, в частности, алтайской и карачаевской, наиболее перспективным представляется использование микросателлитов с коровым мотивом AG, GA и GAG в качестве праймеров в ПНР (ISSR-PCR маркеры), а для выявления ДНК маркеров адаптивного потенциала к разным эколого-географическим условиям разведения - IRAP-PCR маркеров с применением праймеров, гомологичным к участкам длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов растений и животных, а также идентификационной последовательности ДНК транспозона хелитрона. Однако в случае использования в качестве праймеров для полилокусного генотипирования длинных концевых повторов эндогенных ретровирусов растений и животных необходим предварительный анализ их полиморфизма у исследуемых животных, поскольку по нашим данным применение одних и тех же IRAP-PCR маркеров у разных пород может приводить к существенно отличающимся оценкам своеобразия их генофондов.