Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1 Анатомо-топографическая характеристика тимуса 9
1.2 Морфофункциональная характеристика тимуса 14
1.3 Распространение, применение и биологическая роль селена 22
1.4. Заключение к обзору литературы 31
2. Материалы и методы исследований 33
3. Результаты собственных исследований 38
3.1 Динамика живой массы уток пекинской породы от одно- до 120 суточного возраста при введении в рацион ДАФС-25к 38
3.2. Анатомо-топографическая характеристика и динамика массы тимуса уток пекинской породы от одно- до 120-суточного возраста при использовании ДАФС-25к 42
3.3. Морфометрическая характеристика тимуса уток пекинской породы от одно- до 120-суточного возраста при применении ДАФС-25к 49
3.4. Микроструктура тимуса уток пекинской породы от одно- до 120 суточного возраста на фоне применения ДАФС 25к 52
3.5. Морфологические и биохимические показатели крови уток от одно- до 120-суточного возраста при применении ДАФС-25к 75
3.6. Эффективность использования в рационе уток пекинской породы препарата ДАФС-25к 81
4. Обсуждение результатов исследований 84
5. Заключение 95
6. Практические предложения 98
7. Список сокращений и условных обозначений 99
Список использованной литературы 100
- Морфофункциональная характеристика тимуса
- Динамика живой массы уток пекинской породы от одно- до 120 суточного возраста при введении в рацион ДАФС-25к
- Микроструктура тимуса уток пекинской породы от одно- до 120 суточного возраста на фоне применения ДАФС 25к
- Эффективность использования в рационе уток пекинской породы препарата ДАФС-25к
Морфофункциональная характеристика тимуса
У птиц тимус закладывается на четвертый день инкубации: у кур – в области 3 и 4 жаберных карманов (Женихова Н.И., 2006; Bhattacharya B.K., 1987).
Тимус, в отличии от других лимфоидных органов, является эпителиальным органом. В нем морфологически выделяют кортекс (корковое вещество) и медуллу (мозговое вещество), которые разделены кортико-медуллярной зоной, которая в свою очередь является васкуляризованной границей между кортексом и медуллой. Ввиду того, что септы пронизывают дольки тимуса не до конца, мозговое вещество является общим для всех долек и может образовывать выпячивания, которые могут достигать капсулы (Галактионов В.Г., 1997; Заварзин А.А., 1985; Pearse G., 2006).
В корковом веществе содержится до 80% всех тимоцитов. Мозговое вещество состоит преимущественно из ретикулярных клеточных элементов различной формы и величины (Петров Р.В., 1987; Селезнев С.Б., 2000).
Установлено несколько фаз развития тимуса животных (Турицына Е.Г., 2010): в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза железа характеризуется активными пролиферативными процессами до момента половой зрелости. После этого начинается возрастная инволюция (нарастающая атрофия) органа, однако железа не исчезает полностью, и ее остатки сохраняются до самой старости (Александровская О.В. и др., 1987; Сандул П.А. и др., 2011; Цыбикова Р.Н., 2007). Также известно, что атрофия тимуса происходит в ответ на стресс-факторы различной этиологии, однако, в отличии от возрастной атрофии органа, данная атрофия при условии отмены воздействия стресс-фактора сопровождается восстановлением тимус (Старская И.С. и др., 2013).
По данным некоторых авторов, у человека выделяют 4 основных этапа возрастной инволюции тимуса: от 1 до 10, от 10 до 20, от 25 до 40 и старше 40 лет. Атрофия паренхимы тимуса до 10 лет идет со скоростью 1,5 % в год; однако в этот период, происходит увеличение абсолютной массы железы за счет роста определенных ее зон. К третьему этапу атрофия идет со скоростью 5%, а на четвертом она падает до 0,1% в год (Кузьменко Л.Г. и др., 2013; Стручко Г.Ю. и др., 2012; Торбек В.Э., 1995).
При световой микроскопии тимуса белых беспородных крыс И.С. Рожкова выявила его дольчатое строение. Дольки этого органа имеют наибольшую величину у молодых крыс, а затем, к периоду половой зрелости, наблюдается его инволюция. Отдельные дольки нередко образуют дендритные ответвления, сливаясь друг с другом. В дольках четко обозначена граница коркового и мозгового веществ. Относительное количество эпителиальных и лимфоидных клеток, а также функциональное состояние тимоцитов, определяют четыре зоны в дольке тимуса. Наружный- подкапсулярный слой составляет первую зону, внутренний кортикальный слой (корковое вещество тимуса) определяет вторую зону, а мозговое вещество характерно для третьей зоны, которая постепенно расширяется после рождения крысы. Наконец, в четвертой зоне преобладает периваскулярная соединительной ткань, которая находится в непосредственной близости от сосудов мозгового вещества. Автор также отмечает корреляцию между возрастом животных и изменением параметров тимуса, в том числе и с вариабельностью его клеточного состава (Рожкова И.С. и др., 2013).
По данным Мороз Г.А., который занимался изучением строения тимуса интактных крыс-самцов линии Wistar, разных возрастных групп, более светлый вид мозгового вещества обеспечен меньшим содержанием лимфоцитов. Эпителиальная паренхима представлена ШИК-положительными звездчатыми клетками, в петлях которых рыхло расположены преимущественно малые лимфоциты, единичные макрофаги и плазматические клетки. В мозговом веществе, в пределах одной дольки он выявлял до 3-4 тимических телец (Селезнев С.Б., 2000; Хэм А. и др., 1983) малых и средних размеров, содержащих в центре по 2-3 гипертрофированные эпителиальные клетки с почти неизмененными ядрам (Мороз Г.А., 2009). Tarry-Adkins JL и его соавторы, изучали оптимальное питание беременных крыс (диету) в сочетании с ускоренным послеродовым ростом плода, что, в свою очередь, приводит к изменению профиля старения у тимуса самцов крыс. Опытная группа получала ограниченный уровень белка в матке, после чего следовали перекрестные стимуляции кормящих матерей, и затем их сравнивали с контролем. Результаты гистологического исследования демонстрировали достоверное снижение отношения коркового и мозгового веществ, что демонстрирует влияние программирования развития на тимическую инволюцию. Авторы утверждают, что низкий вес при рождении с быстрым послеродовым ростом приводит к преждевременному созреванию тимуса, что приводит к ускоренному старению тимуса, а это может привести к усиленной возрастной уязвимости к инфекции (Tarry-Adkins J.L. и др., 2018).
По данным Цыбиковой Р.Н. (Цыбикова Р.Н., 2007), которая изучала гистоструктуру тимуса яков бурятского экотипа, дольки тимуса данных животных достаточно крупные, средняя величина составляет 880±5,9 мкм, форма их разнообразна, но преобладают округло-овальные, вытянутые формы. Корковое и мозговое вещество точно разграничены, при этом корковое значительно преобладает над мозговым (74,4±2,3% против 23,5±1,7% от общей площади среза дольки). Встречаются дольки, состоящие только из коркового вещества, также можно встретить так называемые «почки», участки мозгового вещества в корковой зоне железы.
Бобрышева И.В. доказала, что иммуномодулятор «Иммунофан» влияет на клеточный состав морфофункциональных зон тимуса беспородных крыс: в тимусе крыс была характерна заметная реактивность на введение препарата. Курс инъекций терапевтических доз (0,7 мг/кг раз в сутки по схеме:1, 3, 5, 7 и 9-е сутки) препарата животным способствовал восстановлению структуры тимуса (увеличение плотности клеточной популяции во всех изученных структурно-функциональных зонах, увеличение содержания клеток лимфоидного ряда, что свидетельствует о активации поступления в тимус клеток-предшественниц из красного костного мозга, что, в свою очередь, ведет к усилению внутритимической пролиферации лимфоцитов), тем самым замедляя возрастную инволюцию органа (Бобрышева И.В., 2016).
В исследованиях (Турицына Е.Г., 2010) влияния различных стресс-факторов на морфологию тимуса материалом для исследований служил тимус цыплят первых трех месяцев жизни различных яичных кроссов. Автором установлено, что при воздействии транспортного и температурного стрессов, которым подвергались новорожденные цыплята при перемещении из инкубатория в цеха выращивания, особенно в холодное время года, наличие экстремального состояния вызвано тем, что цыплят первых дней жизни не способны самостоятельно поддерживать постоянную температуру тела (стоит также отметить проблему равномерного прогрева помещений содержания птицы до оптимальной температуры). Тимус этих птиц незамедлительно отвечал уменьшением абсолютной массы, весового индекса и развитием акцидентальной инволюции. Отмечено также важность продолжительности воздействия стресс-факторов: так при воздействиях от 30 минут до 4 часов в тимусе отмечали вторую стадию инволюции, если же продолжительность воздействия увеличивали до 8-12 часов в органе развивалась третья стадия инволюции в соответствии с классификацией Т.Е. Ивановской (Ивановская Т.Е., 1996).
В исследовании Cao J. (Cao J. и др., 2017) который изучал воздействие социального стресса с долгосрочной автоматической регистрацией эпизодов агрессивного поведения нелинейных SHK мышей, установил, что после смешивания в одной клетке 10 мышей (5 + 5) из разных иерархически установленных групп в результате борьбы доминантов и субдоминантов за место у всех животных фиксируется резкое сокращение количества тимоцитов в вилочковой железе. Отмечено, что максимальные различия наблюдаются через четыре дня после начала социального конфликта: количество тимоцитов у животных экспериментальной группы снижено в 6,3 раза по сравнению с контролем. Через 7 дней данный показатель отличаются в три раза, а на 12-й – различия минимальны.
Фаизова Г.М. (Фаизова Г.М., 2010) изучила особенности гистоморфологии тимуса индеек Белой, широкогрудой породы кросса «Универсал» возрастом от 1-до 23-недель. Показано, что по мере взросления птицы происходит уменьшение площади коркового вещества и увеличение мозгового: их соотношение у индеек с первой недели жизни составляет 2,73:1, а возрасте 23- недель только 0,8:1. Кроме того, во всех исследованных образцах имеются дольки, в которых граница коркового и мозгового веществ размыта. Форма долек тимуса также подвержена возрастным изменениям. Например, во время первой недели жизни индеек доминирует бобовидная форма долек, тогда как в четырехнедельном возрасте дольки характеризуются округло-овальной или угловатой формой. В дальнейшем, после восьмой недели жизни, дольки тимуса становятся удлиненно-овальными, а к 23-ей неделе форма изменяется на уплощенно-овальную с изрезанными краями. Площадь долек вилочковой железы по мере роста птицы увеличивается, достигая наибольшего значения у особей 17-недельного возраста. Затем, после 23 недель, этот показатель постепенно уменьшается.
Междольковая соединительнотканная перегородка, по мнению Фаизовой Г.М., изменялась на протяжении всего исследования. У молодых птиц (1-ая неделя жизни) её ширина составляет порядка 3,50 мкм, изображена в виде тонких пучков коллагеновых волокон. По мере взросления таких пучков становится больше, а перегородка становится шире вплоть до 23-недельного возраста.
Динамика живой массы уток пекинской породы от одно- до 120 суточного возраста при введении в рацион ДАФС-25к
Анализируя динамику относительного прироста живой массы уток отмечена закономерность снижения данного показателя с возрастом птицы, также следует отметить, что в обеих группах данный показатель изменяется неравномерно. Зафиксировано, что на протяжении практически всего периода исследований, относительные и абсолютные показатели массы подопытных уток превосходят таковые аналогов из контроля (Таблица 2).
За весь период исследования (120 суток) масса уток контрольной группы достигла 2633,33±16,33 г, увеличившись в 25,42 раза; масса аналогов из опытной группы достигла 2783,43±24,36, увеличив показатель в 26,87раз.
Масса подопытной птицы к концу периода исследования превышала таковую в контрольной группе на 5,4%.
На основании полученных данных о живой массе уток контрольной и опытной групп были рассчитаны показатели абсолютного(среднесуточного) и относительного прироста. В результате анализа установлено, что изменение среднесуточного прироста живой массы уток обеих групп достигает своего максимума (контроль -42,67г / опыт -52,01г) в период 45-60 суток, далее резко снижается, что скорее всего объясняется критической фазой развития организма, которая начинается на 60 сутки, принимая волнообразный характер (Рисунок 1). Следует отметить, что у подопытных уток на протяжении всего периода исследований наблюдается преимущество, по показателю среднесуточного прироста, в сравнении с контрольной птицей.
Максимальный относительный прирост массы тела наблюдается в 15-суточном возрасте, составляя 86,76% в контрольной группе, и 89,92% в опытной.
К 60-суточному возрасту в обеих группах данный показатель снижается (одновременно с ним падает интенсивность роста массы уток (в 1,67 раз в контроле, в 1,57 раз в опыте). К 75 суткам в обеих группах наблюдается резкое снижение относительного прироста уток: в контроле в 5,63 раз, в опыте в 8,92 раза, что скорее всего объясняется критической фазой развития организма, которая начинается на 60 сутки, в точке пересечения кривых (Свечин К.Б., 1961). Далее относительный прирост продолжает снижаться, достигая своего минимума 7,90% в контроле на 120 сутки. В опытной группе выйдя из критической фазы относительный прирост принимает волнообразное развитие, достигая к 120 суткам 10,71% (Рисунок 2;3).
В процессе изучения показателей живой массы уток пекинской породы установлено, что максимальный прирост живой массы уток отмечается в 15-суточном возрасте, минимальной – в 75-суточном возрасте. При смене эмбрионального пуха на первичное перо зафиксировано резкое снижение показателя прироста к 30-суточному возрасту (критического периода развития), а замедление роста в период с 60- до 75-суточного возраста, что объясняется началом ювенальной линьки, которая бывает у уток в возрасте 8-10 недель. Относительный прирост живой массы уток опытной группы во все возрастные периоды достоверно превышал этот показатель контроля, что связано с положительным действием ДАФС- 25к.
Микроструктура тимуса уток пекинской породы от одно- до 120 суточного возраста на фоне применения ДАФС 25к
В результате собственных исследований установлено, что у односуточных утят доли тимуса покрыты соединительнотканной капсулой, от которой отходят трабекулы, делящие ее на дольки. В дольках четко выражена дифференциация на корковое и мозговое вещество (Рисунок 11) Корковое вещество расположено на периферии дольки, более темного цвета, представлены тимоцитами малых, средних и больших размеров. Последние располагаются преимущественно на периферии дольки, а малые и средние- без определенной локации. Площадь коркового вещества составляет -1,76 х 105мкм2, площадь мозгового -1,05х105 мкм2, их соотношение -1,68±0,11(Таблица 6). В корковом веществе тимоциты располагаются компактно, плотно друг к другу, поэтому на гистосрезах оно выглядит темнее, чем мозговое. В мозговом веществе тимоциты располагаются менее плотно, хорошо заметны ретикулоэпителиальные клетки, составляющие строму органа. Выявляются тельца Гассаля, как в стадии формирования, так и зрелые (Рисунок12), представляющие собой концентрически расположенные скопления эпителиоретикулоцитов с хорошо различимыми уплощенными ядрами и слабоацидофильной цитоплазмой. Преобладание площади коркового вещества над мозговым, наличие между ними четкой границы, выявление в мозговом веществе телец Гассаля свидетельствует о том, что у односуточных утят тимус является зрелым, сформировавшимся органом с активным синтезом тимопоэтинов и напряженным лимфопоэзом.
У 15- суточных утят контрольной и опытной группы отмечена тенденция увеличения площади коркового и мозгового вещества, причем у подопытной птицы более интенсивно возрастает зона коркового вещества до 2,75±0,13 мкм2 х10 (+18,5%) (Рисунок 14) за счет пролиферации тимоцитов, а в мозговом веществе- более активное образование телец Гассаля (К-5,68±0,25;О-6,18±0,26), размеры которых незначительно выше(на 7,1%), в сравнении с контролем(Таблица 6).
К 30- суточному возрасту у утят контрольной и подопытной группы увеличиваются размеры долек, их форма в основном многоугольная, однако встречаются овальные и округлые, зачастую трабекулы долек не достигают центральных участков дольки и они сливаются своими основаниями. Увеличение размеров долек происходит за счет роста площади коркового и мозгового вещества, однако у подопытных утят более интенсивно увеличивается корковое (с 2,32±0,16 до 2,75±0,13мкм2х105), а у контрольных– мозговое (с1,06±0,05 до 1,53±0,11мкм2х105) (Рисунок 15,16). Показатель отношения площади коркового и мозгового вещества у подопытной птицы достоверно превышает таковой контроля :1,40±0,08 в опытной группе против 1,88±0,07 в контроле.
Размеры телец Гассаля и их количество в одной дольке в опытной группе также превалировали над аналогичными показателями контрольной группы (Р0,05; Таблица 6, Рисунок 17,18). Все это свидетельствует о более высоком функциональном напряжении тимуса у подопытной птицы под действием селена.
В 45- суточном возрасте у утят опытной группы достоверно увеличился показатель корково-мозгового отношения (2,20±0,12) в сравнении с предыдущим возрастом (1,88±0,07), преимущественно за счет расширения площади корковой зоны (Рисунок 20). У контрольных утят площадь коркового вещества не изменилась, однако отмечена тенденция увеличения площади мозгового вещества(с 1,53±0,11 до 1,75±0,11мкм2 х105), что, в таком возрасте, является признаком акцидентальной инволюции, связанной, скорее всего, с началом смены ювенильного пуха на первичное перо (Рисунок 19). Рисунок 16. Тимус 45 суточных утят контрольной группы. Окр. гематоксилин и эозин,ув.х100.
В дольках тимуса подопытных утят отмечено более плотное насыщение мозгового вещества тельцами Гассаля (Рисунок 22), которые были достоверно крупнее таковых контрольной группы (10,58±0,66мкм в опыте,9,34±0,32мкм в контроле) (Таблица 6). В обеих группах встречаются тельца Гассаля, как молодые, формирующиеся, имеющие вид наслаивающихся друг на друга ближайших ретикулоэпителиальных клеток, в цитоплазме которых накапливается слабоацидофильная безструктурная масса, так и тельца в стадии морфофункциональной зрелости, состоящие из комплекса уплощенных наружных и дегенерирующих центральных клеток, а также кровеносных капилляров, которых было больше в опытной группе (Рисунок 21,22).
Тенденция более высокой площади коркового вещества у подопытной птицы, в сравнении с контролем, сохраняется и в 60- суточном возрасте (5,37±0,21мкм2х105в опыте, 4,03±0,14мкм2х105 в контроле). В контрольной группе граница между корковым и мозговым веществом размыта, в последнем содержатся тельца Гассаля различного размера и формы, однако в опытной группе преобладающими являются крупные, состоящие из гипертрофированных ретикулоэпителиоцитов, ядра некоторых из них затушевывались и лизировались (Рисунок 23,25). Рисунок 20. Тимус 60 суточных утят контрольной группы. Окр. гематоксилин и эозин,ув.х100.
Достоверно значимый, более высокий показатель отношения площади коркового и мозгового вещества, в сравнении с контролем, четкая граница между ними, а также преобладание в мозговом веществе зрелых форм телец Гассаля свидетельствует о более высоком морфофункциональном статусе тимуса в опытной группе под влиянием селеноорганического препарата ДАФС-25к (Рисунок 24,26).
Акцидентальная инволюция проявляется отсутствием четкой границы между корковым и мозговым веществом, обеднением обеих зон тимоцитами (Рисунок 27). Селен оказал положительное влияние на морфофизиологию тимуса в опытной группе (Рисунок 28), что подтверждается более высоким показателем корково- мозгового отношения(2,57±0,18 в опыте, 1,65±0,11 в контроле), четкой границей между ними, а так же достоверно более высокими показателями количества(8,86±0,22 в опыте, 7,24±0,31 в контроле) и размеров телец Гассаля (12,15±0,18 в опыте,10,59±0,32 в контроле) (Таблица 6).
В 90- суточном возрасте в тимусе утят обеих групп отмечены инволютивные процессы, связанные с началом полового созревания, причем в контрольной группе, на фоне акцидентальной трансформации, они выражены ярче. Впервые, за весь изучаемый период, площадь мозгового вещества (4,07±0,16мкм2 х105) в этой группе преобладает над корковым(3,33±0,21мкм2х105), что является результатом снижения пролиферации тимоцитов (Рисунок 29,31).
В опытной группе селен способствует предотвращению ранней инволюции, под его влиянием отмечается моделирование функциональной морфологии тимуса, отмечается умеренное иммуностимулирующее действие, что выражается в более высоких показателях корково- мозгового отношения, размеров и количества телец Гассаля, четкой границей между корковым и мозговым веществом (Рисунок 30,32). Отмечаются также активно протекающие процессы пролиферации и дифференциации тимоцитов, выражающиеся более высокой плотностью клеток в корковой зоне тимуса.
Эффективность использования в рационе уток пекинской породы препарата ДАФС-25к
Так как при производстве мяса птицы расход кормов составляет до 70 % всех затрат, то целесообразно обратить особое внимание на снижение расхода кормов при составлении рационов. Осуществить это можно организацией мероприятий, направленных на снижение себестоимости продукции птицеводства. Сократить данные затраты можно, в первую очередь, за счет повышения биологической полноценности рационов (в нашем случае это применение селеносодержащего препарата ДАФС-25к). Известно, что в общем объеме расходов на корма витаминные и минеральные добавки составляют лишь5 - 7%, при этом повышая продуктивность до 25 %. Расход корма на единицу продукции в этом случае сокращается на 8–15 %, сокращаются заболеваемость и падеж поголовья до 40 %. Учитывая вышеизложенную информацию, при изучении экономической эффективности использования селеносодержащего препарата ДАФС-25к нами отмечено, что применение препарата оказало положительное влияние на сохранность поголовья, у уток, получавших его с кормом, она составила 96,36% , против 85,45% в контрольной группе (Рисунок 41). Потеря поголовья в контрольной группе составила 8 голов, против 2 голов в опытной группе. Стоит отметить, что падеж наблюдался в течение первого месяца исследования, а причиной его явилась механическая асфиксия.
Прирост живой массы подопытных уток превышал контроль на 5,7%.
Анализ результатов также показывает, что в опытной группе отмечена лучшая окупаемость кормов. Затраты корма на 1 кг прироста в ней составили 5,55 кг, что в среднем на 5,6% ниже, чем в контрольной группе (Таблица 11).
Введение в рацион селеноорганической добавки способствует улучшению окупаемости кормов, что влечет за собой повышение живой массы к моменту убоя. Из полученных данных следует, что включение в комбикорм уткам опытной группы селеноорганической добавки способствовало увеличению европейского индекса продуктивности (ЕИП): в контроле ЕИП составил 31,38%, в опыте – 40,15%. Отсюда следует, что увеличение данного показателя в опытной группе произошло за счет снижения затрат корма на 1 кг прироста, однако не без помощи остальных учитываемых показателей (Кавтарашвили А.Ш., 2015).