Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Половой цикл самок собак 10
1.2. Особенности гормонального статуса у самок собак 11
1.3. Морфофункциональные изменения органов репродукции у самок собак под воздействием половых гормонов при нормальном половом цикле 20
1.4. Ультразвуковое исследование органов репродукции у самок собак 28
1.5. Вагинальная эндоскопия 32
Глава 2. Собственные исследования 34
2.1. Материалы и методы 34
2.1.1. Характеристика материала 34
2.1.2. Ультразвуковые исследования матки и яичников 38
2.1.3. Макроморфометрия матки и яичников 43
2.1.4. Цитоморфологические исследования влагалищного мазка 46
2.1.5. Гематологические исследования по определению гормонального статуса самок 47
2.1.6. Вагиноскопические исследования 52
2.2. Методы статистической обработки результатов 60
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 61
3.1. Ультразвуковые параметры матки и яичников в проэструс, эструс, метэструс 63
3.2. Анатомические и морфометрические показатели матки и яичников 72
3.3. Результаты гематологических исследований по определению уровня плазменной концентрации прогестерона и лютеинизирующего гормона в предовуляторный период, во время овуляции и в лютеиновую фазу 79
3.4. Цитоморфологические параметры вагинальной слизи 89
3.5. Эндоскопическая картина влагалища и шейки матки в проэструс, эструс, метэструс 104
3.6. Сравнительная оценка эффективности методов определения фертильного периода 123
Заключение 129
Рекомендации по использованию научных выводов 131
Список литературы 133
Приложения 150
- Морфофункциональные изменения органов репродукции у самок собак под воздействием половых гормонов при нормальном половом цикле
- Вагиноскопические исследования
- Результаты гематологических исследований по определению уровня плазменной концентрации прогестерона и лютеинизирующего гормона в предовуляторный период, во время овуляции и в лютеиновую фазу
- Сравнительная оценка эффективности методов определения фертильного периода
Морфофункциональные изменения органов репродукции у самок собак под воздействием половых гормонов при нормальном половом цикле
В фазу проэструса под воздействием эстрогенов происходит гиперплазия и гипертрофия вагинального эпителия, эксфолиация и ороговение его клеток. При помощи цитоморфологического исследования вагинальной слизи, учитывая характерную трансформацию эпителиального пласта, выявлена активность эстрогенов, что дает возможность не только определить стадию полового цикла, но и диагностировать фертильный период [28,52,80].
На стадиях полового цикла, когда уровень эстрогенов низкий (препубертатный период, анэструс, метэструс), в цитоморфологической картине влагалищного мазка преобладают парабазальные клетки, которые имеют округлую форму и малый по отношению к ядру объём цитоплазмы [80,82,104].
При повышении уровня эстрогенов происходит гипертрофия эпителиального пласта, затрагивающая мелкие промежуточные клетки. Они характеризуются большим размером чем парабазальные клетки, округлой формой и относительно более высоким соотношением ядра к цитоплазме.
Количество поверхностных ороговевших безъядерных клеток и клеток с пикнотичным ядром возрастает в фазе проэструса и превалирует в картине эстрального мазка. Количество поверхностных клеток стремительно сокращается в метэструс. Характерно, что к этому моменту вагинальные выделения становятся более светлыми, менее интенсивными. Повышенное содержание нейтрофилов в это время считают нормой, и оно не может служить признаком развития патогенной инфекции [80,82,104,123].
Метод определения фертильности, основанный на анализе цитологической картины влагалищных мазков, разработан в 1980 — е годы (Гэри Ингланд). Он основан на оценке изменений клеток эпителия стенки влагалища во время полового цикла (такие изменения обусловлены повышенной выработкой женских половых гормонов) [104].
Ооцит собаки, как и всех млекопитающих, развивается в составе фолликула (основной функциональной единице яичника). Фолликулярные клетки, окружающие ооцит, изолируют его от окружающей среды. Необходимые для роста и развития фолликулов питательные и биологически активные вещества поступают через плотные контакты из фолликулярных клеток [104,106]. В раннем пренатальном онтогенезе герминативный эпителий яичников дифференцируется на оогонии и фолликулярные клетки. Некоторые авторы [67] предполагают, что именно первичные фолликулярные клетки приостанавливают митотическое размножение оогоний и вызывают начало мейоза. В ходе пролиферации и дифференцировки из однослойного фолликулярного эпителия формируется многослойный. Выделяют прилегающую к ооциту зону гранулёзных клетокк, а позднее и базальную мембрану. Рост фолликула сопровождается параллельным ростом ооцита. В ооците накапливаются белки, нуклеиновые кислоты, ферменты, кортикальные гранулы и другие цитоплазматические включения. Фолликулярные клетки участвуют в образовании жидкости, заполняющей фолликулярную полость. Гранулёзные клетки, прилегающие к ооциту (клетки яйценосного бугорка) участвуют в формировании вокруг яйцеклетки блестящей оболочки, состоящей из гликопротеидов [53,61,67].
У самок к моменту полового созревания в корковом слое яичников содержится большое количество различных по размерам и фазам роста первичных (примордиальных) и развивающихся фолликулов. Развитие фолликулов и яйцеклеток носит циклический характер. В зависимости от породы и плодовитости у самок собак развивается один или несколько фолликулов и соответственно одна или несколько яйцеклеток [28,53,67,107,108,133].
Выделяют несколько стадий фолликулогенеза. У самок при рождении в яичниках находятся первичные фолликулы, количество которых достигает сотни тысяч [28,53,67]. Каждый фолликул состоит из ооцита первого порядка, окруженного слоем фолликулярных клеток и соединительнотканной оболочки (теки). Во время развития фолликула эпителий из плоского преобразуется в кубический, а затем в призматический. Размножаясь, фолликулярные клетки окружают ооцит первого порядка сначала в два ряда, а затем в несколько слоев. Таким образом формируются вторичные фолликулы [26,67,104].
В дальнейшем фолликулярная полость наполняется жидкостью. Вторичный фолликул превращается в третичный (антральный) фолликул, или Граафов пузырек. Параллельно с развитием фолликула происходит рост ооцитов. Они покрываются блестящей оболочкой, состоящей из гликозаминогликанов; являющихся продуктом ообмена веществ оооцита. Эпителий вокруг ооцита располагается в виде правильных радиальных лучей (лучистый венец), выполняющих трофическую функцию. Фолликул по мере роста и созревания начинает выпячиваться в виде прозрачного пузырька над поверхностью яичника [67]. Зрелый фолликул представляет собой пузырек, заполненный жидкостью. Полость фолликула окружена фолликулярными клетками, расположенными в 10 - 12 слоев. На участке, где располагается ооцит, фолликулярные клетки образуют утолщение, которое выпячивается в фолликулярную полость в виде бугорка. На вершине этого бугорка располагается окруженная лучистым венцом яйцеклетка. Снаружи фолликул покрыт соединительнотканной оболочкой, образованной из стромы яичника [53,64,67]. Большинство фолликулов погибает на разных стадиях развития (происходит атрезия), только часть из них проходит все стадии и развивается полностью [28,67]. Учитывая, что атрезия фолликулов происходит постоянно, в последнее время большинство исследователей склоняются к выводу, что это явление носит физиологический характер, необходимый для нормального цикличного течения процессов в яичниках. По данным ряда исследователей, при рождении в яичниках самок собак насчитывают 700 000 фолликулов, при наступлении половой зрелости - 250 000, в возрасте 5 лет приблизительно 33 000, в возрасте 10 лет - 500 первичных фолликулов [25,67,95,96]. Сейчас уже доказано, что атрезия фолликулов происходит путем апоптоза. После того как погибает ооцит, форма фолликула становится неправильной, его стенки состоят из клеток гранулезы. Многие исследователи считают, что ооцит имеет свой собственный генетический механизм апоптоза. Механизм, посредством которого происходит отбор фолликула для овуляции, до конца не изучен и еще является одной из тайн биологии [26,67,95,104].
Вагиноскопические исследования
Для проведения вагиноскопии мы использовали жесткий эндоскоп фирмы Dr.Fritz (Германия) двух модификаций:
Эндоскоп с оптической трубкой диаметром 4 мм, длиной 300 мм, углом обзора 30, с вмонтированным источником холодного света, в комплекте с футляром диаметром 7 мм, с рабочими каналами 4 и 2 мм.
Микровагиноскоп диаметром 3 мм, длиной 360 мм, углом обзора 0, рабочим каналом диаметром 1,6 мм, с встроенным источником холодного света.
Техника выполнения.
Самку фиксировали на столе в стоячем положении. Под визуальным контролем помещали эндоскоп во влагалище, далее, продвигали оптику через складки влагалища, ориентируясь на каудальное выпячивание его дорсальной срединной складки. Осторожно продвигали эндоскоп в краниальном направлении до визуализации шейки матки. Она бывает затруднительна вследствие анатомических особенностей шейки, поскольку ее наружное отверстие направлено каудо-вентрально или вентрально. В случаях, когда определение цервикального канала было затруднено, эндоскоп продвигали под выпячивание шейки, ориентируясь на ток кровянисто-серозных выделений и на локализацию центра розетки борозды.
С целью определения фертильного периода и исключения патологий при проведении вагиноскопии нами были выбраны следующие показатели:
1. Состояние слизистой: цвет, наличие отечности, характер складок.
2. Характер выделений: цвет, количество.
3. Степень раскрытия цервикального канала.
Для оценки объективности использования как одного метода в отдельности, так и сочетания нескольких методов диагностики фертильного периода у самок собак, животным проводили ультразвуковое исследование с целью подтверждения беременности. Их исследовали с 20 по 31 сутки с момента диагностированного начала фертильного периода. Временной промежуток выбирали с учётом исключения возможной ранней резорбции плодов.
В случае отсутствия беременности исследовали кровь для определения уровня прогестерона методом ИФА в целях исключения лютеиновой недостаточности (как одну из причин бесплодия самок).
Основными сонографическими параметрами при проведении ультразвукового исследования матки и яичников для подтверждения беременностей были избраны:
1. Приблизительное количество плодов
2. Диаметр матки
3. Толщина, контур, эхоструктура стенки матки
4. Диаметр хорионической полости
5. Кранио- каудальный размер плода
6. Толщина плаценты
7. Отношение ширины плаценты к кранио-каудальному размеру плода.
8. Состояние околоплодных вод (эхогенность, эхоструктура, наличие взвеси).
9. Состояние, эхоструктура яичников (наличие желтых тел).
В случае отсутствия беременности определяли:
1. Диаметр матки (дорсо - вентральный размер),
2. Толщину стенки, контур, эхоструктуру матки,
3. Наличие жидкости между стенками в просвете матки (количество, эхоструктура).
4. Структурное состояние яичников с целью исключения наличия овариальных кист.
5. Формирование жёлтых тел.
При проведении сканирования матки и яичников, нами выявлено: лизис плодов (рис 34.) у 4 самок - представителей крупных пород (бернский зенненхунд - 2 особи, белая швейцарская овчарка, самоед).
Такая ультразвуковая картина (рисунок 34.) характерна при резорбции плодов во второй половине беременности. Вместе с тем, самок с данной патологией относили к группе (при статистической обработке данных) с подтвержденной беременностью, так как сам факт наступления беременности был зафиксирован.
Резорбция плодов в первой половине беременности нами выявлена у 7 самок разных пород. Данная категория самок также была отнесена к группе с подтвержденной беременностью.
Фолликулярные кисты выявлены у 5 самок (той пудель, английский бульдог, белая швейцарская овчарка и 2 самки породы доберман), лютеиновая недостаточность у 6 самок (той пудель - 2, белая швейцарская овчарка - 2, доберман - 1, бернский зенненхунд -1).
В случае неподтверждения факта беременности и выявления таких патологий как: фолликулярные кисты, лютеиновая недостаточность, пиометра, самки были исключены из статистической обработки данных поскольку беременность при таких патологиях невозможна.
Результаты гематологических исследований по определению уровня плазменной концентрации прогестерона и лютеинизирующего гормона в предовуляторный период, во время овуляции и в лютеиновую фазу
Исследования (в динамике) уровня прогестерона в сыворотке крови проводили методом иммуно ферментного анализа (п = 363). Количество животных по группам отражено в таблице 14.
На основании полученных данных, выявлена тенденция резкого подъема уровня прогестерона выше базального на 10 -15 сутки (таб. 15), которые соответствуют началу проявления признаков проэструса.
Нами установлена закономерность, согласно которой у самок крупных и гигантских пород повышение уровня прогестерона происходит в более поздние сроки, чем у животных других соматотипов, что может быть обусловлено удлинением у них в половом цикле периода проэструса.
Анализ результатов исследований определения уровня прогестерона полуколичественным экспресс - методом (тест на овуляцию) свидетельствует, о нецелесообразности его использования, когда уровень прогестерона выше 10 нг/мл (см методы исследований и приложения). Исходя из этого, после диагностирования овуляции и у самок собак с затяжным проэструсом, есть все основания использовать при проведении гематологических исследований метод ИФА.
Вместе с тем, нами показано, что использование экспресс - метода отличается высокой диагностической ценностью, поскольку позволяет в динамике проследить процесс овуляции.
Результаты исследований ЛГ в плазме крови свидетельствуют, что возрастание его уровня у самок собак коррелирует с таковым прогестерона (1,8 -2,4 нг/мл).
Таким образом, нами выявлены структурные перестройки матки и яичников в динамике полового цикла собак. У представителей всех групп достоверно утолщаются стенки матки: у самок мелких пород от 1,8 ±0,3 мм до 4,5 ± 0,5 мм; средних пород от 2,2±0,5 мм до 5,2±0,2 мм; от 3,3±0, мм до 5,6±0,2 мм - у самок крупных пород; у гигантских пород от 3,5±0,3 мм до 6,4±0,5 мм (Р 0,02). Установлены сонографические параметры доминантных фолликулов, при которых происходит процесс овуляции. У самок мелких пород овуляция происходит при лидирующем фолликуле диаметром 5,5±0,4 мм, у самок средних пород - 7,3±0,3 мм, 9,1±0,2 мм - у самок крупных пород и 9,5±0,6 мм - у самок гигантских пород соответственно. Кроме этого, сонография яичников позволяет путём подсчёта фолликулов представить объективную оценку плодовитости самки.
Сравнительная оценка эффективности методов определения фертильного периода
На основании сравнительного анализа результативности методов оценки плодовитости, фертильности и морфофункционального состояния репродуктивных органов самок собак, нами разработаны следующие алгоритмы оценки их репродуктивного потенциала:
1. Учитывая результаты цитоморфологических исследований в сопоставлении с изменением уровня прогестерона и ЛГ в сыворотке самок собак, начинать динамические исследования для определения фертильного периода рекомендуем с использования метода цитоморфологического анализа вагинальной слизи с первых дней проявления проэструса (рис. 75). Когда в картине мазка установлено преобладание (более 70%) поверхностных клеток, для диагностики овуляции следует проводить исследования по определению уровня прогестерона в сыворотке крови. Данный алгоритм даёт возможность установить сроки овуляции у самки, экономически целесообразен, но не позволяет оценить её плодовитость.
2. Исходя из полученных данных макроморфометрии, сонографии и цитоморфологии, определение уровня прогестерона в плазме крови рекомендуем проводить, когда в картине влагалищного мазка начинают преобладать поверхностные клетки, а при сонографии яичников диаметр доминантного фолликула приближается к 4 мм у самок мелких и средних пород и 4-5 мм у самок крупных пород (рис. 76).
3. Используя алгоритм (рис 77), рекомендуем: исследование по определению уровня ЛГ проводить с интервалом 12 - 18 часов, при повышении уровня прогестерона выше базального или, когда количество поверхностных клеток в картине вагинального мазка приближается к 50%. Преимуществом данного метода является раннее и достоверное прогнозирование овуляции, что даёт временное преимущество при планировании спаривания. Кроме того, путём подсчёта фолликулов можно оценить плодовитость самки.