Содержание к диссертации
Введение
1.Обзор литературы 9
1.1.Характеристика пиретроидов 9
1.2. Физико-химические свойства цифлутрина 14
1.3.Токсические свойства цифлутрина 16
1.4. Применение цифлутрина для защиты растений и животных от вредителей и насекомых 19
1.5.Фармакокинетика цифлутрина 23
2. Собственные исследования 25
2.1. Материалы и методы 25
2.2.Результаты исследований 46
2.2.1. Параметры острой пероральной токсичности препарата на мышах и крысах 46
2.2.2. Параметры острой накожной токсичности препарата на крысах 49
2.2.3. Местно-раздражающее действие препарата на кожу крыс 50
2.2.4. Подострая токсичность Цифлунита Флок на крысах 51
2.2.5. Аллергизирующие свойства на морских свинках 58
2.2.6. Раздражающее действие на слизистую оболочку глаз кроликов 59
2.2.7. Исследование переносимости препарата на овцах при многократном применении 59
2.2.8. Исследование переносимости препарата на молодняке коз 66
2.2.9. Разработка метода ВЭЖХ для определения содержания цифлутрина в сыворотке крови и молоке овец и коз 72
2.2.10.Результаты исследований содержания цифлутрина в образцах сыворотки крови коз и овец 83
2.2.11. Результаты исследований содержания цифлутрина в образцах молока овец и коз 84
2.2.12. Исследования Цифлунита Флок при энтомозах мелкого рогатого скота 85
2.2.12.1. Эффективность препарата при эстрозе овец 85
2.2.12.2.Изучение терапевтической эффективности Цифлунита Флок при вольфартиозе молодняка овец 87
2.2.12.3. Эффективность препарата при сифункулятозах овец и коз 88
2.2.12.4. Эффективность препарата при мелофагозе овец 90
2.2.12.5. Продолжительность репеллентного действия Цифлунита Флок против зоофильных мух 92
2.2.12.6. Сравнительная эффективность цифлутрина и дельтаметрина при мелофагозе овец 93
2.2.12.7. Производственные испытания препарата при вольфартиозе овец 95
2.2.12.8. Комиссионные испытания Цифлунита Флок при мелофагозе овец 96
Обсуждение 98
Заключение 102
Практические предложения 105
Список использованной литературы 107
Приложение 122
- Применение цифлутрина для защиты растений и животных от вредителей и насекомых
- Подострая токсичность Цифлунита Флок на крысах
- Разработка метода ВЭЖХ для определения содержания цифлутрина в сыворотке крови и молоке овец и коз
- Комиссионные испытания Цифлунита Флок при мелофагозе овец
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на всестороннюю работу
ветеринарных специалистов и зооинженеров по борьбе с инвазиями в хозяйствах, паразитарные болезни сельскохозяйственных животных причиняют огромный экономический ущерб животноводству нашей страны. Различные виды энтомозов в значительной степени сдерживают развитие овцеводства и козоводства. Особую опасность для здоровья животных представляют возбудители эстроза, мелофагоза, вольфартиоза, а также компоненты гнуса и зоофильные мухи (Абдуллин Ш.М., 1999; Бакунов А.В., 1998; Болдырева Л.Г., 1983; Василевич Ф.И., Стасюкевич С.И., Ятусевич А.И., 2013;Марченко В.А., 2014; Сазонов А.А., Новикова С.В., 2014; Толоконников В.П., 2005 и др). Общеизвестно, что инвазированный скот стремительно теряет продуктивность, являясь при этом источником заражения других восприимчивых животных. Больные животные имеют пониженную резистентность, легко подвергаются другим заболеваниям заразной и незаразной этиологии, у них задерживается физиологическое развитие и рост (Ятусевич А.И., Мотузко Н.С., 2006 и др). В результате, снижается мясная и молочная продуктивность, а также качество кожевенного сырья (Нурхаметов Х.Г., Абдуллин Ш.М. 1996; Василевич Ф.И., Стасюкевич С.И., 2001; Толоконников В.П., 1984; Ятусевич А.И., 2007).
Борьба с энтомозами мелкого рогатого скота традиционно связана с
купанием животных в инсектицидных растворах. Для обработки чаще всего
используют препараты на основе хлор - и фосфорорганических соединений.
Однако, они высокотоксичны для человека и животных и загрязняют
окружающую среду. У традиционного метода борьбы с паразитами есть и
другие серьезные ограничения: процедура купания животных в таких
растворах проводится только в теплый период года, для получения
максимальной эффективности обработки часто применяют завышенные
нормы расхода инсектицидного средства и проводят объемные орошения
животных (Глухарева Е.В., Абрамов В.Е., 2016). Такой нерациональный
подход предполагает перерасход инсектицида, а подобные мероприятия
требуют значительных трудозатрат. Более того, из-за длительного
применения одних и тех же инсектицидов в животноводстве и сельском
хозяйстве у насекомых вырабатывается резистентность, что приводит к
снижению эффективности применения препаратов. Также часто
проявляется так называемая кросс-резистентность, когда применение одного инсектицида приводит к появлению популяций, устойчивых не только к этому, но также и к другим инсектицидам (Ткачев А.В., 2014).
По мнению ученых, при изыскании новых инсектицидов предпочтение необходимо отдавать многофункциональным средствам, которые являются безвредными для людей и животных (Прохорова И.А., Непоклонов А.А., 2005). Ведь немаловажным фактором является биологическая безопасность – лекарственные препараты должны обладать
низкой токсичностью и отсутствием кумулятивного эффекта (Коваленко Л.В. 1986).
Исходя из вышеизложенного, создание новых эффективных инсектицидных средств, имеющих совершенные методы нанесения и позволяющих сократить кратность обработок, является весьма актуальным.
Высокую инсектицидную эффективность и низкую токсичность цифлутрина отмечали в своих трудах многие ученые различных стран мира, в том числе России, Украины, Бельгии, Дании, Германии, Великобритании, Италии, Франции (Токарев А.Н., 2015; Енгашев СВ., 2015; Стасюкевич СИ., 2013; Сафарова М.И., 2012; Олехнович Е.И. 2015; Singh А.К., 2009; Aldridge W.N., 1982; French Н. М., 2014, Liebisch А., 1992, Omotuyi І. О., 2006; Rajawat N.K., 2015 и др.).
Для эффективной, безопасной и удобной борьбы с энтомозами мелкого рогатого скота компанией ООО НИТА-ФАРМ был разработан препарат Цифлунит Флок на основе синтетического пиретроида последнего поколения, предназначенный для применения животным накожно методом пур-он. Цифлунит Флок в качестве действующего вещества содержит цифлутрин-1,13 мг/мл, а также вспомогательные вещества: 2-октилдодеканол, сольвессо 150 и жидкий парафин до 1 мл. Препарат представляет собой маслянистую прозрачную жидкость свело-коричневого цвета для наружного применения.
Нам была предоставлена возможность доказать его преимущественную безопасность и высокую эффективность с целью внедрения в ветеринарную практику.
Для внедрения в практику нового препарата необходимо провести доклинические и клинические испытания, что и стало направлением наших исследований.
Цель и задачи исследований. Цель диссертационной работы -изучить эффективность Цифлунита Флок при энтомозах овец и коз и его фармако-токсикологические свойства.
В соответствии с выбранной целью были поставлены следующие задачи:
определить параметры острой пероральной и острой накожной токсичности на лабораторных животных;
изучить подострую токсичность препарата на лабораторных животных;
изучить местно-раздражающие свойства препарата на лабораторных животных;
изучить аллергизирующие свойства препарата на лабораторных животных;
изучить влияние препарата на организм овец и коз при многократном нанесении в повышенных дозах;
разработать метод ВЭЖХ для определения цифлутрина в молоке и сыворотке крови;
изучить фармакокинетику цифлутрина в сыворотке крови животных, а также остаточные количества в молоке;
провести титрацию терапевтических доз и установить кратность применения препарата при энтомозах овец и коз;
провести комиссионные и производственные испытания препарата при энтомозах мелкого рогатого скота.
Научная новизна. В настоящее время на территории Российской Федерации зарегистрировано шесть препаратов на основе цифлутрина, три из которых предназначены для защиты крупного рогатого скота от двукрылых насекомых на пастбище (1-е %-е растворы цифлутрина -«Байофлай Пур-он» фирмы Bayer Animal Health GmbH; «Флайблок» фирмы ООО "НВЦ Агроветзащита" и «Цифлунит» фирмы ООО НИТА-ФАРМ), и три - для борьбы с эктопаразитами собак и кошек (комплексные препараты фирмы ООО "АПИ-САН" - «ВетЭкспертПро Инсекта», содержащий фипронил, тиаметоксам, пирипроксифен и цифлутрин, «Амидель-гель Нео», содержащий цифлутрин, лидокаин, хлорамфеникол, и «Дана Ультра спрей», содержащий фипронил и цифлутрин в качестве действующих веществ).
Цифлунит Флок в форме 0,1% раствора цифлутрина является первым препаратом, предназначенным для защиты овец и коз от насекомых, успешно прошедшим проведенные нами доклинические и клинические испытания и зарегистрированным в нашей стране.
В результате проведенной работы научно обоснованы и экспериментально определены терапевтические дозы и кратность применения 0,1% раствора цифлутрина при основных энтомозах овец и коз. Установлены параметры острой и подострой токсичности, изучено влияние различных доз препарата на клинические, гематологические и биохимические показатели лабораторных животных и овец, изучены местно-раздражающие и аллергизирующие свойства. Разработан метод ВЭЖХ, благодаря которому установлено, что препарат не накладывает ограничений на продукцию животноводства и разрешен к применению лактирующим самкам.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты исследований использованы при разработке Инструкции по применению Цифлунита Флок, утвержденной Россельхознадзором, с последующей выдачей регистрационного удостоверения 44-3-4.16-3091№ПВР-3-4.16/03266 от 12.04.2016 года.
По результатам исследований разработаны методические рекомендации «Меры борьбы с энтомозами овец», предназначенные для ветеринарных специалистов, студентов ветеринарных высших учебных заведений и сотрудников животноводческих хозяйств.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
токсикологическая характеристика препарата Цифлунит Флок на
лабораторных и целевых видах животных;
результаты разработки метода ВЭЖХ для определения цифлутрина в сыворотке крови и молоке;
результаты изучения фармакокинетики цифлутрина в сыворотке крови и остаточных количеств в молоке;
эффективность препарата Цифлунит Флок при энтомозах мелкого рогатого скота;
результаты производственных и комиссионных испытаний препарата при энтомозах животных.
Апробация результатов.
Материалы диссертационной работы доложены, обсуждены и одобрены на:
заседаниях ученого совета ВНИИ фундаментальной и прикладной паразитологии животных и растений, Москва, 2015, 2016, 2017 гг.
научной конференции Всероссийского общества гельминтологов РАН «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями», Москва, 2017 г.
Публикации. Опубликовано по теме диссертации 6 печатных работ: в том числе 4 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад диссертанта. Экспериментальные доклинические и клинические исследования (постановка опытов и учет результатов, отбор и исследование проб крови животных, анализ полученных данных), а также теоретические исследования выполнены диссертантом лично в объеме не менее 85%. Работа выполнялась под консультативным руководством доктора ветеринарных наук, профессора Абрамова Владислава Евгеньевича, оказывающим научно-методическую помощь при подготовке диссертационной работы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 126 страницах компьютерного текста, включает в себя: введение, обзор литературы, основную часть, обсуждение результатов, заключение, практические предложения, список использованной литературы и приложение. Работа содержит 44 таблицы, 14 рисунков. Список использованной литературы включает 132 источника, из них 89 отечественных работ и 43 иностранных авторов. Приложение на 4-х страницах. Представленные в диссертационной работе фотографии являются оригинальными авторскими работами.
Применение цифлутрина для защиты растений и животных от вредителей и насекомых
Высокую инсектицидную эффективность цифлутрина отмечали в своих исследованиях многие ученые различных стран мира, в том числе России, Украины, Бельгии, Дании, Германии, Великобритании, Италии, Франции [48, 58, 69, 93,111, 112, 115, 126].
Отметим, что цифлутрин широко применяют в сельском хозяйстве для защиты растений от вредителей. Так, например, на основе бета-цифлутрина выпускают 2,5%-ный КЭ бульдок. При опрыскивании растений используют довольно высокую норму расхода рабочей жидкости (200 – 400 л/га). Этот препарат рекомендован для однократного опрыскивания посевов картофеля против колорадского жука (расход составляет 0,25 л/га); капусты – против гусениц капустной моли, капустной совки, белянок (расход составляет 0,3 л/га); пшеницы – против клопов вредной черепашки; ячменя – против пьявицы (0,25 л/га); пастбищных трав, дикой растительности-против саранчовых (0,5 л/га). Срок ожидания после обработки картофеля составляет 30 суток, остальных культур – 20 суток [15].
После нанесения на кожу животных цифлутрин распределяется по поверхности тела, в значительной степени резорбируется кожей, что обеспечивает его длительное инсектицидное и репеллентое действие [24]. Рабочая дозировка цифлутрина для накожного нанесения животным составляет 10 мл 1% раствора на голову.
В опытах, проведенных на крупном рогатом скоте, цифлутрин в форме 1% раствора в дозе 10 мл на голову показал высокую эффективность защитного действия против зоофильных мух Musca autumnalis, Musca larvipara и Liperosia irritans, которая составила 99,1; 97,8; 97,2; 93,5; 83,0 и 77,5 % через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель соответственно после обработки [35].
С.И. Стасюкевичем была доказана высокая эффективность цифлутрина против насекомых (в стадии имаго) на лошадях и крупном рогатом скоте, находящихся на пастбище.
При учете насекомых семейства Gastrophillidae на лошадях установлена 97,9; 96,9; 95,6; 94,4; 87,8 и 78,0 % эффективность через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель после обработки соответственно. Численность насекомых за 3-х минутный период учета снижалась с 47,4±4,5 экз./гол до 1,0±0,2 экз./гол спустя 1 неделю после обработки [80].
При учете насекомых семейства Hipodermatidae на крупном рогатом скоте получена 92,8; 96,5; 96,0; 94,6; 86,9 и 76,7 % эффективность через 1, 2, 3, 4, 5 и 6 недель после обработки соответственно. Численность насекомых за 3-х минутный период учета снижалась с 27,3±2,3 экз./гол до 0,5±0,1 экз./гол спустя 1 неделю после обработки [79].
Согласно исследованиям А.Н. Токарева, С.В. Енгашева и О.А. Токаревой [83], цифлутрин в форме 1% раствора зарекомендовал себя в качестве эффективного реппелентного средства для защиты КРС от нападения насекомых семейства Muscidae, Calliphoridae, Tabanidae, Culicidae, Simuliidae: полный репеллентный эффект сохранялся в течение 12-16 дней после обработки.
М.Н. Панфиловой и М.И. Сафаровой [56] при постановке опытов на крупном рогатом скоте установлена 83,0 - 98,0 % эффективность защитного действия цифлутрина (1% раствор в дозе 10 мл на голову) в течение 5-6 недель против двукрылых насекомых семейств Hipodermatidae, Tabanidae, Culicidae и Simuliidae.
Был испытан препарат Флайблок в форме 1% эмульсии цифлутрина при борьбе с мухами у крупного рогатого скота на откормочных площадках двух типов (открытого и полузакрытого) [54]. Согласно исследованиям, коэффициент полезного действия после обработки составил 100 % в течение 72 часов. Исследователи отмечают, что для полной защиты скота обработки необходимо проводить систематически через 3-7 дней в зависимости от погоды и климатических условий после выгона скота на пастбище (опыт проводили в условиях хозяйства Алтайского края). Авторы рекомендуют первые три обработки делать с интервалами в 5-7 дней, последующие – по мере увеличения численности мух [54].
Результаты исследований ряда авторов [25] показали высокую эффективность против зоофильных мух и слепней препаратов на основе синтетического пиретроида цифлутрина 1 % в форме спрея и спот-он. При этом у животных отмечали повышение молочной продуктивности, снижение стрессов и восприимчивости к инфекционным болезням.
Был испытан комплексный препарат Сольфак Дуо СК 7,5%, содержащий в качестве действующих веществ бета-цифлутрин – 2,5% и неоникотиноид имидаклоприд – 5%, который показал высокую эффективность против мух и их личинок в свинарнике-маточнике [5].
Дезинсекцию препаратом проводили при норме расхода 0,5 мл/ м2. При подсчете мух через неделю после обработки их численность соствила 3,8 экз. на один мухолов. В среднем за весь период после обработки и выращивания поросят-сосунов среднее количество мух на один мухолов составило 17,2 экз., что в 6,9 раз меньше в сравнении с контролем. Интенсэффективность испытуемого препарата против имаго мух составила 85,65 %, против личинок мух – 98,96 %.
Этот же препарат был испытан на свиноводческом предприятии в цехе доращивания поросят [77]. Помещения обрабатывали Сольфаком Дуо СК 7,5 % совместно с препаратом на основе трифлумурона. Была получена 99,04% эффективность против имаго мух и 100 % эффективность против личинок.
Л. Нагорная и А. Березовский [49] проводили обработки в птичниках растворами цифлутрина (препарат под названием Цифлур) и установили высокую инсектицидную активность на все стадии развития мух. Технологическое оборудование и места выплода мух обрабатывали дезинсектантом из расчета 5 мл концентрата на 1 л проточной воды. Готовые растворы наносили методом орошения. До обработки плотность популяции личинок составляла 10-15 шт. в 100 г органических отходов, после обработок не выявлялись жизнеспособные личиночные стадии. Препарат на основе цифлутрина был предложен в качестве средства для деларвации мест выплода мух и для инсектицидных обработок внутри помещений.
Согласно Е.И. Олехнович [53], цифлутрин обладает высокой акарицидной активностью в отношении членистоногих, в частности клещей, вызывающих псороптоз кроликов - Psoroptes cuniculi, и может быть использован в низких концентрациях – 0,1%. При чем автор отмечает тот факт, что у клещей не наблюдали нокдаун-эффекта. Данные факты могут свидетельствовать о различиях в механизмах передачи нервного импульса у клещей и насекомых.
Достаточно интересный эксперимент был проведен Д.М. Коротовой [37], которая испытала на крысах препарат, предназначенный для защиты крупного рогатого скота от летающих двукрылых насекомых. Для борьбы с бескрылыми паразитами крыс препарат был применен впервые, однако показал хорошие результаты: в дозе 1-2- мг по ДВ на голову была получена 100 % эффективность против крысиной воши Polyplax spinulosa, а также клещей Chirodiscoides cavae и Demodex caviae.
Была изучена эффективность цифлутрина в борьбе с гнусом на пятнистых оленях [47]. Препарат в форме 1% раствора показал высокую эффективность против насекомых семейств Gastrophillidae, Hypodermatidae, Tabanidae, Hypoboscidae, Muscidae. Через 1 неделю защитное действие составило 98 %, со 2-ой до 5-ой недели - 96,5 - 86,9 %, через 6 недель после обработки - 76,7 %. Кроме того, авторами был изучен морфологический состав крови подопытных животных, при анализе которого было отмечено увеличение эритроцитов на 14,7 %, гемоглобина на 19 % и снижение лейкоцитов на 26 %.
Подострая токсичность Цифлунита Флок на крысах
В результате проведенного клинического осмотра животных опытных групп признаков интоксикации мы не выявляли, животные адекватно реагировали на внешние раздражители, охотно принимали корм и воду, каких-либо изменений кожного покрова на месте нанесения препарата не отмечали.
За все время опыта не отмечено статистически достоверных отличий в показателях массы подопытных крыс (график 2.2.4.1.). Кроме того, не выявлено достоверной разницы показателей процента прироста живой массы крыс опытных групп по сравнению с контрольными аналогами (таблица 2.2.4.1.).
Результаты расчетов массовых коэффициентов приведены в таблицах 2.2.4.2. и 2.2.4.3. и свидетельствуют о том, что в дозах 870, 435 и 174 мг/кг массовые коэффициенты всех органов животных на первые и десятые сутки после последнего нанесения препарата статистически достоверно не отличались от показателей контрольной группы.
По результатам макроскопического исследования органов различий по группам не установлено, в связи с чем, данные некропсии крыс представлены как средние для всех групп.
При наружном осмотре крыс выделений из естественных отверстий не обнаружено. Шерсть блестящая, без очагов аллопеции, зубы сохранены. Видимые слизистые оболочки бледно-розовые, блестящие. Деформации или отека конечностей не выявлено. Развитие наружных половых органов соответствует физиологической норме.
Грудная и брюшная полости выпота не содержали. Положение внутренних органов грудной и брюшной полостей анатомически правильные. Париетальный и висцеральный листки плевры и брюшины тонкие, блестящие, гладкие.
При макроскопическом исследовании печени, легких, почек, сердца, селезенки и кожного покрова после нанесения препарата крысам в трех испытанных дозах отмечено следующее.
Печень. В дозах 870, 435 и 174 мг/кг изменений в строении органа не обнаружено. Форма и величина печени соответствовала норме и не отличалась от контроля. Поверхность печени гладкая, однородной темно-красной окраски, капсула тонкая, прозрачная. Ткань печени на разрезе полнокровная, умеренно плотная.
Легкие. Во всех дозах строение органа соответствовало норме. Просвет трахеи и крупных бронхов не изменен, слизистая оболочка блестящая, гладкая, бледного цвета. Легкие воздушные, без уплотнений на ощупь, бледно-розовой окраски.
Почки. Во всех дозах изменения отсутствовали. Величина и форма почек не были изменены. Поверхность почек коричневатого цвета, гладкая, капсула тонкая, прозрачная, легко снимаемая. На разрезе органа хорошо различимы корковое и мозговое вещество.
Сердце. Во всех дозах строение органа соответствовало норме. Хорошо были видны протоки артериальных и венозных сосудов. Величина и форма сердца контрольных крыс не отличалась от опытных. В правом и левом желудочках содержалось незначительное количество темной жидкой крови. Клапаны сердца тонкие, блестящие, гладкие. Сердечная мышца на разрезе однородной вишнево-коричневатой окраски, умеренно плотная.
Селезенка обычной формы, темно-вишневого цвета, умеренно плотной консистенции. Поверхность органа гладкая, капсула тонкая. На разрезе на темно-красном фоне селезенки были видны мелкие фолликулы.
Кожа. На поверхности кожи, а также в подкожной жировой клетчатке изменений не выявлено.
При проведении патологоанатомического вскрытия на 17 сутки опыта не выявлено каких-либо отличий в макроскопическом строении органов крыс опытных групп в сравнении с контрольными аналогами.
Результаты определения гематологических показателей обобщены в таблицах 2.2. 4.4. и 2.2.4.5. Длительное нанесение Цифлунита Флок в трех дозах не отразилось отрицательным образом на гематологических показателях крови крыс. Также отметим, что многократное нанесение Цифлунита Флок не привело к изменениям лейкограммы.
В таблицах 2.2.4.6. и 2.2.4.7. приведены результаты определения биохимических показателей сыворотки крови после многократного нанесения Цифлунита Флок. При исследовании сыворотки крови крыс на 1 и 10 сутки после последнего нанесения препарата не выявлено каких-либо статистически достоверных отличий опытных показателей в сравнении с контролем. Все показатели находились в пределах установленных физиологических норм.
Полученные результаты субхронического эксперимента дали основание полагать, что дозы 870, 435 и 174 мг/кг при семисуточном накожном нанесении крысам являются не действующими (безопасными).
Разработка метода ВЭЖХ для определения содержания цифлутрина в сыворотке крови и молоке овец и коз
В рамках наших исследований совместно с заведующим испытательной лабораторией ООО МНИЦ «ОЗОС» и научным сотрудником ВНИИП Кочетковым П.П. был разработан ВЭЖХ метод, позволяющий определять цифлутрин в биоматрицах. Принцип метода заключается в хроматографировании цифлутрина на жидкостном хроматографе высокого давления с обращеннофазовой колонкой экстрактов сыворотки крови и молока, полученных после осаждения белков, и обработки полученных данных с помощью программы «Breeze» (версия 3.3SPA).
Полученные результаты калибровки цифлутрина в элюенте представлены в таблице 2.2.9.1. и на рисунках 2.2.9.1. и 2.2.9.2. Расчт стабильности растворов на протяжении проведения исследований основан на отношении площадей пиков в конечный и начальный момент времени. Полученный параметр 100 – ST сравнивается с рассчитанным показателем точности метода, полученным в ходе расчта метрологических характеристик. Как видно из таблицы 2.2.9.2., калибровочные растворы стабильны на протяжении двух суток. Полученные результаты калибровки цифлутрина в сыворотке представлены в таблице 2.2.9.3. и на рисунке 2.2.9.3.
Степень извлечения цифлутрина (ЕCFl) рассчитывали по следующей формуле: ЕCFL = 2.2Sоб. / Sст.. где: Sоб. – площадь пика цифлутрина в экстракте сыворотки крови; Sст. – площадь пика цифлутрина в элюенте (среднее значение площади пика соответствующей концентрации. полученной в 1-й день калибровки. см. таблицу 2.1); 2.2 – коэффициент разбавления пробы.
Полученные результаты представлены в таблице 2.2.9.4.
Для вычисления концентрации цифлутрина в экстрактах сыворотки применили уравнение, полученное для линии тренда калибровочного графика по экстрактам: где: CCFL - искомая концентрация цифлутрина в сыворотке крови, нг/мл; SCFL - площадь пика цифлутрина в экстракте пробы; к - угловой коэффициент. равный 59.346.
Определение пределов детектирования (LOD) и пределов количественного определения (LOQ) для цифлутрина
На основании полученных пустых хроматограмм (без добавления аналита) были экспериментально установлены пределы обнаружения (LOD) и пределы измерения (LOQ). Определение LOD и LOQ осуществлялось в соответствии с [64, 98]. Пример пустой хроматограммы, использованной для вычисления LOD и LOQ, приведен на рисунке 2.2.9.4. На хроматограмме выделен "пик" шума при времени удерживания, соответствующем времени удерживания цифлутрина. Рисунок 2.2.9.4. - Пример «пустой» хроматограммы экстракта сыворотки крови, использованной для вычисления LOD и LOQ цифлутрина
Предел обнаружения LOD анализируемого соединения определяют как концентрацию, соответствующую (по калибровочному уравнению. установленному выше) утроенному значению стандартного отклонения шума: Где, а – угловой коэффициент калибровочного графика. равный 59,346 (Рис. 2.5).
Предел количественного определения LOQ анализируемого соединения определяют, как концентрацию. соответствующую (по калибровочному уравнению. установленному выше) значению стандартного отклонения шума. умноженному на 9:
Данные по вычислению значений пределов детектирования и количественного определения приведены в таблице 2.2.3.5. Полученное значение LOQ соответствует необходимым требованиям европейского агентства по развитию медицинской продукции [97].
Метрологическую аттестацию методики проводили в соответствии с [64, 87, 97] по содержанию цифлутрина в сыворотке крови. Для эксперимента были использованы несколько растворов (образцов калибровки в сыворотке крови) цифлутрина в сыворотке крови с концентрациями 10. 50. 100. 500 и 1000 нг/мл. Полученные данные представлены в таблицах 2.2.9.6 и 2.2.9.7
Для эксперимента были использованы несколько растворов (образцов калибровки в молоке) цифлутрина в молоке с концентрациями 10, 50, 100, 500 и 1000 нг/мл. Полученные данные представлены в таблицах 2.2.9.12 и 2.2.9.13.
Таким образом, предложенный метод был линеен в диапазоне 10 – 1000 нг/мл (R 0.99) и показал хорошую повторяемость и точность. Метод позволяет идентифицировать цифлутрин в модельных пробах и образцах молока.
Комиссионные испытания Цифлунита Флок при мелофагозе овец
Терапевтическая эффективность и период защиты Цифлунита Флок при мелофагозе овец отражены в таблице 2.2.12.8.1.
До применения препарата количество Melophagus ovinus на животных в опытной группе составило 26,8±5,9 экз., а в контрольной группе 29,2±8,2 экз. При осмотрах покрова животных через 20 и 30 суток после однократной обработки Цифлунитом Флок в опытной группе отмечали незначительный рост числа половозрелых овечьих кровососок. Интенсэффективность препарата через 20 суток после обработки составила 98,88 %, через 30 суток – 96,94 %. Период защитного действия составляет 30 суток. В последующие сутки у отдельных овец начали отмечать признаки мелофагоза.
Согласно данным общемировой литературы [6, 14, 28, 30, 31, 43, 84, 105, 111, 112, 122] энтомозы мелкого рогатого скота наносят большой ущерб животноводству, который проявляется в снижении племенных качеств, мясной, шерстной и молочной продуктивности. Препараты, предложенные для борьбы с эктопаразитами, должны быть эффективными, безопасными, удобными в применении на практике и обладать длительным периодом защитного действия.
Традиционно для защиты животных от насекомых применяют инсектициды контактного действия. К таким инсектицидам относится цифлутрин, на основе которого компанией ООО «НИТА-ФАРМ» был разработан препарат Цифлунит Флок в форме 0,1% раствора, предназначенный для защиты мелкого рогатого скота от насекомых. Аналогичного препарата на российском ветеринарном рынке не существует. Для приобретения лекарственных средств из-за рубежа требуются большие финансовые затраты, а препараты, производимые на территории РФ, более доступны широкому кругу потребители.
Для внедрения нового препарата в практику в соответствии с законодательной базой в фармацевтической сфере должны быть проведены доклинические и клинические испытания, подтверждающие эффективность и безопасность его применения. Проведенные нами комплексные исследования токсикологических свойств, терапевтической эффективности, а также фармакокинетических параметров и остаточных количеств цифлутрина доказали целесообразность применения на практике препарата Цифлунит Флок для защиты мелкого рогатого скота от эктопаразитов.
Полученные экспериментальные данные согласуются с результатами исследователей, также занимавшихся изучением фармако-токсикологических свойств цифлутрина [4, 24, 90]. Так, при изучении параметров острой пероральной токсичности препарата на двух биологических видах тест-систем, мы установили, что мыши более чувствительны к цифлутрину, чем крысы. Значение LD50 у мышей-самцов и мышей-самок при расчете по методу Миллера, Тейнтера составили 13700±2646,5 (11053,516346,5) мг/кг и 13670±2646,5 (11113,516406,5) мг/ кг соответственно, при расчете по методу Кербера 12180 мг/кг. Значение LD50 у крыс-самцов и крыс-самок при расчете по методу Миллера, Тейнтера составили 23000±3232,7 (19767,326232,7) мг/кг и 23900±3502 (2039827402) мг/кг, при расчете по методу Кербера - 22475 мг/кг и 23925 мг/кг соответственно. Как следует из представленных данных, половая чувствительность лабораторных животных к цифлутрину отсутствует – показатели LD50 у самцов и самок в пределах одного вида имеют близкие значения. Однако, имеет месту быть видовая чувствительность животных к препарату.
При изучении параметров острой накожной токсичности было установлено, что LD50 исследуемого препарата превышает испытанную дозу 8700 мг/кг.
Полученные результаты острой пероральной и накожной токсичности позволили нам отнести Цифлунит Флок к 4 классу опасности (вещества малоопасные).