Синтез и фармако-токсикологическая характеристика ветеринарных противопаразитарных и антибактериальных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов Зубенко Александр Александрович

Содержание к диссертации

Введение

1.Обзор литературы 19

1.1. Проблема лекарственной устойчивости микроорганизмов и пути её преодоления 19

1.2. Проблема резистенности насекомых и клещей и пути её преодоления 34

1.3. Поиск антибактериальных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов .38

1.4. Поиск противопаразитарных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов 43

1.5. Подходы к компьютерному прогнозированию биологической активности органических соединений 50

2. Материалы и методы исследований 58

2.1. Общие сведения. Методы синтеза инсектоакарицидных соединений в ряду азотсодержащих гетероциклов 58

2.2. Методы синтеза соединений с сочетанным протистоцидным и антибактериальным действием 61

2.3. Методы оценки инсектоакарицидной, протистоцидной и антибактериальной активности синтезированных соединений 97

2.4. Методы оценки токсичности полученных соединений 103

2.5. Методы изучения терапевтической эффективности препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных 105

2.6. Изучение особенностей фармакокинетики препарата ДИХИМ-1 113

2.7. Методы оценки фармако-токсикологических свойст донорно-акцепторных комплексов йода с азотсодержащими гетероциклами 114

2.8. Изучение терапевтической эффективности перйодида гексаметилентетрамина и препарата на его основе «Колицид» при колибактериозе телят .117

3. Результаты исследований 119

3.1. Целенаправленный синтез инсектоакрицидных соединений, основанный на научной гипотезе 119

3.2. Показатели инсектоакарицидной активности новых соединений 121

3.3. Фармако-токсикологическая характеристика нового инсектоакарицидного препарата ДИХИМ

3.3.1. Разработка лекарственной формы препарата ДИХИМ – 1 .123

3.3.2. Исследование токсических свойств препарата ДИХИМ – 1 124

3.3.3. Исследование эффективности препарата ДИХИМ – 1

при различных заболеваниях животных 129

3.3.4. Особенности распределения препарата ДИХИМ – 1 в организме лабораторных животных 131

3.3.5. Разработка методических положений и инструкции по применению препарата ДИХИМ-1 132

3.4. Целенаправленный синтез протистоцидных соединений, основанный на научной гипотезе 134

3.5. Производные азотсодержащих гетероциклов, обладающие сочетанным антипротозойным и антибактериальным действием 149

3.5.1. Антибактериальая активность и токсичность соединений в ряду бензимидазола.. 149

3.5.2. Сводная таблица по результатам определения антибактериальной активности.. 1 3.6. Антибактериальная активность и токсичность донорно-акцепторных комплексов галоген – гетероциклы (типа n-) 163

3.7. Изучение развития резистентности E.coli к перйодидам азотсодержащих гетероциклов 170

3.8. Величины ЛД50 перйодидов азотсодержащих гетероциклов 171

3.9. Влияние перйодидов азотсодержащих гетероциклов на свойства

(активность) лактоглобулинов 173

3.10. Совместимость перйодидов азотсодержащих гетероциклов с

антибактериальными препаратами по тесту

антимикробной активности .177

3.11. Совместимость перйодидов азотсодержащих гетероциклов с атибактериальными препаратами и средствами регидратации по тесту острой токсичности 181

3.12. Скорость разложения перйодидов в желудочно-кишечном тракте лабораторных крыс. 183

3.13. Применение донорно-акцепторного комплекса йода с гексаметилентетрамином и препарата на его основе «колицида»

для лечения телят при колибактериозе 185

4. Обсуждение результатов 191

4.1. Обсуждение результатов поиска инсектоакарицидных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов и перспективы развития данного направления 191

4.2. Обсуждение результатов поиска препаратов с сочетанным антибактериальным и антипротозойным действием и перспективы развития данного направления 201

4.3. Обсуждение результатов исследований по разработке антибактериальных препаратов на основе донорно-акцепторных комплексов йода с азотсодержащими гетероциклами. Перспективы развития данного направления 205

5.Выводы 218

6.Список литературы

• Поиск противопаразитарных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов
• Методы оценки инсектоакарицидной, протистоцидной и антибактериальной активности синтезированных соединений
• Фармако-токсикологическая характеристика нового инсектоакарицидного препарата ДИХИМ
• Обсуждение результатов поиска препаратов с сочетанным антибактериальным и антипротозойным действием и перспективы развития данного направления

Введение к работе

Актуальность темы. Фундаментальным свойством живых организмов является их способность приспосабливаться к неблагоприятным факторам окружающей среды. Не удивительно, что широкое применение химиотерапевтических антибактериальных и противопаразитарных средств приводит к появлению резистентных популяций как микробов, так и паразитов (Смирнов А.А., 1999; Кирилловсих В.А., 2005; Ventos S., 2010; Panasevich L.S., 2004; Mani N., 2006; Grossmann Т.Н., 2007; Charifson P.S., 2008.). Это создает напряженную ситуацию с сохранностью сельскохозяйственных животных (Мейнел Г., 1976; Кудлай Д.Г., 1977; Зароза В.Г., 1991; Макаров В.В. с соавт., 2000; Шахов А.Г. с соавт., 2000, 2003; Косенко Ю.М., 2009; Карева Э.П., 2012; Клименко А.И. с соавт., 2012). Без расширения арсенала терапевтических средств для ветеринарной медицины трудно ожидать эффективного ведения животноводства.

Следствием этого является необходимость синтеза новых препаратов, в том числе противопаразитарных и антибактериальных средств, что является одним из перспективных направлений ветеринарной фармакологии (Антипов В.А.,2008, 2009, 2011; Кузин М.И., 1990; Стручков В.И. с соавт., 1991; Алексеев К.В. с соавт., 2000; Морковник А.С., 2013).

Производные азотсодержащих гетероциклов (имидазола, бензимидазола и других) обладают разнообразной биологической активностью вкупе с низкой токсичностью, поэтому поиск лечебных препаратов в этой области весьма перспективен и постоянно привлекает исследователей (Preston F.N., 1974; Куколенко С.С. с соавт., 1976; Арзыбаев М., 2002; Malleshappa Noolvi et al, 2014). На базе имидазольных систем созданы антигельминтные, фунгицидные, иммуномодулирующие, адаптогенные и другие средства.

Необходимость разработки новых лечебных средств для ветеринарии определяет цель и задачи данного исследования.

Объект исследования: производные азотсодержащих гетероциклов общей формулы А, методы их синтеза, методы биотестирования, лабораторные и сельскохозяйственные животные.

R3.

N

Предмет исследования: противопаразитарные, антибактериальные, токсикологические и терапевтические свойства новых производных азотсодержащих гетероциклов.

Научная гипотеза. При поиске новых лечебных средств в ряду азотсодержащих гетероциклов общей формулы А (указаны заместители R1-R4 и нумерация атомов в цикле) нами использован целенаправленный подход, основанный на синтезе структур, которые могут быть миметиками природных и синтетических соединений с известной биологической активностью. Как известно, введение различных заместителей, либо замена целых фрагментов придают новые ценные фармако-токсикологические особенности известным препаратам.

В своей работе мы руководствовались следующими предположениями:

Пятичленный имидазольный фрагмент в структуре А при соответствующих заместителях Rl, R2, R3 и R4 может выполнять те же функции (быть миметиком), что и шестичленный пиридиновый цикл в алкалоидах анабазине и никотине, которые обладают инсектоакарицидной активностью. Такая замена может привести к новым противопаразитарным препаратам с полезными свойствами.

Введение в структуру 2-аминобензимидазола (R2=NH2; R3,R4= СН=СН-СН=СН) объёмных липофильных заместителей в положения 1 и 3

5 может усилить обнаруженную нами антипротозойную и антибактериальную активность соединений этого ряда.

Атом азота, обладающий основными свойствами (положение 3 в формуле А) может быть использован для образования донорно-акцепторных комплексов с антибактериальными галогенами, что придаст ценные фармако-токсикологические свойства данным комплексам в сравнении с исходными компонентами.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований явилось разработка методов синтеза, изучение фармако-токсикологических свойств и научное обоснование принципов применения в ветеринарной медицине новых противопаразитарных и антибактериальных препаратов из ряда азотсодержащих гетероциклов.

Для достижения намеченной нами цели были поставлены следующие задачи исследования:

1. Основываясь на научной гипотезе, синтезировать массив новых производных азотсодержащих гетероциклов.

2. Разработать эффективные экспресс-методики и провести скрининг синтезированных соединений на противопаразитарную активность.

3. Изучить фармако-токсикологические параметры соединений с высокой инсектоакарицидной и антибактериальной активностью.

4. Разработать лекарственные формы на основе веществ с высокой биологической активностью и низкой токсичностью.

5. Изучить терапевтическую эффективность препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах (эктопаразитозах) животных.

6. Изучить терапевтическую эффективность нового комлексного препарата при колибактериозе телят.

Научная новизна. Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о возможности получения высокоэффективных инсектоакарицидных средств путём замены шестичленного пиридинового кольца на пятичленный

6 имидазольный цикл в структуре природных противопаразитарных алкалоидов анабазине и никотине. Выявлена зависимость величины активности от вида, количества и местоположения заместителей в имидазольном кольце. С учётом выявленных зависимостей структура-активность, было синтезировано новое органическое соединение: 2-(4,5-дихлор-1 -имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин, которое предложено в качестве активно действующего вещества инсектоакарицидного препарата ДИХИМ-1. По результатам исследований получено три патента (патент RU № 2355388 «Способ лечения псороптоза овец и препарат для его осуществления», патент RU №2425035 «Способ получения 4,5-дихлоримидазолов» и патент RU №2427365 «Способ лечения арахноэнтомозов животных и препарат для его осуществления»). «Методические положения по применению препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных», а также «Регламент лабораторный приготовления препарата ДИХИМ-1 для лечения эктопаразитозов животных» рассмотрены и одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол №3 от «23» сентября 2010г.

Впервые обнаружен эффект, состоящий в том, что введение заместителей в положения 1 и 3 азотсодержащего гетероцикла бензимидазола при наличии аминогруппы в положении 2 приводит к появлению противопаразитарных (антипротозойных) свойств. При этом анализ зависимости структура-активность позволяет сделать заключение, что решающее значение для наличия активности имеют свойства 1,3-заместителей: гидрофильные заместители и заместители небольшого размера резко снижают активность, 3,4-дихлорбензильный и бета-феноксиэтильный заместители в первом и (или) третьем положении обеспечивают высокий антипротозойный эффект: 11 соединений этого ряда имеют МИК менее 1 мкг/мл в отношении Colpoda steinii. Наряду с этим, структуры с такими заместителями показали высокую антибактериальную активность с величинами МИК 1-5 мкг/мл в отношении St.aureus и 20-50 мкг/мл в отношении E.coli. Разработка «1-<ю-Арилоксиалкил -и 1-бензилзамещенные 2-иминобензимидазолины и их фармакологически

7 приемлемые соли, обладающие протистоцидной и антимикробной активностью» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2514196. Разработка «1,3-Дизамещенные 2-иминобензимидазолина, обладающие антибактериальным действием» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2423355. Разработан «Регламент лабораторный (технологический) синтеза и очистки антибактериальных препаратов на основе 2-иминобензимидазола», который рассмотрен и одобрен секцией «Инфекционная патология животных» Отделением ветеринарной медицины РАСХН, протокол №2 от 16.04.2013 г.

Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза, заключающаяся в том, что образование донорно-акцепторных комплексов с участием молекулы йода и азотсодержащими основными гетероциклами может привести к препаратам, выгодно отличающимся по фармако-токсикологическим характеристикам от других форм комбинированных препаратов йода. Установлено, что при образовании комплекса резко снижается токсичность комплекса в сравнении с чистым йодом, причем антибактериальная активность при этом не изменяется, а в отношении некоторых микроорганизмов повышается: МИК комплексных соединений йода с азотсодержащими гетероциклами в отношении E.coli составляет 0,20 - 6,25 мкг/мл, в отношении Staph.aureus - 0,78 - 6,25 мкг/мл, в то время как для водного раствора йода в йодиде калия МИК составляют 16,0 - 64,0 и 64,0 мкг/мл соответственно. При этом улучшились такие важные характеристики, как безвредность и стабильность в желудочно-кишечном тракте, что позволило создать препарат «Колицид» для лечения телят при колибактериозе (патент SU №1809942 A3).

Теоретическая и практическая значимость работы.

Модификация алкалоидов анабазина и никотина путем замены шестичленного пиридинового фрагмента на 4,5-дихлорзамещённое производное пятичленного гетероцикла имидазола приводит к эффективным

8 инсектоакарицидам. Это теоретическое положение открывает новые направления в разработке противопаразитарных препаратов.

Полученные в настоящей работе данные позволили установить, что образование донорно-акцепторной связи между йодом и третичным атомом азота гетероциклов придает новым комплексам ряд существенных особенностей по сравнению с отдельными компонентами: резко снижается токсичность йода, повышается устойчивость к инактивирующим веществам, увеличивается антибактериальная активность в отношении некоторых организмов, пролонгируется действие в желудочно-кишечном тракте.

Практическая значимость работы выражается в создании двух новых ветеринарных препаратов для лечения животных при эктопаразитозах и инфекционных заболеваниях.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Модификация алкалоидов анабазина и никотина путем замены
шестичленного пиридинового фрагмента на производные пятичленного
гетероцикла имидазола при соответствующем подборе заместителей приводит
к новым эффективным противопаразитарным препаратам с полезными
свойствами.

2. Решающее влияние на активность оказывает количество метиленовых звеньев между имидазольным гетероциклом и кольцом 2-(нитровинил)-имидазолидина: соединения с одним метиленовым звеном обладают инсектоакарициднои активностью; увеличение числа звеньев до двух или трёх приводит к полной потере активности.

3. Образование донорно-акцепторных комплексов с участием молекулы йода и азотсодержащими основными гетероциклами с пиридиновым атомом азота позволяет получить препараты, выгодно отличающимся по фармако-токсикологическим характеристикам от других форм комбинированных препаратов йода.

4. Разработка донорно-акцепторных комплексов типа п-а галоген-
третичный амин - перспективный путь создания новых химиотерапевтических

9 средств с высокой антибактериальной активностью политропного действия, низкой токсичностью и длительным действием в условиях желудочно-кишечного тракта животных.

5. Донорно-акцепторные комплексы йода с 5,6-диметилбензимидазолом,
1,2-диметил-5-метоксибензимидазолом и гексаметилентетрамином не влияют
на свойства противоколипротейного лактоглобулина, совместимы со
средствами регидратации и некоторыми антибактериальными препаратами (в
12 комбинациях из 18 изученных) как по тесту антибактериальной активности,
так и по тесту токсичности.

6. В ряду производных 1,3-дизамещенного 2-иминобензимидазолина,
обладающих сочетанным противопаразитарным и антибактериальным
действием, гидрофильные заместители и заместители небольшого размера
резко снижают активность; соединения с 3,4-дихлорбензильным и бета-
феноксиэтильным заместителями в первом и (или) третьем положении
обеспечивают высокий антипротозойный и антибактериальный эффект.

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на 25 Российских и Международных конференциях в период с 1991 по 2013 годы, а также представлены на 7 Международных и Российских выставках.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 81 научная работа, 19 из них - в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 методическое пособие и 7 патентов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложения на 29 страницах. Работа изложена на 287 страницах компьютерного текста, содержит 36 схем, 38 таблиц. Библиографический список включает 373 источника, в том числе 144 иностранных.

Поиск противопаразитарных препаратов в ряду азотсодержащих гетероциклов

Научная новизна. Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза о возможности получения высокоэффективных инсектоакарицидных средств путём замены шестичленного пиридинового кольца на пятичленный имидазольный цикл в структуре природных противопаразитарных алкалоидов анабазине и никотине. Выявлена зависимость величины активности от вида, количества и местоположения заместителей в имидазольном кольце. С учётом выявленных зависимостей структура-активность, было синтезировано новое органическое соединение: 2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил) имидазолидин, которое предложено в качестве активно действующего вещества инсектоакарицидного препарата ДИХИМ-1. По результатам исследований получено три патента (патент RU № 2355388 «Способ лечения псороптоза овец и препарат для его осуществления», патент RU №2425035 «Способ получения 4,5-дихлоримидазолов» и патент RU №2427365 «Способ лечения арахноэнтомозов животных и препарат для его осуществления»). «Методические положения по применению препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных», а также «Регламент лабораторный приготовления препарата ДИХИМ-1 для лечения эктопаразитозов животных» рассмотрены и одобрены секцией «Инвазионные болезни животных» Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, протокол №3 от «23» сентября 2010г.

Впервые обнаружен эффект, состоящий в том, что введение заместителей в положения 1 и 3 азотсодержащего гетероцикла бензимидазола при наличии аминогруппы в положении 2 приводит к появлению противопаразитарных (антипротозойных) свойств. При этом анализ зависимости структура активность позволяет сделать заключение, что решающее значение для наличия активности имеют свойства 1,3-заместителей: гидрофильные заместители и заместители небольшого размера резко снижают активность, 3,4 дихлорбензильный и бета-феноксиэтильный заместители в первом и (или) третьем положении обеспечивают высокий антипротозойный эффект: 11 соединений этого ряда имеют МИК менее 1 мкг/мл в отношении Colpoda steinii. Наряду с этим, структуры с такими заместителями показали высокую антибактериальную активность с величинами МИК 1-5 мкг/мл в отношении St.aureus и 20-50 мкг/мл в отношении E.coli. Разработка «1--Арилоксиалкил и 1-бензилзамещенные 2-иминобензимидазолины и их фармакологически приемлемые соли, обладающие протистоцидной и антимикробной активностью» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2514196. Разработка «1,3–Дизамещенные 2-иминобензимидазолина, обладающие антибактериальным действием» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2423355. Разработан «Регламент лабораторный (технологический) синтеза и очистки антибактериальных препаратов на основе 2 иминобензимидазола», который рассмотрен и одобрен секцией «Инфекционная патология животных» Отделением ветеринарной медицины РАСХН, протокол № 2 от 16.04.2013 г. Сформулирована и экспериментально подтверждена гипотеза, заключающаяся в том, что образование донорно-акцепторных комплексов с участием молекулы йода и азотсодержащими основными гетероциклами может привести к препаратам, выгодно отличающимся по фармако токсикологическим характеристикам от других форм комбинированных препаратов йода. Установлено, что при образовании комплекса резко снижается токсичность комплекса в сравнении с чистым йодом, причем антибактериальная активность при этом не изменяется, а в отношении некоторых микроорганизмов повышается: МИК комплексных соединений йода с азотсодержащими гетероциклами в отношении E.coli cоставляет 0,20 – 6,25 мкг/мл, в отношении Staph.aureus – 0,78 - 6,25 мкг/мл, в то время как для водного раствора йода в йодиде калия МИК составляют 16,0 – 64,0 и 64,0 мкг/мл соответственно. При этом улучшились такие важные характеристики, как безвредность и стабильность в желудочно-кишечном тракте, что позволило создать препарат «Колицид» для лечения телят при колибактериозе (патент SU № 1809942 А3).

Разработка «Перйодиды бензимидазолия, обладающие антимикробным действием» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2009132. Разработка «Производные пиридо[1,2-a] бензимидазола, обладающие антибактериальным действием и способ их получения» признана изобретением и защищена патентом РФ № 2394824. Разработка «Производные полиоснования, обладающие антибактериальной и иммуностимулирующей активностью» признана изобретением и защищена патентом RU № 2051156. Разработки новых методов синтеза производных бензимидазола защищены тремя патентами: АС USSR № 449047 «Способ получения производных 4-(бензимидазолил-2)-метилен-диоксолана-1,3»; АС USSR № 444768 «Способ получения производных 4-(бензимидазолил-2)-метилен-диоксолана-1,3»; АС USSR № 433148 «Способ получения виниловых эфиров в ряду 2-замещённых бензимидазола». Теоретическая и практическая значимость работы. Модификация алкалоидов анабазина и никотина путем замены шестичленного пиридинового фрагмента на 4,5-дихлорзамещённое производное пятичленного гетероцикла имидазола приводит к эффективным инсектоакарицидам. Это теоретическое положение открывает новые направления в разработке противопаразитарных препаратов.

Полученные в настоящей работе данные позволили установить, что образование донорно-акцепторной связи между йодом и третичным атомом азота гетероциклов придает новым комплексам ряд существенных особенностей по сравнению с отдельными компонентами: резко снижается токсичность йода, повышается устойчивость к инактивирующим веществам, увеличивается антибактериальная активность в отношении некоторых организмов, пролонгируется действие в желудочно-кишечном тракте.

Методы оценки инсектоакарицидной, протистоцидной и антибактериальной активности синтезированных соединений

Растворяют 288г NaOH (7,20моль) в 700,0 мл воды, охлаждают до 20,0-25,0 0С, смешивают с 3кг колотого льда в колбе объемом 5,0 литров. В полученную смесь пропускают хлор, полученный из 270,0 г KMnO4 и 1,20 л концентрированной соляной кислоты в течение 40-60 минут. Затем в реакционную смесь добавляют раствор 72,0г NaOH (1,80 моль) в 200,0 мл воды и 1,50 кг мелкораздробленного льда. Перемешивают 1 минуту и добавляют в один прием 122,40г (1,80 моль) имидазола и интенсивно перемешивают 5 минут. Температура реакционной смеси не превышает 0 0С. Затем реакционную смесь оставляют без перемешивания на 30,0 минут. Подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 4,5, отфильтровывают, осадок промывают водой. Выход 205,0-215,0г (83,0-87,0%). Перекристаллизовывают из воды с углем. Выход белоснежных кристаллов чистого 4,5-дихлоримидазола (2) составляет 167,0-185,0 г (68,0-75,0 %). 4,5-Дихлор-1-оксиметилимидазол (3) Смешивают 13,70 г (0,10 моль) 2 с 25,0 мл 150,0 %-го водного формальдегида. Перемешивают 2-3 минуты до затвердевания реакционной смеси. Затем нагревают на водяной бане до образования раствора, охлаждают ледяной водой, отфильтровывают осадок, промывают ледяной водой (3х10 мл). Сушат на воздухе до постоянного веса. Выход 15,20 г (91,0%). 4,5-Дихлор-1-хлорметилимидазол (4) Смешивают 6,68 г (0,04 моль) 3 с 15,0 мл хлороформа, добавляют по каплям при охлаждении и перемешивании 3,20 мл хлористого тионила (5,29 г; 0,045 моль). Затем реакционную массу кипятят при перемешивании 3,0 часа. Охлаждают, отфильтровывают примесь, фильтрат упаривают до объема 5,0 мл и пропускают через слой Al2O3 в хлороформе. Сушат и упаривают в вакууме. Выход 5,80 г (78,0%). Светло-желтое масло. Спектр ПМР, , м.д.: 7,62, синглет, один протон; 5,6, синглет, 2 протона метиленового звена. 2-(4,5-Дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин (1) К смеси 12,40 г (0,096 моль) 5 и 150,0 мл диметилформамида добавляют по частям при перемешивании и охлаждении 3,84 г 60,0 % гидрида натрия (0,096 моль) и перемешивают 30 минут. Затем в реакционную смесь добавляют по каплям раствор 18,55 г 4 в 20,0 мл диметилформамида, поддерживая температуру не выше 20,0 С. Перемешивают 30,0 минут, отгоняют растворителем в вакууме, остаток обрабатывают последовательно этилацетатом и водой. Перекристаллизовывают из ацетонитрила. Выход 16,0 г (60,0%).

Т.пл. 178-180С (разл.). Спектр ПМР, , м.д.: 9,05, синглет, N-H; 7,85, синглет, протон имидазольного кольца; 7,05,синглет, N-H; 5,5, синглет, 2 протона метиленового звена; 3,62, 4 протона имидазолидинового цикла.

В трехгорлой кругло донной термостойкой колбе объемом 100,0 мл смешивают 1,30 г (10,0 ммоль) 2-аминобензимидазола и раствор 1,30 г (20,0 ммоль) КОН (в расчете на 85,0 % содержание КОН) в 1,50 мл воды, к охлажденному раствору (к.т. 1) добавляют 10,0 мл ацетона и в полученную двухфазную систему при интенсивном перемешивании порциями вносят 2,0г (10 ммоль) 2-феноксиэтилбромида (к.т.2) так, чтобы температура реакционной массы не превышала 25,0 оС (к.т.3). По окончании прибавления смесь перемешивают 2 часа при 45,0 оС охлаждают, отделяют ацетоновый слой на делительной воронке (объем 100,0 мл), водно-щелочной слой еще дважды встряхивают с ацетоном (10,0мл 2), ацетоновые фракции объединяют, а затем ацетон упаривают на роторном испарителе до объема 10,0 мл. Реакционную массу выливают в 20,0 мл воды, а выпавшие при этом светло-розовые кристаллы амина отфильтровывают и промывают их 5 мл воды, а затем высушивают их при комнатной температуре. Выход 2,0 г (79,0 %). (к.т. 4). Бесцветные пластинки с т. пл. 167,0 – 168,0 оС (из изопропанола) (к.т.5).

К нагретому до 60,0 оС раствору (к.т.1) 2,50 г (10,0 ммоль) 1-(2-феноксиэтил)-2-аминобензимидазола в 20,0 мл этанола прибавляют 1,60 г (20,0 ммоль, 1,30 мл) этиленхлоргидрина и кипятят в круглодонной термостойкой колбе. Сразу начинает образовываться мелкие бесцветные кристаллы, которые по мере протекания реакции увеличиваются в объеме. Кипение продолжают 2 часа (к.т.2), а затем отфильтровывают 2-имино-1-(2-феноксиэтил)-1,3-дигидро-3-(2-гидроксиэтил)бензимидазолина гидрохлорид, тщательно промывают осадок этанолом (5 мл 2) и высушивают. Выход 2,50 г (76,0 %) (к.т. 3). Бесцветные мелкие кристаллы с т. пл. 263 – 264 оС (из этанола) (к.т. 4).

Спектр NCH2CH2OH + NCH2CH2OAr); 4,65 (т, 2Н, CH2OAr); 5,10 (уш.с, 1Н, ОН); 6,80 (д, 2Н, орто-Н Ar); 6,86 (т, 1Н, пара-Н ArO); 7,22 (т, 2H, мета-H Ar,) 7,24-7,28 (м, 2Н, 5,6-Н бензимидазолинового фрагмента); 7,58 (д, 1Н, 7-Н бензимидазолинового фрагмента); 7,62 (д, 1Н, 4-Н бензимидазолинового фрагмента); 9,10 (с, 2Н, =N+H2). (К.т. 5). Найдено (%): С 61,82; H 5,62; Cl 10,24; N 12,31. С17Н20ClN3O2. Вычислено (%): С 61,17; Н 6,04; Cl 10,62; N 12,59. К.т. 1. Температуру строго фиксируют воизбежании выброса реакционной массы при добавлении этиленхлоргидрина. К.т. 2. Время реакции определено путем отбора проб и хроматографического контроля. Пробу реакционной массы обрабатывают разбавленной щелочью до рН 8, извлекают хлороформом продукт и ставят тонкослойную хроматограмму на окиси алюминия III степени активности в хлороформе. Rf имина 0,25, Rf исходного амина 0,10. К.т.3. Выход определяют после тщательного высушивания неочищенного продукта. К.т.4.Температуру плавления вещества определяют после перекристаллизации из изопропанола. К.т. 5. Спектры ЯМР 1H регистрировали на спектрометре Varian Unity-300 («Bruker», Германия) с рабочей частотой 300 МГц в режиме внутренней стабилизации полярно-резонансной линии 2H дейтерированного растворителяЯМР 1Н, (300 МГц), , м.д. (DMSO-d6): 3,72 (т, 2Н, CH2OH); 4.25-4,38 (м, 4H ,.

Фармако-токсикологическая характеристика нового инсектоакарицидного препарата ДИХИМ

Саркоптоз свиней. Испытание провели на 231 голове (в трех опытах) свиней по методике, изложенной в разделе 2 «Материалы и методики исследований». Обработку приводили путем двукратного опрыскивания 0,05% (по АДВ) растворам препарата ДИХИМ-1. Наблюдениями в течение 10 дней после второй обработки установили, что общее состояние животных опытной группы улучшилось, беспокойство и зуд прекратились, ранки и язвочки на коже подсохли, новые очаги поражения не обнаруживались, клещей в соскобах кожи не находили. В группе, обработанной неоцидолом у части свиней (5 из 15 контрольных), которые были наиболее поражены, беспокойство и зуд уменьшились, но не прекратились полностью. Поэтому они были обработаны препаратом ДИХИМ-1. В группе чистого контроля признаки чесотки усилились зуд и беспокойства нарастали, у животных снизался аппетит, развивалось угнетение. В двух опытах животных контрольных групп обрабатывали бутоксом по инструкции. В одном из них ДИХИМ-1 и бутокс показали приблизительно одинаковый терапевтический эффект, в другом опыте после двукратной обработки бутоксом у части животных обнаруживали клещей в соскобах кожи, что потребовало третьей обработки.

Заключение. Установлено, что двукратная обработка с интервалом 10 дней свиней препаратом ДИХИМ-1 0,05% концентрации по АДВ путем опрыскивание из расчёта 15мл на 1кг массы тела освобождает животных от клещей Sarcoptes suis. Испытания показали, что ДИХИМ-1 превышает по эффективности неоцидол и, в отдельных случаях, бутокс.

Сифункулятоз свиней. Испытания провели на 214 головах свиней. Установлено, что уже после первой обработки препаратом ДИХИМ-1 0,005% по АДВ зуд у животных прекращался. После второй обработке (через сутки) животных обследовали на наличие живых вшей. В опытной группе (ДИХИМ-1) живых вшей не обнаруживали. В контрольной группе (препарат сравнения -бутокс 0,005% по АДВ) у части животных (10,0-15,0% от числа обработанных) обнаруживали на коже живых вшей.

Заключение. Препарат ДИХИМ-1 в концентрации 0,005% по АДВ превосходит по эффективности бутокс в концентрации 0,005% при сифункулятозе свиней. Двукратная обработка опрыскиванием препаратом в ДИХИМ-1 полностью освобождает животных от вшей. Ктеноцефалидоз собак и кошек. Сравнительные испытания показали, что препарат ДИХИМ-1 эффективен в 3 раза более низкой концентрации, чем бутокс (дельтаметрин). Результаты представлены в таблице 9.

Отодектоз кошек. За животными наблюдали 10 дней после второй обработки; за этот период зуд и расчесы прекратились, животные перестали беспокоиться. Раны и язвочки кожи ушных раковин подсохли. Нарушенный шерстный покров стал восстанавливаться. Накопление экссудата в слуховых проходах прекратилось. В соскобах кожи с бывших мест поражения при повторной микроскопии возбудителя не находили.

Таким образом, двукратная обработка кошек 2,50 % (по АДВ) раствором препарата ДИХИМ-1 полностью освобождает животных от клещей Otodectes cynotes.

Заключение. Предложен препарат для лечения арахноэнтомозов животных, содержащий в качестве активно действующего вещества (АДВ) 2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2-(нитровинил)-имидазолидин формулы 1:

Нами разработаны и утверждены Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии (секция «Инвазионные болезни животных») «Методические положения по применению препарата ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных» (протокол №3 от 23 сентября 2010г.), а также «Регламент лабораторный приготовления препарата ДИХИМ-1 для лечения эктопаразитозов животных» (протокол № 3 от 23 сентября 2010г.). Методические положения изложены на 21 странице и включают введение, краткую характеристику ветеринарных инсектоакарицидов, описание препарата ДИХИМ-1, описание токсических свойств препарата ДИХИМ-1, результаты испытания инсектицидных свойств АДВ в сравнении с известными препаратами, описание опытов по применению ДИХИМ-1 при заболеваниях животных, схему применения препарата ДИХИМ-1 при заболеваниях животных и заключение. Методические положения и Регламент лабораторный прилагаем к диссертации в виде отдельных документов. Содержание Методических положений и Регламента изложены в различных разделах данной диссертационной работы. «Инструкция по применению ДИХИМ-1 при арахноэнтомозах животных» Общие сведения ДИХИМ-1 представляет собой комплексный препарат, содержащий активнодействующее вещество 2-(4,5-дихлор-1-имидазолилметил)-2 (нитровинил)-имидазолидин (10 вес.%), а также вспомогательные вещества диметилсульфоксид (75 вес.%), эмульгатор (5 вес.%) и воду (10 вес.%). По внешнему виду представляет собой жидкость от светло-желтого до коричневого цвета. Выпускают ДИХИМ-1 расфасованным по 5,10,100 мл в полипропиленовых или стеклянных флаконах. Маркируют каждую емкость с 133 указанием: названия препарата, номера серии, названия организации-производителя. ДИХИМ-1 по степени воздействия на организм относится к умеренно опасным веществам (3 класс опасности по ГОСТ 12.1.007-76): ЛД 50 при пероральном введении составляет более 300,0 мг/кг массы тела, при накожном нанесении – более 1000,0 мг/кг массы тела. В рекомендуемых дозах хорошо переносится животными.

Обсуждение результатов поиска препаратов с сочетанным антибактериальным и антипротозойным действием и перспективы развития данного направления

Наиболее практически значимыми для достижения поставленной в нашей работе цели оказались соединения йода с третичными аминами. В качестве аминов мы изучили практически все соединения, как промежуточные так и конечные, с которыми мы имели дело в данной диссертационной работе. Таких соединений было свыше 150. Большую часть структур мы отбросили на первых этапах исследования, так как по ряду показателей образующиеся комплексы не могли представлять интереса в качестве лечебных средств по причине низких выходов, стабильности, трудностей очистки и т.д. Нами получено и исследовано свыше 50 комплексов йода с третичными аминами. Цель этих опытов - найти такой комплекс, который по целому ряду характеристик удовлетворял бы требованиям, предъявляемым к препаратам для лечения животных при желудочно-кишечных инфекционных заболеваниях.

Использовали третичные амины алифатического, алициклического и гетероциклического рядов. Наилучшими комплексообразователями (по безвредности, дешевизне, доступности, антибактериальной активности и устойчивости образующегося комплекса) оказались азотсодержащие гетероциклы – производные бензимидазола, а также гексаметилентетрамин (тривиальное название - уротропин).

При сливании растворов йода и соответствующего гетероцикла в органическом растворителе образуется осадок, представляющий собой донорно-акцепторный комплекс типа n- между молекулой йода и третичным атомом азота гетероциклического кольца. Перйодиды по физическим, токсическим и фармакологическим свойствам отличаются как от молекулярного йода, так и от йодидов. Нами детально изучены перйодиды 5,6 диметилбензимидазола, 1,2-диметил-5-метоксибензимидазола и гексаметилентетрамина.

Для перйодидов характерен высокий уровень антибактериальной активности в отношении как референтных (3), так и выделенных от больных и павших телят (22) штаммов эшерихий. Разными исследователями неоднократно отмечено, что полевые изоляты эшерихий более устойчивы к антибиотикам, чем референтные штаммы. Что касается перйодидов гетероциклических аминов, то чувствительность изученного пула эшерихий составляет 0,60 – 6,0 мкг/мл, причем нет значительных различий в уровне чувствительности грамотрицательных бактерий, грамположительных бактерий и бацилл.

Результаты сравнительного испытания антибактериальной активности перйодидов, антибиотиков и некоторых препаратов йода показали несомненные преимущества перйодидов азотсодержащих гетероциклов. По тесту «бактерицидная активность» перйодиды бензимидазола и уротропина превосходят в отношении золотистого стафилококка йодинол, раствор йода, канамицин, левомицетин, тетрациклина; в отношении E.coli– йодинол, раствор йода, полимиксин; в отношении Ps.aeruginosa– йодинол, раствор йода, канамицин, левомицетин и тетрациклин; в отношении сальмонелл – йодинол, раствор йода и канамицин.

Фармако-токсикологическая характеристика перйодидов азотсодержащих гетероциклов в сравнении с другими йодсодержащими препаратами показывает, что перйодиды в 8-13 раз менее токсичны, чем водный раствор йода и в 5-6 раз, чем йодинол. При этом мы установили, что время их действия в условиях желудочно-кишечного тракта составляет 6 часов, то есть в активной форме они сохраняются в передних отделах и толстом кишечнике.

Перйодиды 5,6-диметилбензимидазола, 1,2-диметил-5 метоксибензимидазола и гексаметилентетрамина не снижают активности лактоглобулинов, совместимы с некоторыми антибиотиками (в 12 комбинациях из 18), средствами регидратации, причём совместимость нами установлена как по тесту антибактериальной активности, так и по тесту токсичности.

Полученные нами результаты дали основание применить перйодиды гетероциклических аминов для лечения колибактериоза телят. Поскольку три детально исследованных перйодида показали в предварительных вышеописанных тестах приблизительно одинаковые результаты, то по экономическим соображениям в опытах на телятах мы применили перйодид гексаметилентетрамина. Опыты по изучению лечебной эффективности перйодида гексаметилентетрамина при колидиарее телят. В серии опытов в хозяйствах с тяжёлой эпизоотической ситуацией препарат показал лучшие результаты, чем ряд антибиотиков. Так, в одном из хозяйств на 2-3 день жизни заболевали 92% новорожденных телят, появлялась диарея, быстро приводящая животных к развитию дегидратационного состояния, телята слабели, теряли аппетит. Гибель животных достигала 25,0%. Телятам опытных групп с момента появления первых признаков заболевания давали перйодид гексаметилентерамина в дозе 0,15 г/кг массы тела с физиологическим раствором (0,85% водный раствор хлорида натрия) по 50 100,0мл на приём за 20,0-30,0 минут до выпойки молока, 2 раза в день. Животные контрольных групп получали антибактериальные препараты, используемые на тот момент в хозяйстве: опыт №1- тетрациклин и норсульфазол, опыт №2 – тетрациклин и фуразолидон, опыт №3 – ЛЕРС, опыт №4 – тетрациклин и сульфамонометоксин, опыт №5 – левомицетин и фталазол, опыт №6 - левомицетин внутрь и неомицин внутримышечно. Препараты применяли в рекомендуемых для телят дозах. При лечении телят обеих групп использовали патогенетические и симптоматические средства, по окончании лечения антибактериальными препаратами назначали бактериальные 214 препараты АБК, ПАБК (ацидофильно бактериальная культура и пропионовоацидофильно бактериальная культура). Получены следующие результаты: