Токсикологический и ультраструктурный анализ изменений в организме и клетках животных при хроническом воздействии ксенобиотиков и применении лечебно-профилактических средств Саитов, Вадим Расимович

Введение к работе

Актуальность темы. Непрерывное увеличение промышленного производства химических веществ и расширение их ассортимента, связанное с возрастающими потребностями развивающегося социума, неизбежно повышает риски экологической опасности [5].

К числу наиболее пагубных загрязняющих природную среду компонентов относятся стойкие органические загрязнители (СОЗ) и тяжелые металлы. Они нарушают естественную функцию биоты, и их называют ксенобиотиками, т.е. чуждыми живому [19,26].

Диоксины и диоксиноподобные полихлорированные бифенилы относятся к супертоксикантам, способным аккумулироваться в пищевых цепях, что часто приводит к критическому загрязнению кормов, продовольственного сырья и практически любых готовых продуктов питания [17, 20, 23].

В результате диоксинового кризиса, разразившегося в конце 2010 года и приведшего к ограничениям поставок мяса из Германии, человечество в очередной раз осознало масштаб проблемы глобального загрязнения окружающей среды ксенобиотиками и убедилось в том, насколько неожиданными путями диоксины могут прорываться в технологические цепочки при производстве сельскохозяйственной продукции [2].

Изучение антропогенного воздействия тяжелых металлов и их соединений на состояние здоровья человека и животных является насущной проблемой биологии. Данные вещества могут длительное время сохраняться в объектах окружающей среды, мигрировать, накапливаться в организме человека и животных, вызывая изменения в органах и тканях [13, 14, 24]. В этой группе элементов одно из приоритетных мест занимает свинец, относящийся к ядам политропного действия и вызывающий широкий спектр негативных эффектов: поражение кроветворной, нервной, пищеварительной, выделительной и других систем [1].

Помимо диоксинов и тяжелых металлов, не менее важную роль в экологическом аспекте играют микотоксины - биогенные яды, включая Т-2 токсин [10, 25]. Грибы, продуценты токсинов, являются постоянной и серьезной угрозой здоровью людей и домашних животных, причем точное количество страдающих от микотоксикозов неизвестно. Опасность микотоксинов настолько высока, что эта проблема выходит за пределы отдельных стран. Значительное внимание ей уделяют такие организации, как ООН (ее продовольственный подраздел ФАО), Всемирная организация здравоохранения, Всемирная экологическая организация (ЮНЕП) и некоторые другие [22].

Научную заинтересованность вызывает и повышенная чувствительность к микотоксинам высокопродуктивных сельскохозяйственных животных и птицы современных пород и кроссов. Следует учитывать и то, что требования к экологической безопасности продукции растениеводства и животноводства, в частности зерна, молока и мяса, с каждым годом ужесточаются, усиливается контроль микотоксинов в продуктах питания [9].

Таким образом, на сегодняшний день последствия глобального загрязнения окружающей среды имеют приоритетное социально-экономическое значение и требуют постоянного усовершенствования терапии и профилактики животных к

отрицательному воздействию комплекса ксенобиотиков. В этом контексте актуально ультраструктурное исследование влияния цеолита и димефосфона на клетки органов сельскохозяйственных животных при раздельном и сочетанном введении диоксина, ацетата свинца и Т-2 токсина.

Работа выполнена в отделе токсикологии и секторе электронной микроскопии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» с 2008 по 2014 год согласно плану научных исследований: «Токсикологическая безопасность» (Per. номер 01200202603).

Степень разработанности темы. Неоспоримым аспектом токсикологических исследований, является познание механизмов сочетанного воздействия токсикантов различной природы на продуктивных животных, что однозначно важно для народного хозяйства, с последующей разработкой мероприятий и подбором специфических средств, профилактики и лечения [15, 27]. Подобные научные изыскания предполагают потенцирующие эффекты влияния токсикантов с множественными проявлениями на организменном (кровь), органном (печень, почки и др.) и ультраструктурном уровнях [12].

В свою очередь, изучение полиорганной дисфункции, вызванной влиянием ксенобиотиков на клеточном и субклеточном уровнях, необходимо для рассмотрения патологических процессов в рамках структурных и функциональных нарушений и позволит более глубоко раскрыть основы патологии [11].

Иначе говоря, электронно-микроскопические исследования, с одной стороны, позволят в значительной мере выявить негативные эффекты воздействия токсических агентов на клеточные компоненты, что, несомненно, представляет интерес для фундаментальной науки, с другой - практически использовать наработанный материал в случае реального возникновения подобных ситуаций.

Помимо изучения разного рода токсического влияния ксенобиотиков, не менее важное значение имеют подбор и обоснование лечебно-профилактических средств. На наш взгляд, перспективным в предупреждении прогрессирования системных цитотоксических повреждений, обусловленных воздействием ксенобиотиков, является комплексное использование средств метаболического и цитопротекторного типов действия (димефосфон, цеолит).

Согласно доступным литературным источникам, проблема, касающаяся ультраструктурных исследований цитопатологий продуктивных сельскохозяйственных животных при хроническом сочетанном влиянии ксенобиотиков различной природы, до сих пор полностью не раскрыта.

Цель и задачи. Цель работы - изучение ультраструктурных изменений и обоснование применения лечебно-профилактических средств при хроническом отравлении ксенобиотиками сельскохозяйственных животных.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. На модели хронической интоксикации кроликов и поросят изучить
гематологические, биохимические и иммунологические изменения при воздействии
диоксина, ацетата свинца и Т-2 токсина, раздельно, сочетанно и в комплексе с
цеолитом, цеолитом и димефосфоном;

2. Оценить морфофункциональные изменения органов кроликов при
воздействии диоксина и ацетата свинца раздельно, сочетанно, на фоне применения
цеолита и цеолита с димефосфоном в условиях хронической интоксикации;

1. Исследовать морфофункциональные характеристики органов поросят при воздействии диоксина и Т-2 токсина, раздельно и сочетанно, на фоне применения цеолита с димефосфоном в условиях хронической интоксикации;

2. В условиях хронической интоксикации изучить морфологию клеток органов овец при воздействии диоксина и комбинации диоксина с Т-2 токсином;

3. Провести морфометрический анализ ультратонких изменений митохондрий и пероксисом в гепатоцитах животных, используя печень в качестве модели индикации микросомально-энергетических процессов биотрансформации ксенобиотиков;

4. Провести факторный анализ состояния организма свиней при воздействии токсикантов и лечебно-профилактических средств, позволяющий дать оценку их степени влияния.

Научная новизна. В настоящей работе обобщен материал новых оригинальных данных по результатам морфологических изменений при хроническом воздействии ксенобиотиков на организм животных.

Методом просвечивающей электронной микроскопии проведено комплексное
сравнительное исследование структурных и функциональных изменений органов
животных - кроликов, свиней и овец при раздельном и сочетанном воздействии
на них токсикантов различных групп соединений - диоксинов (2,3,7,8-
тетрахлордибензо-п-диоксин), тяжелых металлов (ацетат свинца С4Н₆0₄РЬ><ЗН20)

И МИКОТОКСИНОВ (Т-2 ТОКСИН С24Н34О9);

На ультраструктурном уровне подтверждено взаимоусиливающее действие токсикантов различного происхождения при сочетанном отравлении трех видов животных;

На субмикроскопическом уровне дана комплексная оценка эффективности применения цеолита с димефосфоном при раздельном и сочетанном хроническом воздействии диоксина и ацетата свинца, диоксина и Т-2 токсина на клетки кроликов и свиней.

Впервые на ультратонком уровне посредством морфометрического анализа получены принципиально новые данные фундаментального характера об изменениях митохондрий и пероксисом в гепатоцитах животных, как показателя уровня микросомально-энергетических процессов биотрансформации ксенобиотиков. Показаны дозозависимые изменения, характеризующие степень энергетических процессов в клетках печени.

Впервые на ультратонком уровне с помощью морфометрического анализа выявлены особенности влияния экотоксикантов на нервную ткань кроликов, свидетельствующие о пластичности нейронов в плане адаптационно-компенсаторных приспособлений.

Посредством статистической обработки морфометрических, биохимических, иммунологических и цитологических показателей создана факторная модель, дающая комплексную оценку степени влияния диоксина и Т-2 токсина на организм животных.

Теоретическая и практическая ценность работы заключается в полученных результатах, сформулированных выводах и описанных методических подходах.

Теоретическая значимость заключается в апробировании существующих и применении инновационных подходов к морфометрическому анализу данных,

эмпирическому уточнению некоторых методических вопросов по обработке материала. У трех видов продуктивных сельскохозяйственных животных при воздействии ксенобиотиков установлены оригинальные подвижки полиорганной дисфункции. На основании проведенных исследований дана комплексная оценка токсикологических и ультраструктурных особенностей воздействия ксенобиотиков различной природы на клетки органов продуктивных сельскохозяйственных животных.

Практическая значимость отражена в ряде элементов представленной работы.

По результатам исследований цеолит с димефосфоном могут применяться при лечении токсикозов.

Полученные результаты могут быть использованы для изучения хронической токсичности ксенобиотиков и влияния лечебно-профилактических средств на коррекцию изменений в ряде органов продуктивных животных.

По материалам диссертации, разработаны и внедрены в научно-производственный процесс следующие нормативные документы: «Методические рекомендации по электронно-микроскопическим исследованиям биологических объектов»; «Подготовка образцов для трансмиссионной электронной микроскопии, применяемой при токсикологических исследованиях: компьютеризация расчетов»; «Токсикозы животных, вызванные диоксинами: этиология, профилактика и лечение».

Результаты исследований используются по специальностям ветеринарная фармакология с токсикологией, диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных, специалистами биологического профиля, прежде всего биологами - цитологами, применяющими в своих исследованиях методы электронной микроскопии.

Методология и методы исследования Предметом исследования служили разносторонние проявления организма животных на воздействие ксенобиотиков, в том числе на фоне применения лечебно-профилактических средств.

Объектами исследования являлись кровь, сыворотка и плазма крови, клетки изучаемых органов (печень, почки, селезенка, головной мозг и сердце).

Животных выводили из эксперимента в соответствии с «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием лабораторных животных».

Исследования проводились с использованием следующих методов:

1. цитологических (световая и электронная микроскопия);

2. гематологических;

3. биохимических;

4. иммунологических;

5. морфометрических (вычислительная, программная морфометрия);

6. дескриптивной, вариационной и многомерной статистики.

В выполнении отдельных этапов диссертационной работы оказывали практическую и консультативную помощь д.б.н., профессор В.А. Козлов, д.б.н., профессор Л.Н. Воронов, к.б.н., с.н.с. И.Р. Кадиков и к.б.н., н.с. И.И. Идиятов, за что выражаем им сердечную благодарность.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хроническое сочетанное воздействие диоксина и ацетата свинца (1/200 ЛД₅о
и 1/10 ЛД₅о), а также диоксина и Т-2 токсина (1/400 ЛД₅о и 2 ПДК) вызывает
необратимое повреждение клеточных органелл паренхиматозных органов
сельскохозяйственных животных;

2. Применение цеолита и димефосфона у кроликов восстанавливает
синаптические контакты в коре головного мозга и препятствует разрушению
митохондрий лимфоцитов селезенки под действием диоксина и ацетата свинца;

3. Согласно факторному анализу, показатели группируются: фактор 1 -
«гематобиохимический статус», фактор 2 - «фактор концентрирования лимфо
цитов», фактор 3 - «фактор микросомального окисления». Сочетанное отравление
(диоксин 1/400 ЛД50 и Т-2 токсин 2 ПДК) дезинтегрирует функциональные связи, за
счет потери роли ряда показателей: количество пероксисом, общий белок, а-
глобулины, глюкоза, коэффициент Де Ритиса, амилаза, ЩФ, ЛАСК, фагоцитарное
число и емкость, лимфоциты. Цеолит с димефосфоном уменьшают токсическую
нагрузку на митохондрии клеток.

Степень достоверности и апробация материалов диссертации.

Исследования проводились на достаточном количестве материала, согласно утвержденному плану НИР. Результаты не вызывают сомнений как по достоверности полученных данных, так и по выводам, сделанным на их основе.

Основные положения диссертации доложены и одобрены на ежегодных отчетных научных сессиях ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» по итогам НИР за 2009 - 2013 гг.; на Международной научно-практической конференции «Биотехно-логия: токсикологическая, радиационная и биологическая безопасность», посвященной 50-летию ФЦТРБ-ВНИВИ (Казань, 2010); на XXIII Российской конференции по электронной микроскопии (XXIII РКЭМ 31 мая - 4 июня 2010 года) в г. Черноголовка Московской области; на Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2011, 31 мая - 2 июня 2011 года) в г. Черноголовка; в ФГОБУ Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана (Казань, 2012); на XXIV Российской конференции по растровой электронной микроскопии (РКЭМ-2012, 29 мая - 1 июня 2012 года), в секции XX «Применение электронной, зондовой и конфокальной сканирующей электронной микроскопии в биологии и медицине» в г. Черноголовка; на XVIII Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2013, 3-7 июня 2013 года) в г. Черноголовка; на Международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава «Научное обеспечение агропромышленного производства» (Курск, 2014); на II Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки Российской Федерации и Республики Башкортостан, д.в.н., профессора Х.В. Аюпова «Современные достижения ветеринарной медицины и биологии - в сельскохозяйственное производство» (Уфа, 2014); на III международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов «Эффективные и безопасные средства в ветеринарии» (Санкт-Петербург, 2014).

Достоверность полученных результатов подтверждается публикациями в рецензируемых научных журналах.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 23 научные работы, в том числе 13 статей в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации, два учебных пособия, одни методические рекомендации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 350 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, заключения, списка использованной литературы и приложений. Работа иллюстрирована 15 таблицами, 169 рисунками, из них 151 - электронно-микроскопическая фотография. Список литературы включает 400 источников, в том числе - 158 работ зарубежных авторов.