Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1 Значение кролиководства и птицеводства для агропромышленного комплекса Российской Федерации.
1.2 Распространение кокцидиозов 8
1.3 Лечение и профилактика кокцидиозов 20
1.4 Проблема лекарственной устойчивости паразитов и пути ее преодоления
1.5 Заключение по обзору литературы 33
2. Материалы и методы исследований 35
3. Результаты собственных исследований 47
3.1 Изучение протистоцидной активности in vitro на модели Colpoda steinii
3.2 Изучение антибактериальной активности 55
3.3 «Острая» и «подострая» токсичность новых веществ 60
3.4 Месстно-разражающее действие новых веществ 76
3.5 Изучение лечебно-профилактической эффективности новых соединений при кокцидиозе (эймериозе) животных и птиц 77
3.6 Получение фармакологически приемлемых водорастворимых форм амидов жирных кислот
3.7 Эмбриотоксическое действие 89
3.8 Изучение остаточных количеств соединений в яйцах, мясе и внутренних органах перепелов
4. Обсуждение результатов 91
5. Выводы 107
6. Практические предложения 110
Список литературы
- Распространение кокцидиозов
- Проблема лекарственной устойчивости паразитов и пути ее преодоления
- Месстно-разражающее действие новых веществ
- Изучение остаточных количеств соединений в яйцах, мясе и внутренних органах перепелов
Распространение кокцидиозов
Простейшие (Protozoa) – подцарство одноклеточных животных из группы эукариотов. Очень многие простейшие в ходе эволюции перешли к паразитическому образу жизни. Из более 60000 известных видов простейших почти 10000 видов паразитируют у самых разных представителей животного и растительного мира. Некоторые классы целиком состоят из паразитов как, например, класс Sporozoa. Среди споровиков большое влияние на сельское хозяйство оказывают кокцидии семейства Eimeriidae, состоящее из двух родов: Eimeria и Isospora. (32; 39; 113; 153; 166; 167)
Кокцидиоз – это заболевание, вызываемое развитием в эпителии кишечника простейших рода Eimeria. Кокцидии паразитируют среди всех классов мира животных: у беспозвоночных и позвоночных, хладнокровных и теплокровных, в том числе и у человека [3; 20; 46; 49; 81; 101; 160].
Кокцидии рода Eimeria относятся к специфическим паразитам только своих хозяев, хотя, паразитируя в кишечнике, многие из них морфологически могут быть похожими, однако паразитируют они только у одного хозяина, к которому приспособились в процессе эволюции [7; 45; 81; 153]. Строгая специфичность кокцидий рода Eimeria проявляется не только в отношении хозяина, но и места паразитирования в организме животного. Так, Е. stiedae паразитирует только в эпителиальных клетках жёлчных протоков печени кроликов, тогда как Е. acervulina – в двенадцатиперстной кишке цыплят [49; 81]. Такая специфичность кокцидий к определенным органам и тканям или к определенному месту обитания явилась основным условием, обеспечивающим одновременное паразитирование многих видов кокцидий в одном хозяине. [7; 81; 160; 193]. Систематика кокцидий. Возбудители кокцидиозов сельскохозяйственных животных относятся к подцарству Protozoa, типу Apicomplexa, классу Sporozoa, отряду Coccidia, семейству Eimeriidae и двум родам – Eimeria и Isospora. Заболевания называют по названию рода возбудителей: Eimeria – эймериоз, Isospora – изоспороз [102; 118; 193]
Всего известно более 400 видов кокцидий (Шарова). Для крупного рогатого скота патогенны кокцидии видов: Eimeria bovis, E. zurnii, E. auburnensis; для кур – Е. tenella, E. necatrix, E. brunetti E. acervulina, E. maxima; для индеек – Е. meleagrimitis, E. adenoides; для уток – Е. perniciosa; для гусей – Е. truncata; для овец – Е. ninaekohlya-kimovae, E. arloingii, E. ahsata, E. faurei и др.; для свиней – Е. debliecki, Е. scabra, I. suis; у кроликов – Е. intestinalis, E. magna, E. media, E. caecicola, Е. stiedae; у собак и кошек – Е. canis, I. canis, Е. cati, Е. felis, I. rivolta, I. bigemina; у человека – I. belli и I. hominis [20; 49; 81; 177]. В мире, в основном в странах с жарким климатом, описано всего несколько сотен случаев заболевания человека кокцидиозом; на территории бывшего Советского Союза кокцидиоз зарегистрирован в России, в республиках Закавказья, Узбекистане и Украине. Кокцидиоз встречается как среди взрослых, так и среди детей [20].
Кокцидиоз кур и кроликов имеет свои особенности. Куры восприимчивы по крайней мере к 9 видам кокцидий. E. tenella и Е. necatrix являются наиболее патогенными видами [7; 81; 159; 177]. E. tenеllа это самый распространенный и вирулентный вид кокцидий, локализуется в слепых кишках [114; 175]. E. necatrix также характеризуется сильной вирулентностью. Эндогенные стадии развития локализуются чаще в средней части тонкого кишечника [114; 145]. E. maxima относится также к вирулентным видам кокцидий, однако ее патогенность ниже, чем у описанных первых двух видов. Эндогенное развитие происходит на всем протяжении тонкого отдела кишечника. Наиболее часто поражаются передний и средний его отделы. Эндогенное развитие Е. acervulina происходит в передней половине тонкого отдела кишечника, главным образом в петле двенадцатиперстной кишки. Эндогенные стадии Е. brunetti проходят в толстом отделе кишечника. E. mitis – слабовирулентный вид; эндогенные стадии развиваются в передней части тонкого отдела кишечника. Е. praecox – слабовирулентный вид; эндогенное развитие происходит в верхней трети тонкого кишечника. Эндогенное развитие Е. hagani происходит в переднем отделе тонкого кишечника. Эндогенные стадии развития E. mivati поражают эпителиальные клетки ворсинок или крипт на всем протяжении тонкого отдела кишечника [7; 49; 81; 114]. По данным Палушевского (2011 г.) четыре из них наносят экономический ущерб российским птицеводческим предприятиям – E.acervulina, E.maxima, E.necatrix и E.tenella [196]. V.R. Daz de la Guardia1 с соавт. (2004) приводят сведения о том, что у кроликов паразитируют 11 видов кокоцидий: Eimeria exigua, E. intestinalis, E. irresidua, E. magna, E.matsabuyashii, E. media, E. neoleporis, E. perforans, E. piriformis, E. sculpta, E. stiedae. Из них наиболее часто встречаются семь видов: E. stiedae паразитирует только в желчных путях; E. magna – в средней и нижней частях тонкого отдела кишечника; E. media – в двенадцатиперстной кишке и передней части тощей кишки; E. irresidua – в передней и средней части двенадцатиперстной кишки; E. perforans – в нижней части тонкого отдела кишечника; E. piriformis – в слепой и толстой кишках; E. interstinalis – в нижней части тонкого отдела кищечника и в толстом отделе кишечника [7; 49; 60; 81].
Большую часть своего жизненного цикла кокцидии являются внутриклеточными паразитами кишечного эпителия, желчных протоков, печеночной паренхимы. Собственно, это обстоятельство и определяет патогенез, клиническую картину и ущерб при кокцидиозе [81; 113; 118; 140].
Жизненный цикл. Для большинства кокцидий характерно правильное чередование бесполого размножения, полового процесса и спорогонии [21; 112] и характеризуется тремя периодами: 1) шизогонией, 2) гаметогонией и 3) спорогонией (рис 1.). Шизогония и гаметогония происходят в эпителиальных клетках кишечника и развиваются внутри клеток хозяина (эндогенно). Спорогония – во внешней среде, вне хозяина – экзогенно [3; 7; 81]. Кокцидий в стадии зрелой ооцисты попадают с водой или кормом в кишечник животного. Спорозоиты выходят из ооцисты и проникают в эпителиальные клетки кишечника, где растут и превращаются в шизонтов. Внутри такого шизонта образуются мерозоиты. С развитием последних шизонт делится и разрушает эпителий стенки кишечника. Освободившиеся мерозоиты вновь проникают в эпителиальные клетки кишечника, образуя шизонты II, III, а у отдельных видов - IV и пятой генераций. Таким образом, шизогония повторяется много раз [49; 114; 131; 187]. Затем бесполое множественное деление сменяется половым процессом – гаметогонией. Сущность гаметогонии заключается в том, что последующие генерации шизонтов формируют мерозоиты, которые проникают в клетку хозяина и превращаются в одноядерные трофозоиты. В дальнейшем из одноядерных трофозоитов образуются макрогаметоциты и микрогаметоциты. Затем макрогаметоциты превращаются в макрогаметы. У микрогаметоцитов ядро делится, в результате образуются мелкие мужские клетки – микрогаметы [30; 118]. После образования макрогамет и микрогамет они копулируют (сливаются), образуя копулу или зиготу. Зигота окружается оболочкой и превращается в ооцисту. Такие ооцисты выходят во внешнюю среду и проходят стадию спорогонии. [131]. Во внешней среде при наличии тепла, влаги и кислорода в ооцисте формируются четыре споры и в каждой из них по два спорозоита. Образованием в ооцисте спор и спорозоитов заканчивается спорогония [175]. Ооцисты, прошедшие стадию спорогонии, становятся инвазионными и могут сохраняться во внешней среде до года и более [11; 118; 193].
Проблема лекарственной устойчивости паразитов и пути ее преодоления
Раствор № 1. 5 мг вещества + 50 мкл 70% водного раствора ДМСО (диметилсульфоксид) + 5 мл дистиллированной воды при перемешивании стеклянной палочкой. Учитываемая концентрация – 1000 мкг/мл.
Растворы № 2-12. В лунки №№ 2-12 вносят по 150 мкл воды (смесь кипяченой водопроводной и дистиллированной воды), затем во вторую лунку приливают 150 мкл раствора № 1 и после перемешивания переносят 150 мкл в третью лунку и так далее до конца ряда, из 12 лунки после перемешивания удаляли 150 мкл раствора.
Во все лунки с подготовленными разведениями веществ вносили по 30 мкл взвеси простейших трехсуточного возраста. Взвесь простейших готовят таким образом, чтобы в каждом поле зрения при микроскопии на малом увеличении насчитывалось 10-15 активных особей. После внесения простейших планшет накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре (20-22 оС) на 18-20 часов. Для учета результатов автоматической микропипеткой с разовым наконечником набирали после перемешивания из последней лунки ряда 30 мкл содержимого, наносили этот объем на чистое предметное стекло и просматривали под микроскопом на малом увеличении (1015). Отмечали наличие или отсутствие живых простейших. Просмотр производили, начиная с последней лунки. Первая лунка, где нет ни одной живой особи, считается содержащей минимальную протистоцидную концентрацию изучаемого вещества. Ставили контроли: контроль среды – вода для переживания + простейшие (5 лунок); контроль растворителя (используется при изучении активности водонерастворимых веществ) – 50 мкл ДМСО 70% + 5мл дистиллированной воды и далее серийные разведения как для вещества, затем в лунки вносили по 30 мкл взвеси простейших. Таким образом, в одном планшете (8х12 лунок) проводили испытания 8 веществ. 2.2. Антибактериальную активность изучали на жидких питательных средах методом серийных разведений (Першин Г.Н., 1971). На этом этапе (скрининг активных соединений) использовали две культуры: E. coli O15 и St. aureus R209. 2.3. «Острую», «подострую» и «хроническую» токсичность определяли согласно «Методам экспериментальной химиотерапии» (под ред. Г.Н. Першина, 1971). 2.3.1. «Острую» токсичность новых веществ определяли при разных способах введения для белых крыс и цыплят. Опыт 1. Внутрижелудочное введение. Водные растворы амидов жирных кислот 5,0 % концентрации вводили крысам массой 175-190 г в желудок через зонд по 3,0 мл. Наблюдали за крысами в течение 15 дней. Группы формировали по 5 крыс. Отмечали ежедневно клиническое состояние животных, поведенческие реакции, сроки развития токсических реакций. Опыт 2. Внутрибрюшинное введение. Вводили растворы амидов жирных кислот двух концентраций: 0,1 % концентрации по 1,0 мл крысам массой 70-80 г и 5,0 % водные растворы испытуемых веществ – в объеме 2,0 мл крысам массой по 120-140 г. Опыт 3. Внутримышечное введение. Вводили водные растворы амидов жирных кислот в концентрациях: 0,01 и 0,10 % в объеме 0,10 мл. На испытание каждой дозы использовали по 5 крыс. Опыт 4. Определение «острой» токсичности 1,3-дизамещенных 2 иминобензимидазолина проводили при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении в виде взвеси по 1,5 мл в дозе 300,0 мг/кг живой массы и внутрибрюшинном введении в виде взвеси по 0,25 мл в дозе 100,0 мг/кг и 200,0 мг/кг лабораторным крысам. Формировали группы по 5 голов.
Определение среднесмертельных доз. В предварительных опытах, установили для новых веществ максимально переносимую дозу (МПД) и дозу, вызывающую гибель 100% животных (ЛД100). Соединения с низкой МПД ( 100 мг/кг массы тела), т.е. сравнительно токсичные вещества, исключили из дальнейших исследований. Для менее токсичных соединений установили ЛД50, для чего сформировали 5 групп крыс и цыплят по 5 голов в каждой группе и вводили изучаемые препараты в дозах, лежащих в интервале между МПД и ЛД100. Срок наблюдения - 15 дней.
Расчет ЛД50 проводили по методу Кербера (Першин Г.Н., 1971). Для вычисления пользовались формулой: ЛД50 - доза изучаемого вещества, которая вызывала гибель 50% группы животных; m - количество животных в каждой группе; Z - среднее арифметическое из числа животных, у которых наблюдалась учитываемая реакция под влиянием каждых двух смежных доз; d - интервал между каждыми двумя смежными дозами. Оценку «острой» токсичности проводили в соответствии с классификацией, приведенной в книге «Методы определения токсичности и опасности химических веществ (токсикометрия)» под редакцией Саноцкого И.В. Опыт 5. Изучение «острой» токсичности для цыплят трехсуточного возраста.
Водные растворы веществ в дозе 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 г/кг массы тела вводили цыплятам в зоб по 1,0 мл. Наблюдали в течение 15 дней. Группы формировали по 5 голов. Отмечали ежедневно клиническое состояние животных, поведенческие реакции, сроки развития токсических реакций.
Месстно-разражающее действие новых веществ
Длительное выпаивание 0,01% водных растворов производных миристиновой кислоты («1c», «1d») и производных олеиновой кислоты («2», «3») и скармливание 1,3-дизамещенного 2-иминобензимидазолина («5») в течение 15 дней не вызывает у белых крыс видимой токсической реакции. В дни наблюдения все животные оставались активными. Поведенческие реакции, аппетит, общее состояние были удовлетворительными и не отличались от таковых у животных контрольной группы. Нарушений деятельности пищеварительной системы не отмечали.
При биометрической обработке данных установили, что гематологические и биохимические показателей крови опытных животных достоверно не отличались от показателей животных контрольной группы (Р 0,95) При определении уровня «подострой» токсичности производных амидов жирных кислот для цыплят раннего возраста была проведена серия опытов.
Результаты определения «хронической» токсичности для цыплят с первого дня жизни при ежедневном выпаивании водных растворов веществ 0,01 % концентрации в течение 15 дней представлены в таблице 13.
Производные лауриновой («1a»), миристиновой («1c», «1d», («1f»), пальмитиновой («1g», «1h», «1i»), стеариновой («1k», «1l») и олеиновой («2») кислот хорошо переносятся цыплятами раннего возраста (1-14 суток) при выпаивании водных растворов 0,01 % концентрации в течение 15 дней. Все птицы оставались живыми, аппетит и общее состояние в период наблюдения были удовлетворительными.
Как видно из таблицы 14, мы обнаружили феномен более высокого прироста массы тела цыплят по сравнению с контролем при выпаивании некоторых производных амидов жирных кислот. Наибольший прирост массы тела отметили у цыплят, получавших с водой вещества «1c» (+22,70 %), «1h» (+13,27 %), «1i» (+25,30 %), «1k» (+14,66) «1l» (+17,30 %) и «2» (+11,20 %).
Контроль 75 75 36,0±0,24 104,41±0,51 - Данные, приведенные в таблице 15, показывают, что благодаря использованию производных лауриновой кислоты («1а»), миристиновой кислоты («1с»), пальмитиновой кислоты («1h»), стеариновой кислоты («1k») и олеиновой кислоты («2») прирост массы тела составил от 7,98 до 11,79 %.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что на прирост массы тела не влияет тип применяемой кислоты, то есть эффект обусловлен только свойствами амидов жирных кислот.
Влияние амида миристиновой кислоты при длительном применении на рост и развитие перепелов.
Мы наблюдали, что при даче препаратов ряда амидов жирных кислот более 18 суток у цыплят развивается угнетение аппетита, возникают расстройства пищеварения. Была поставлена задача – выявить уровень влияния одного из препаратов этого ряда при использовании его циклами по 14 дней с периодами перерывов по 14 дней между выпойками препарата. Результаты определения влияния 0,01% раствора амида миристиновой кислоты при длительном выпаивании перепелам представлены в таблицах 15, 16. Таблица 15
Сохранность перепела в опытной и контрольной группах в период применения 0,01 % раствора амида миристиновой кислоты
Группа Живая массапетушков(5)/курочек(15) в возрасте 6 месяцев, г Средняя живая масса 1 перепела в 6 мес. возрасте, г Срокнаступления периода яйцекладки, возраст (дни) Кол-во яиц от одной несушки за 7 дней
Представленные в таблицах 15 и 16 данные свидетельствуют о том, что выпаивание 0,01% раствора амида миристиновой кислоты перепелам с первого дня жизни циклами по 14 дней с перерывами по 14 дней в течение 6 месяцев не вызывает значимых токсических последствий: сохранность птицы как в начальный период жизни перепелов, так и в последующий период не отличалась от контрольной группы. Показатели продуктивности перепелов также свидетельствуют о том, что испытанная схема применения раствора амида миристиновой кислоты не вызывает развитие негативных последствий для организма перепелов.
Изучение остаточных количеств соединений в яйцах, мясе и внутренних органах перепелов
Уровень антибактериальной активности амидов жирных кислот также зависит от числа метиленовых звеньев (n) в структуре кислоты. Производные лауриновой кислоты (n=10) имеют средний и слабый уровень активности 62,50-250,0 мкг/мл. Производные пальмитиновой (n=14) и стеариновой (n=16) кислот имеют средний уровень активности 15,60-31,20 мкг/мл. Производные миристиновой кислоты (n=12) и часть производных пальмитиновой кислоты (n=14) показали стабильно высокие уровни антибактериальной активности 3,12-12,50 мкг/мл. Следует отметить, что чувствительность к амидам жирных кислот у грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов находится на одном уровне.
Нами установлен факт, что 1,3-дизамещенные 2-иминобензимидазолина (соединения «5» и «6») проявляют более высокую активность в отношении грамположительных микроорганизмов (3,90-15,6 мкг/мл), чем в отношении грамотрицательных ( 250 мкг/мл).
Среди изученных соединений производные амидов жирных кислот продемонстрировали стабильно высокую активность как в отношении простейших, так и в отношении бактерий. Так, производные миристиновой кислоты («1c», «1d», «1е», «1f») имеют минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) в отношении C. steinii на уровне 0,50-7,80 мкг/мл, в отношении E. coli – 6,25-25,0 мкг/мл; в отношении St. aureus – 3,125-6,25 мкг/мл. МИК производных пальмитиновой кислоты («1g», «1h») в отношении C. steinii составляет 0,50-3,125 мкг/мл; в отношении E. coli – 6,25 мкг/мл; в отношении St. aureus – 6,25 мкг/мл. МИК производных олеиновой кислоты («2», «3») составляет для C. steinii 1,90-3,90 мкг/мл; 6,25-12,50 мкг/мл для E. coli; 6,25-12,50 мкг/мл для St. aureus. МИК 1,3-дизамещенных 2-иминобензимидазолина («5» и «6») в отношении простейших – 0,50-3,90 мкг/мл; в отношении St. aureus – 3,90-15,60 мкг/мл; E. coli - 250,0 мкг/мл.
Антибактериальная активность производных лауриновой кислоты («1а», «1b») составляет 31,25-250,0 мкг/мл, при этом протистоцидная активность этих соединений значительно выше (0,90-7,80 мкг/мл). Таким образом, величина антибактериальной активности снижается с укорочением углеводородной цепочки в молекуле амида, что особенно ярко проявляется в случае декановой кислоты, производные которой не обладают ни протистоцидной, ни антибактериальной активностью. Протистоцидная активность, вероятно, в большей степени определяется особенностями аминного фрагмента соединения. Лишь одно из изученных соединений (2-(4,5 97 дихлоримидазолил-1)-5-нитропиридина) обладает только лишь протистоцидной активностью (15,60 мкг/мл).
Особое значение для дальнейшей разработки противококцидийных лекарственных препаратов имеет двойное действие изученных нами соединений, так как определенные стадии течения эймериоза часто осложнются инфекцией, что ведет к развитию сепсиса и к гибели животных [4; 44; 49; 55]. Из-за нарушения целостности кишечного эпителия происходит внедрение и размножение различной условно-патогенной микрофлоры: эшерихий, стафилакокков, сальмонелл, клостридиий и других [55; 108; 135; 152].
Установленный нами факт сочетанного действия производных амидов жирных кислот на простейших и бактерий и 1,3-дизамещенных 2 иминобензимидазолина на простейших и грамположительных бактерий имеет особенное значение для будущего использования этих соединений в ветеринарии. Как отмечали Н.А. Колабский с соавт. (1979), В.В. Кузнецов (2006), F.E.G. Cox (1998), V. Koinarski с соавт. (2005), существует проблема кокцидиозов, осложненных энтеробактериозами. Эти сообщения свидетельствуют о своевременности и актуальности обнаружения соединений сочетанного действия – протистоцидным и антибактериальным. Необходимость использования антибактериальных препаратов при лечении кокцидиозов подтверждается опытом практических врачей [26; 31; 107; 110]. Известно, что нитрофураны широко использовались при кокцидиозах (эймериозах) животных птиц. Как мы установили, к примеру, фуразолидон, не обладает протистоцидной активности даже при концентрации 1000,0 мкг/мл. Возможно, его эффективность при лечении кокцидиоза объясняется фактом подавления патогенных и условно-патогенных бактерий (табл. 31), чем лишний раз подтверждается актуальность поиска веществ, обладающих одновременно протистоцидной и антибактериальной активностью. Таблица 31 Протистоцидная активность новых веществ и препаратов сравнения в отношении C. steinii
Установлено, что однократное введение в желудок лабораторным крысам амидов жирных кислот (восемь соединений с установленными полезными свойствами - высокой протистоцидной и антибактериальной активностью) в дозе 1 г/кг массы тела в виде 5,0 % водных растворов объемом по 3,0 мл на одно животное не вызывает гибели крыс в течение 15 дней после введения (срок наблюдения). В ходе исследования острой токсичности соединений ряда амидов жирных кислот определить ЛД50 не удалось для большинства изученных веществ при внутрижелудочном введении.
