Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Влияние экзо и –эндогенных факторов на формирование, развитие и течение патологического процесса в «забарьерных» органах 10
1.2. Роль барьерных структур предстательной железы в фармакокинетике и фармакодинамике антибактериальных препаратов 19
1.3. Существующие способы рациональной терапии заболеваний предстательной железы у животных 32
1.4. Обоснование использования микро и нанокапсулированнных средств в фармакотерапии заболеваний животных 40
2. Собственные исследования 47
2.1. Материалы и методы исследования 47
2.2.1. Изучение фармакокинетики гентамицина, ципрофлоксацина и цефотаксима в предстательной железе в норме и при патологии 58
2.2.2. Изучение влияния никотиновой кислоты на фармакокинетику гентамицина, ципрофлоксацина и цефотаксима, в простате в норме и при патологии 71
2.2.3. Разработка схемы введения гентамицина, ципрофлоксацина и гентамицина совместно с никотиновой кислотой для достижения ими терапевтической концентрации при заболеваниях предстательной железы 85
2.2.4. Разработка способа доставки цефотаксима в ткани предстательной железы при различных путях введения 100
Заключение 109
Выводы 113
Практические предложения 115
Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы 115
Список литературы 116
- Влияние экзо и –эндогенных факторов на формирование, развитие и течение патологического процесса в «забарьерных» органах
- Изучение фармакокинетики гентамицина, ципрофлоксацина и цефотаксима в предстательной железе в норме и при патологии
- Разработка схемы введения гентамицина, ципрофлоксацина и гентамицина совместно с никотиновой кислотой для достижения ими терапевтической концентрации при заболеваниях предстательной железы
- Разработка способа доставки цефотаксима в ткани предстательной железы при различных путях введения
Введение к работе
Актуальность темы. Хронический простатит является одним из широко распространенных заболеваний, и частота возникновения его увеличивается год от года (A. Khaikova, 2011). Патологии предстательной железы могут возникать на фоне перенесенных инфекций, гормональных изменений или нарушений эмбрионального развития половых органов (W. Nizanski, 2011).
Заболевания предстательной железы у животных сопровождаются воспалительными явлениями, как при септическом и асептическом остром, так и хроническом простатите, в условиях эндокринных изменений, гиперплазии, простатической метаплазии и других условиях (S.D. Johnston, 2001; J. Verstegen, 2008).
Исследования последних двадцати лет показали, что основной проблемой
хронического простатита, является низкая проницаемость лекарственных
препаратов в ткани предстательной железы, что снижает эффективность
лечения. Некоторые исследователи выдвинули концепцию о
«гематопростатическом барьере» (B.R. Fulmer, 2000; Yonggang Shang, 2014). Подобно гематоэнцефалическому барьеру, гематопростатический барьер в простате защищает ее ткани и имеет способность селективной проницаемости. У всех многоклеточных организмов, гистогематические барьеры представляют собой плотные межклеточные контакты эндотелиальных клеток, между апикальными и базальными структурами на их мембранах (N. Sawada, 2003), которые имеют слабую проницаемость (В.Н. Ткачук, 1989).
Из-за болезненных симптомов у самцов продуктивных и непродуктивных
животных, низкой эффективности лечения, высокой частоты рецидивов,
значительно снижаются показатели продуктивности, что отражается на
экономических показателях хозяйств и существенных затратах на лечение у
частных владельцев животных. Несмотря на многочисленные исследования,
проведнные на эту тему, как у человека, так и у животных,
патофизиологические изменения и эффективные способы лечения простатита
до конца не изучены. Это требует разработки научно обоснованных способов
терапии хронического простатита, основанных на рациональной
антибиотикотерапии с внедрением в практику препаратов, обладающих свойствами адресной доставки в органы и ткани.
Степень разработанности. В отечественной ветеринарной медицине изучением структурно-функциональных характеристик предстательной железы, вопросами профилактики, диагностики и лечения хронического простатита у животных занимались Е.Е. Кудашева (2006), И.В. Никишина (2003), П.А. Хоришко (2004), Р.Ц. Цыдыпов (2014). Изучению простатита в медицинской практике посвятили свои работы Ткачук В. Н. (1989, 1993, 1994), Шангичев А.В. (2011). Вопросы патогенеза раскрывал Тюзиков И.А. (2012), моделирование с дальнейшим изучением патогенеза заболевания - Аль-Шукри С.Х. (2012,2013), Цветков И.С. (2013), которые провели клинико-экспериментальное обоснование терапии простатита.
В зарубежной практике исследования хронического простатита собак нашли отражение в работах Jacqueline R. Davidson (2008), Горман Нейл, Девидсон Ж.Р. (2003), Ниманд Х.Р. (2001). Изучение распространения, диагностики и терапии заболевания у животных проводили Nizanski W. (2014) и Shafiee R. (2014). Вопросами о строении и функциях «гематопростатического барьера» занимались Brand R. Fulmer (2000) и Yonggang Shang (2014). Проникновение антибактериальных препаратов в ткани предстательной железы у животных исследовали Yong Yoon Bahk с соавторами (2000). В доступной нам отечественной и зарубежной литературе отсутствуют сведения о целенаправленных способах коррекции проницаемости гематопростатического барьера для достижения терапевтической концентрации антибактериальных препаратов в органе-мишени, поэтому данный вопрос остается актуальным и требует детальных исследований.
Цель работы: изучить проницаемость барьерных структур
предстательной железы для антибактериальных препаратов с возможностью фармакокоррекции их концентрации в органе.
Для достижения поставленной цели были выдвинуты следующие задачи:
-
Изучить возможность проницаемости барьерных структур предстательной железы для гентамицина, ципрофлоксацина и цефатоксима у клинически здоровых животных и при патологических состояниях, вызывающих хронический простатит;
-
Определить способность эритемных доз никотиновой кислоты выступать в роли корректоров концентрации антибактериальных препаратов в простате;
-
Определить эффективность терапии заболеваний предстательной железы антибактериальными препаратами совместно с никотиновой кислотой в эритемных дозах;
-
Разработать способ доставки цефатоксима в ткани предстательной железы при различных путях введения.
Научная новизна работы. Впервые изучена возможность
проницаемости барьерных структур предстательной железы для
антибактериальных препаратов у животных. Изучена возможность
фармакокоррекции проницаемости барьерных структур при патологиях предстательной железы с использованием корректоров микроциркуляции. Изучены способы достижения и поддержания терапевтической концентрации антибактериальных препаратов при различных патологиях предстательной железы.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость диссертационной работы заключается в том, что научно-практические вопросы, которые поднимаются автором исследования связаны с актуальной на сегодняшний день проблемой рациональных способов лечения
хронического бактериального простатита и является трудноизлечимой патологией. Расширены знания о способах комбинированного применения антибактериальных препаратов, в том числе впервые в ветеринарной практике в ниосомальной форме. Впервые описана фармакокинетика антибактериальных препаратов различных групп через барьерные структуры предстательной железы и изучены способы поддержания терапевтической концентрации препаратов в органе-мишени. Результаты исследований приняты в учебный процесс и используются как справочный материал для лекций и лабораторно-практических занятий в ФГБОУ ВО «Ивановская ГСХА», ФГБОУ ВО «Саратовский ГАУ», ФГБОУ ВО «Ставропольский ГАУ», ФГБОУ ВО «Алтайский ГАУ», ФГУ ОУ ВО «Курганская ГСХА им. Т.С. Мальцева».
Методология и методы исследования. Основой методологии
исследования явилась обоснованная постановка проблемы лечения
хронического бактериального простатита у животных и изучения способов
преодоления барьерных структур предстательной железы, с получением
результатов, показывающих эффективность выбранной терапии. Полученные в
ходе проведения экспериментальных работ данные позволяют
усовершенствовать существующие схемы лечения хронического простатита у животных.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Влияние проницаемости барьерных структур предстательной железы на концентрацию антибиотиков и возможность ее фармакокоррекции;
-
Зависимость терапевтической концентрации антибактериальных препаратов в предстательной железе от использования корректоров микроциркуляции в процессе лечения животных, больных хроническим простатитом;
-
Перспективность использования ниосомальных форм химиотерапевтических средств при терапии болезней «забарьерных» органов.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных результатов подтверждены статистической обработкой.
Экспериментальная работа проведена с применением современных методов на
сертифицированном оборудовании. Результаты опубликованы в рецензируемых
источниках и апробированы на отраслевых научных конференциях. Данная
научно-исследовательская работа была выполнена в рамках реализации
федеральной грантовой программы Фонда содействия развитию малых форм
предприятий в научно-технической сфере «УМНИК» (договор 740ГУ1/2013 от
25.11.2013; 5420ГУ2/2014 от 30.03.2015) и за счет средств гранта ученого
совета ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный
университет».
Основные положения диссертации были представлены, обсуждены и одобрены на 75- 80-й научно-практических конференциях «Диагностика, лечение и профилактика заболеваний сельскохозяйственных животных»
(Ставрополь, 2012-2017 гг.), на открытом конкурсе Министерства сельского
хозяйства России среди студентов, аспирантов и молодых ученых (II этап, г.
Махачкала, 2014, 2015, 2016 гг. III этап, г. Санкт Петербург, 2015, г.
Ставрополь, 2016), круглом столе "ВетБиоПрепараты" (2015 г.), III и V Международной конференции «Инновационные разработки молодых ученых – развитию агропромышленного комплекса» (г. Ставрополь, 2014, 2016 г.) и конкурсе научно-технического творчества молодежи (г. Москва, 2013, 2016).
Личный вклад соискателя. Все этапы работы, включающие
планирование, подготовку и проведение экспериментов, а также
статистическую обработку полученных результатов проведены лично автором. Доля участия соискателя в выполнении работы составляет 85 %.
Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в которых отражены основные положения и выводы диссертации, в том числе 4 научные статьи - в изданиях, включенных в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени» («Вестник АПК Ставрополья», Инновации в АПК: проблемы и перспективы). 1 работа представлена в виде патента Российской Федерации на изобретение «Способ лечения хронического простатита собак».
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах компьютерного текста. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, рекомендаций и перспектив дальнейшей разработки темы и списка литературы. Список литературы содержит 260 источников, из них 181 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 29 рисунками и 17 таблицами.
Влияние экзо и –эндогенных факторов на формирование, развитие и течение патологического процесса в «забарьерных» органах
Известно, что различные элементы иммунной системы принимают участие в регуляции регенераторного процесса. Это актуально в отношении органов и структур, обладающих исключительными свойствами, в которых возможности для регенерации несколько снижены. К таким структурам можно отнести иммуно привилерированные или забарьерные органы, в частности мозг, глаз, щитовидная железа, семенники, система «мать-плод», суставы и предстательная железа и другие (А.В. Караулова, 1999; И.А. Дьяков, 2000; Р.М. Хаитов, 2001; В.А. Черешнев, 2002; Ю.С. Храмцова, 2004; С. Йин, 2008; А.В. Москалв, 2015; J.E. Park, 2004).
Более 130 лет назад немецкий офтальмолог van Dooremaal отметил отсутствие отторжения трансплантатов кожи мышей, помещенных в переднюю камеру глаза собаки (J.Y. Niederkorn, 2006). Спустя 75 лет Medawar ввел понятие «иммунная привилегированность», описав важность и сущность этого явления не только в передней камере глаза, но и в головном мозге (P.B. Medawar, 2003). Более поздними исследованиями, проведенными Streilein и коллегами (2003), было показано, что иммунная привилегия является результатом нескольких анатомических, физиологических и иммунорегуляторных процессов (J.W. Streilein, 2003). В забарьерные органы в норме лимфоциты и антитела не проникают, в них не действуют механизмы отторжения трансплантата, не распознаются антигены. Все патологические процессы характеризуются непредсказуемым по продолжительности течением и неспецифической симптоматикой. Также имеется множество особенностей в иммунологической регуляции регенерации в «забарьерных» органах, которые протекают по несколько иным механизмам, нежели в остальных тканях. Обычно, повреждения различного происхождения в организме способствуют появлению в кровеносном русле антител, но в отношении иммуно привилерированных органов состояния естественной иммунологической толерантности не возникает (В.А. Черешнев, 2002; М.В. Черешнева, 2001).
Такая естественная иммунологическая толерантность обусловлена более поздней антигенной дифференцировкой, отрицательной селекцией аутореактивных клонов лимфоцитов. Т-лимфоциты подвергаются негативной селекции в тимусе, а большинство В-лимфоцитов – в костном мозге. Кроме того, значение имеет наличие гистогематических барьеров в них, которые способствуют изоляции от иммунной системы. Эти барьеры расположены между кровью и тканевой жидкостью или иными структурами, нарушение их структуры, вызываемое инфекциями или травмами различного происхождения, приводит к стимуляции лимфатической системы в этих органах и образованию специфических антител. Этот процесс может привести к аутоагресии, что может закончиться гибелью органа. Тем не менее «забарьерные» органы имеют способность к восстановлению (М.В. Черешнева, 2001).
Первоначально считалось, что иммунной привилегированностью обладают только ткани головного мозга и глаза, так как именно в них ранее всего были обнаружены гистогематические барьеры: гематоэнцефалический и гематоофтальмический. Известно, что барьеры труднопроницаемы для многих веществ, так, проведенными исследованиями ученых из США Xu H. с коллегами (2007) было установлено: в глазные камеры не проникают даже красители с молекулярной массой порядка 350 Dа (H. Xu, 2007, 2005).
Достаточно подробно были описаны свойства гематоплацентарного барьера, известно, что плод способен выживать в организме матери, даже несмотря на чужеродность его антигенов. Изначально считалось, что эти органы лишены лимфатического оттока (дренажа), что приводит к изоляции органов от иммунной системы организма, в связи с «выключением» исходящих звеньев иммунных процессов. Но позже стало понятно, что в обеспечении иммунологической привилегированности принимают участие и активные механизмы, к которым относится изоляция, иммуносупрессия и иммунорегуляция (А.А. Ярилин, 2010) (Табл 1).
В подтверждение этому было проведено множество исследований, обоснующих эту концепцию в большинстве иммуно привилегированных органов.
Практическое обоснование в этом вопросе, можно найти в исследованиях, касающихся наиболее изученных «забарьерных» органах, например, глаз. Несмотря на то, что исследование гематоофтальмического барьера ведется достаточно давно и еще в 1948 году французским ученым Halpern B.N. с коллегами было описано действие гистамина на капиллярную проницаемость барьера, вопросы лечения некоторых заболеваний до сих пор являются открытыми (B.N. Halpern, 1948). Детальное исследование глазного аутоиммунитета может создать новые терапевтические стратегии для лечения заболеваний глаз (Т. Bose, 2016). Например, известно, что роговица глаза, «защищена» от аутоиммунитета отсутствием кровеносных и лимфатических сосудов, в то время как барьер сетчатки глаза поддерживается в иммунодепрессивном состоянии с помощью пигментного эпителия сетчатки (V.L. Perez, 2013).
Особенностью фармакотерапии глаза является, прежде всего, решение проблемы иммунной привилегированности органа, в основе которой лежит вопрос фармакинетики. Кроме того, проведение терапии инфекционных офтальмопатологий традиционными методами, без использования препаратов, способствующих изменению проницаемости гематоофтальмического барьера, способствует не только обострению инфекционного процесса, но и развитию вторичных патологий (В.Н. Шахова, 2012). В исследованиях, проведенных Benhar I. (2012), был предложен новый подход в лечении заболеваний глаз, основанный на избирательной стимуляции иммунитета в органе. До этого использовали классическую иммуносупрессию, так как считалось, что иммунная привилегия исключает активность иммунитета в глазе при любых обстоятельствах, основываясь в этом мнении на варианты развития патологий в ЦНС (местное воспаление), для которых в классических схемах лечения использовали противовоспалительные препараты и иммунодепрессанты (I. Benhar, 2012). Конечно, они приводили к облегчению симптомов, но действие было временное и не затрагивало основных патологических процессов (Gronert, 2010). Отправной точкой в разработке новых методов терапии, стали исследования, проведенные при моделировании глазных патологий и других нейроденеративных расстройств у животных, где лечение иммуносупрессорами приводило к усугублению болезни. (L. A. Levin, 1999; Solberg [et al.], 1999; S. Bakalash, 2003; Ohlsson [et al.], 2004; Dimitriu [et al.], 2008; Schwartz and Shechter, 2010).
Что же касается центральной нервной системы, а именно головного мозга, то он является, безусловно, иммуно привилегированным органом, имеющим свои свойства во многом благодаря гематоэнцефалическому барьеру. Изучение функциональных механизмов этого барьера является до сих пор ключевой задачей, имея при этом не только фундаментальное, но и практическое значение. Гематоэнцефалический барьер представляет собой специализированные морфофункциональные связанные между собой структуры, такие как эндотелиальные клетки капилляров головного мозга, астроциты, нейроны и перициты, вместе образующие «нейроваскулярную единицу», которая ограничивает пассивную диффузию молекул в ЦНС. Кроме того, эти единицы обогащены переносчиками питательных веществ, такими как транспортеры глюкозы, аминокислот, жирных кислот и других, для эффективного питания мозга через кровь (B.T. Hawkins, 2005; Н.В. Кувачева, 2013; K. Yamamizu, 2017). Известно, что барьерной среде имеется дефицит профессиональных АПК (антигенпрезентирующих клеток) и очень слабо выражена экспрессия MHC I и II классов.
С точки зрения иммунного статуса органа, весьма интересным представляется взаимодействие головного мозга, цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) и лимфатической системы. В обзоре Rennels M.L. (1990) было представлено исследование, в котором говорилось о наличие взаимосвязи между ЦСЖ и ИСЖ (интерстициальная жидкость) в головном мозге (M.L. Rennels, 1990). Более поздними исследованиями была расширена эта теоретическая модель и сформирована математическая, а сам феномен оттока макромолекул из ЦНС получил термин «глимфатическая система» («glymphatic system»), сущность которого заключается в обеспечении обмена между ЦСЖ и ИСЖ в каналах, образованных стенками венозных сосудов и отростками астроцитов (V. Ratner, 2017). В 2015 году Antoine Louveau с коллегами представили результаты исследований, в результате которых были обнаружены функциональные лимфатические сосуды, дренирующие твердую мозговую оболочку и имеющие сообщения с глубокими шейными лимфатическими узлами. Клиническая значимость этих открытий важна для разработки новых методов лечения рассеянного склероза, инфекционных энцефалитов и таких хронических вирусных инфекций как цитомегаловирус, полиомавирус (V. Ratner, 2015; R. Hohlfeld & Wekerle, 2001; H. Akiyama, 2000; M. Berton, 2015).
Изучение фармакокинетики гентамицина, ципрофлоксацина и цефотаксима в предстательной железе в норме и при патологии
Изучение фармакокинетики антибактериальных препаратов в сыворотке крови и предстательной железе проводили у здоровых животных и у самцов с моделированным неинфекционным хроническим простатитом.
Терапевтическая концентрация гентамицина для микроорганизмов варьирует в пределах от 3-8 мкг/мл. После однократного введения 4 % раствора гентамицина сульфата из расчета 0,1 мл/кг двукратно (каждые 12 часов) здоровым самцам крыс, его максимальную концентрацию в сыворотке крови наблюдали через 60 мин, которая отмечалась на уровне 5,3± 0,40 мкг/мл (Таблица 3).
Через 180 минут после однократного введения раствора гентамицина в сыворотке крови, его концентрация снизилась на 13 % (p 0,05). После очередного введения антибиотика, через 60 мин, его уровень в сыворотке крови поднялся на 2,8 %, по отношению к первоначальному значению (p 0,05). Через 24 часа уровень гентамицина в сыворотке увеличился на 5,7 % (Рисунок 4), к пятым суткам еще на 6,3 %, достигнув максимума к 14-м суткам, на 12,1 % составив 7,05±0,48 мкг/мл (p 0,05).
В предстательной железе у здоровых крыс остаточная концентрация гентамицина через час после введения составляла 1,56±0,4 мкг/мл, что на 44,2 % ниже терапевтической концентрации, через 180 минут количество антибиотика снизилось еще на 12 % (p 0,05). Терапевтическая концентрация антибактериального препарата была достигнута на третьи сутки - 3,00± 0,44 мкг/мл и не снижалась до конца исследований (Рисунок 6). В среднем от первоначальной инъекции уровень гентамицина в предстательной железе вырос на 57 % (p 0,05).
У животных с моделированным хроническим простатитом в сыворотке крови концентрация гентамицина достоверно не отличалась от таковой в сыворотке здоровых животных (Рисунок 5). Через час, в первые сутки исследований отмечалась максимальная концентрация препарата - 5,1±0,45 мкг/мл, которая достоверно снизилась на 5,5 % через 180 минут. Через 13 часов уровень гентамицина вырос на 2,9 %, достигнув максимума на 14 сутки 7,00±0,58 мкг/мл.
В гомогенной массе простаты у больных крыс через час после введения концентрация антибактериального препарата составляла 1,31±0,32 мкг/мл, что достоверно на 52,8 % (p 0,05) ниже терапевтической концентрации, которая была достигнута только на десятые сутки исследования - 3,06±0,15 мкг/мл. К четырнадцатым суткам этот показатель увеличился на 19,4 % (p 0,05).
Таким образом, в результате анализа показателей остаточного количества гентамицина в сыворотке крови между больными и здоровыми крысами не выявлено достоверной разницы (Таблица 3).
В обеих группах терапевтическая концентрация гентамицина в предстательной железе не была достигнута в течение первых суток (Рисунок 6). У здоровых животных уровень терапевтической концентрации достигнут на третьи сутки, а у крыс с моделированным хроническим простатитом только на десятые.
Гентамицин создает оптимальную сывороточную терапевтическую концентрацию уже в первые часы после введения (А.А. Дорохина, 2014, 2015). Несмотря на то, что этот препарат широко используют для лечения простатита у животных, существуют определенные недостатки. Один из них ограниченный спектр действия, в отношении стрептококков и энтерококков он не эффективен, поэтому его зачастую используют только в составе комплексной терапии. Так же его вводят только парентерально. Важным моментом является большое количество побочных эффектов, среди которых отмечается избирательное нейро- и нефротоксическое действие (URL: ayzdorov.ru).
Оптимальная терапевтическая концентрация ципрофлоксацина для наиболее распространенных уропатогенных микроорганизмов варьирует в пределах от 0,2 -0,94 мкг/мл (В.П. Яковлев [и др.], 2000). После внутримышечной инфузии 0,3 % раствора ципрофлоксацина в дозе 0,02 мг/кг максимальная сывороточная концентрация достигалась через 60 мин и составляла после однократной инъекции 3,01±0,42 мкг/мл у здоровых крыс.
У здоровых самцов в сыворотке крови через 180 минут после инъекции наблюдали снижение уровня антибиотика на 32,7 % в среднем по группе (p 0,05). Спустя 13 часов, после второй инъекции ципрофлоксацина, его концентрация выросла на 3,5 % (p 0,05) по отношению к первоначальному значению, составив 3,12±0,51 мкг/мл (Таблица 3). Через 24 часа отмечалось достоверное повышение уровня лекарственного препарата на 4,5 % (Рисунок 3), к пятым суткам еще на 17,4 %, достигнув максимального увеличения на четырнадцатые сутки на 43,6 % по отношению к первому значению, находясь на уровне 5,34±0,31 мкг/мл (p 0,05).
В предстательной железе у здоровых животных через 60 минут после введения абсолютная концентрация ципрофлоксацина в гомогенизате составляла 1,77±0,34 мкг/мл, что выше средних терапевтических значений (Таблица 4; Рисунок 7). Через 180 минут после введения препарата его концентрация достоверно снизилась на 12 %, а через тринадцать часов после второй инъекции ципрофлоксацина, повысилась на 6,3 % от первого значения (p 0,05).
К пятым суткам концентрация достоверно увеличилась на 22,2 %, к четырнадцатым на 42,8 % - 3,36±0,33 мкг/мл (p 0,05).
Все показатели находились выше среднего терапевтического уровня для многих уропатогенных микроорганизмов, при этом концентрация ципрофлоксацина в предстательной железе коррелируют с показателями в крови, что видно на рисунке 3.
У самцов с моделированным хроническим простатитом после первой инъекции ципрофлоксацина, его концентрация в сыворотке крови составила 2,97 мкг/мл (Рисунок 8).
Через 180 минут уровень антибиотика снизился на 30 %, а спустя 13 часов достоврно поднялся на 2,6 % по отношению к первому значению (p 0,05). Через 24 часа после первой инъекции уровень ципрофлоксацина в сыворотке достоврно увеличился на 10 %, на пятые на 27,5 %, достигнув максимума к 14-м суткам, увеличившись на 42 %, составив 5,26±0,55 мкг/мл (p 0,05).
В гомогенизате предстательной железы крыс с моделированным хроническим простатитом через час после введения концентрация ципрофлоксацина была на уровне 1,49±0,46 мкг/мл. Однако через 180 минут показатель снизился на 11,4 %, но после 13 часов поднялся на 1,32 % от первоначального значения, составив концентрацию выше терапевтической – 1,51 мкг/мл (p 0,05). Далее наблюдали увеличение концентрации антибиотика: через 24 часа на 5,09 % от первоначальных показателей, на пятые сутки на 26 %, а максимальное значение на четырнадцатые сутки исследований – 2,81±0,38 мкг/мл или на 24,5 % (p 0,05). Данные о концентрации в предстательной железе также коррелируют с показателями в крови, что видно на рисунке 8.
Сравнивая показатели концентрации ципрофлоксацина в сыворотке крови у здоровых животных и самцов с моделированным хроническим простатитом, достоверной разницы мы не зафиксировали.
Нами была отмечена разница, между теми же показателями в предстательной железе (Рисунок 9).
У здоровых животных концентрация ципрофлоксацина была выше. Диапазон различий составил от 14,1 % на пятые сутки, до 23,4 % на десятые. Также отмечался резкий спад концентрации препарата в обеих группах через 180 часов после первой инъекции препарата, достоверная разница между показателями составляла 15,3 %, но была терапевтической (р 0,05). Это обстоятельство в условиях практики вынуждает терапевтов вводить препарат не менее двух раз в сутки.
Не смотря на очевидные преимущества ципрофлоксацина, в частности способность образовывать терапевтические концентрации в сыворотке крови и предстательной железе уже через час после введения, его применение не всегда остается эффективным. Основной причиной этого является образование резистентных штаммов микроорганизмов (преимущественно штаммы, производящие -лактамазу, в основном грамположительные бактерии), что вероятно связано со снижением концентрации ципрофлоксацина через 5 и более часов. Кроме того, для некоторых бактерий, например, U. Urealiticum, Serratia marcescens, Acinetobacter spp. и Enterococcus faecalis терапевтическая конценцентрация ципрофлоксацирна варьируют в пределах от 12,5-128,0 мкг/мл, что значительно выше, чем средняя терапевтическая для большинства уропатогенных бактерий (В.П. Яковлев и соавт., 2000). Ципрофлоксацин, являясь препаратом второго поколения, эффективен преимущественно в отношении грамотрицательных бактерий, слабую активность препарат проявляет также в отношении инфекций, вызванных хламидиями и микоплазмами. В связи с этим, требуется либо использование более современных фторхинолонов (III поколение и выше), либо оптимизация действия препарата (P. Appelbaum, 2000; Ю.Э.Доброхотова, 2017).
Разработка схемы введения гентамицина, ципрофлоксацина и гентамицина совместно с никотиновой кислотой для достижения ими терапевтической концентрации при заболеваниях предстательной железы
С целью изучения эффективности применения никотиновой кислоты для терапии хронического бактериального простатита, нами был проведен ряд исследований. Для этого было сформировано восемь групп животных по десять особей в каждой группе. Первая контрольная группа включала только здоровых самцов. Животным второй группы проводили моделирование воспалительного процесса - на протяжении исследования вводили 0,2 мл 0,9% раствор натрия хлорида. В остальных группах инициировали хронический бактериальный простатит, который вызывали путем трансуретрального введения суспензии уропатогенной E.coli G 938, наиболее часто являющейся возбудителем хронического простатита в нашем регионе (Пат. 2430733, 08.10.2009); (В.А. Беляев, 2014). Через 45 суток, двукратно вводили антибактериальные препараты (гентамицин, ципрофлоксацин и цефотаксим) и никотиновую кислоту в эритемной для крыс дозировке 0,058 мкг/мл. Введение препаратов продолжали в течение 10 дней, после чего путм декапитации умерщвляли крыс и отбирали кровь и пробы предстательной железу.
В сыворотке крови определяли уровень оксида азота, тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБК-РП), церулоплазмина, С реактивного белка, простатической кислой фосфатазы и уровень тестостерона.
Такие показатели как оксид азота (NOx) и тиобарбитурат реактивные продукты (ТБК-РП), отражают интенсивность свободнорадикальных процессов в организме. Оксид азота является одним из маркеров состояния сосудов эндотелия, что важно учитывать при исследовании патологий простаты, в которых сосуды являются звеном гематопростатического барьера (И.Е. Окрут, 2011).
Церулоплазмин и С-реактивный белок являются белками острой фазы. Повышение концентрации церулоплазмина и С-реактивного белка наблюдается у больных с острыми и хроническими инфекционными заболеваниями. Их снижение на фоне проводимого лечения указывает на хороший эффект от терапии URL://www.gemotest.ru/analysis/catalog/s-reaktivnii belok/?sphrase_id=5508715, 03.07.2017).
Для всестороннего мониторинга течения заболевания предстательной железы мы определяли активность простатической кислой фосфатазы и уровень тестостерона. Кислая фосфатаза, по мимо важного онкомаркера, отражает сокращение притока крови к предстательной железе и инфекционный процесс в органе (URL:bondaroksana.ucoz.ru/publ/klinicheskaja_laboratornaja_diagnostika/biokhimij a/prostaticheskaja_kislaja_fosfataza/3-1-0-65, 03.07.2017). Уровень тестостерона снижается не только на фоне старения мужского организма, но и при инфекционных патологиях простаты. Таким образом, эти показатели отражают эффективность проводимой терапии.
Для контроля эффективности заболевания после аутопсии проводили осмотр половых органов и взвешивание предстательной железы самцов. Гистологическое исследование проводили с целью установления степени выраженности воспалительного процесса в простате и эффективности терапии по пятибалльной шкале (Пат. 2430733, 08.10.2009).
Также мы проводили прижизненный мониторинг хронического простатита, для чего до и после начала терапии проводили замер ректальной температуры, суточный диурез и уровень белка в моче животных.
Трансуретральное введение суспензии уропатогенной E. coli G 938 способствовало развитию хронического инфекционного простатита через 45 суток, что также подтверждает и развитие воспалительного процесса пузырьковидной желез (Рисунок 18,19). Мы отмечали очаги простатита, которые занимали не менее половины структуры железы или ее четверти, с обширными воспалительными инфильтратами вокруг выводных протоков железы, ацинусов и кровеносных сосудов, в эпителии встречались лимфоциты и макрофаги. В просветах желез также наблюдали лейкоцитоз (нейтрофилию) и моноцитоз (макрофаги). Такая патологическая картина соответствовала 3-4 баллам выраженности простатита согласно шкале, описанной в патенте 2430733 и в среднем, составляла 3,35±0,4 баллов.
Воспалительный процесс обязательно сопровождается появлением экссудата и выраженной гиперемией тканей предстательной железы – это и приводит к значительному увеличению массы и объема органа, что отражается и на суточном диурезе и соответствующих клинических проявлениях этого заболевания (боли, задержка мочи).
Масса предстательной железы у крыс с моделированным ХП увеличилась на 32 % по сравнению с группой контроля. Средняя температура при ректальном исследовании у больных крыс составляла 37,9±0,11, у здоровых животных 37,3±0,12 (Таблица 10). Суточный диурез у больных животных был достоверно ниже на 58,2 % по сравнению со здоровыми крысами. Отмечалась протеинурия, белка в моче было выше на 81,7 % (p 0,05). Это говорит о выходе воспалительного экссудата и его компонентов в мочу.
При введении только гентамицина масса предстательной железы снижалась на 16,6 % по сравнению с больными животными, а при дополнительном введении эритемной дозы никотиновой кислоты на 27,2 % к концу терапии (p 0,05) (Таблица 10). При этом индекс воспаления по сравнению с группой с моделированным прсотатитом при монотерапии снизился на 36,7 %, комбинированной на 67,1 % (p 0,05).
При введении ципрофлоксацина через десять суток после начала терапии масса простаты у крыс снизилась на 22,7 % (p 0,05), индекс воспаления в целом по группе на 41,7 % (Таблица 10; Рисунок 20). Дополнительное введение никотиновой кислоты способствовало снижению массы предстательной железы на 30 % (p 0,05), индекс воспаления при этом составлял 0,83±0,4 балла, что в 4 раза меньше, чем у животных их группы контроля с хроничесим простатитом.
При введении цефотаксима масса вентральной части простаты снизилась на 23,5 %, индекс воспаления на 38,8 % (p 0,05). Совместно с никотиновой кислотой масса органа была меньше в 1,4 раза и составляла 293,46±11,75 мг, а степень воспаления меньше в 3,7 раз (Таблица 13).
Введение антибактериальных препаратов отразилось и на динамике урологических показателей.
При введении гентамицина суточный диурез через 10 суток от начала терапии увеличился на 47 % (p 0,05), уровень белка снизился на 67,7 % (в 3,1 раза). Дополнительное введение эритемной дозы никотиновой кислоты способствовала увеличению диуреза на 55,6 % и снижению белка на 71,9 % (p 0,05).
Лечение больных крыс ципрофлоксацином способствовало увеличению диуреза на 59 % (практически 2,5 раза) и снижению белка на 69,3 % (p 0,05). На фоне введения никотиновой кислоты в целом по группе суточное выделение мочи увеличилось на 60 % (p 0,05), а протеинурия снизилась на 78 % (в 4,4 раза).
На фоне введения цефотаксима суточный диурез снизился на 53,4 %, уровень белка в моче на 64 % (p 0,05). Введение никотиновой кислоты способствовало увеличению количества мочи на 60,3 %, уровень белка снизился на 74,8 % (p 0,05).
Изучая показатели антиоксидантной защиты организма, мы установили, что введение антибактериальных препаратов существенно снижало уровень свободных радикалов в организме (Таблица 12, 15; Рисунок 21). Повышенное значение уровня оксида азота при моделированном воспалении говорит о роли оксидативного (нитрозилирующего) стресса в развитии хронического простатита у самцов, что отражает эффективность терапии в целом.
После введения гентамицина уровень оксида азота снижался на 23,4 % по сравнению с животными с моделированным хроническим прсотатитом, а на фоне дополнительного применения никотиновой кислоты он снижался еще на 20 % (p 0,05). Уровень тиобарбитуратреактивных продуктов (ТБК-РП) в сыворотке крови коррелировал с показателями оксида азота, достоверно снижаясь на фоне монотерапии гентамицином на 22,4 % в целом по группе, а с никотиновой кислотой на 36,5 % (p 0,05).
Уровень оксида азота на фоне терапии ципрофлоксацином снижался на 37,6 %, ТБК-РП на 31,1 % (p 0,05). Введение никотиновой кислоты способствовало уменьшению оксида азота в 1,8 раз, а ТБК-РП на 47,4%(p 0,05).
Разработка способа доставки цефотаксима в ткани предстательной железы при различных путях введения
В статье Szerkus O. (2016) были опубликованы последние положения ВОЗ, в которых фармацевтическое сообщество призывали не только к разработке новых антибактериальных препаратов, но и проводить исследования по оптимизации использования существующих антибиотиков. Это связано с тем, что среди множества антибактериальных средств не все оказывают своего полного фармакологического действия, что связано с их строением или химическими свойствами. Это приводит к появлению резистентных штаммов микроорганизмов и снижению качества терапии.
Одним из перспективных направлений биомедицины и ветеринарной практики, является разработка способов оптимизации действия лекарственных средств с помощью передовых разработок в области нанотехнологий. За счет включения молекул лекарственного вещества в везикулярные системы стало возможным управлять действием лекарственного вещества на организм, снижая их побочные эффекты и увеличивая фармакологические свойства препаратов. Одним из классов везикулярных систем является неионная поверхностно-активная везикула ниосома. Ниосомы – это коллоидные микро- и нанокапсулы, изготовленные из синтетических неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), способных к самосборке замкнутых двухслойных структур, разделяющих один или несколько внутренних полостей.
Из исследований, проведенных Hu X. (2017) стало известно, что включение в ниосомы лекарственных средств (на примере терапии инфекционных менингитов) способствует улучшению их проницаемости в ткани мозга, защищенных гематоэнцефалическим барьером, в 14 раз по сравнению с традиционными методами. Также известно об их длительном и устойчивом высвобождении и повышении биодоступности при различных способах введения.
На базе ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека был разработан способ получения ниосом с включенным цефотаксимом методом обращенно-фазовой отгонки (RU 2583135, Д. А. Ковалв, А. Н. Куличенко, М. Е. Михайлова, С. В. Писаренко, Л. В. Ляпустина, 2016). В основе способа лежит растворение некоторого количества сорбитан моностеарата, холестерина, дицетилфосфата и полиэтиленгликоля в хлороформе, приготовление водного раствора включаемого антибиотика и эмульгирование всех компонентов.
Таким образом, цель исследований разработать способ доставки цефатоксима в ткани предстательной железы при различных путях введения, которые влияют на качество лечения за счет: кратности введения, снижения общей дозировки, соответственно и токсического воздействия на весь организм, повышение фармакокинетики в труднодоступные участки и как следствие достижение терапевтической концентрации в сжатые сроки.
Сравнительное изучение фармакокинетики цефотаксима в свободной и ниосомальной формах проводили на самцах морских свинок, которым однократно внутримышечно и перорально вводили растворы цефотаксима в дозе 194 мг. Усредненные фармакологические профили представлены в таблицах 16 и 17. Определение концентрации действующего вещества в образцах сыворотки крови и тканей проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Результаты предварительной калибровки и проверки ВЭЖХ системы представлены на рисунке 25 и 26.
Калибровочный график для оценки работоспособности системы хроматографии (предварительный, без добавления гомогенатов органов интактных животных) построен на основании ВЭЖХ стандартных образцов цефотаксима в ПФ с концентрациями 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 и 10 мкг/мл. Для каждого образца получали не менее 5 хроматограмм.
Фармакокинетика лекарственного средства должна быть изучена при его однократном введении. Основными целями фармакокинетического исследования являются характеристика его фармакокинетического профиля в крови, изучение распределения между кровью и тканями, метаболизма и экскреции, а также оценка биодоступности при внесосудистом введении лекарственного вещества в готовой лекарственной форме (Р.У. Хабриев, 2005).
Для оценки фармакокинетических параметров свободного цефотаксима и его ниосомальной формы при различных способах введения мы сравнивали показатели максимальной концентрации (Cmax) в сыворотке и предстательной железе, времени е достижения (Tmax) полученные при однократном введении препаратов в дозе 194 мг на животное.
Анализируя максимальную концентрацию цефотаксима в сыворотке крови при внутримышечном введении, мы установили, что Сmax (максимальная концентрация) для препарата в ниосомальной форме на 43 % ниже по сравнению с его свободной формой (Таблица 16; Рисунок 27). При пероральном введении максимальная концентрация антибиотика в ниосомальной форме была на 77 % выше, чем в свободной форме (p 0,05) (Рисунок 28)
При внутримышечном введении цефотаксима в обеих формах Тmax (время достижения максимальной концентрации антибиотика) в сыворотке крови достигалось через час после введения.
Максимальная концентрация в сыворотке крови цефотаксима при введении per os в свободной форме в среднем по группе составляла 10,558 мкг/мл, что на 42,7 % меньше (p 0,05), по сравнению с ниосомальной формой, которая была на уровне 24,707 мкг/мл.
Анализируя максимальную концентрацию цефотаксима в предстательной железе при внутримышечном введении, мы установили, что Сmax для ниосомального препарата достоверно выше на 39,3 % (p 0,05) по сравнению с его свободной формой (Рисунок 29). При пероральном введении максимальная концентрация антибиотика в ниосомальной форме была выше на 60,7 % (p 0,05), чем в свободной форме (Рисунок 30)
При внутримышечном введении показатель площади под фармакокинетической кривой AUC0.oo в свободной форме цефотаксима выше на 17,8 % (р 0,05) по сравнению с ниосомальной формой. В предстательной железе концентрация антибиотика в инкапсулированной форме больше на 12,3 %(р 0,05) , чем в свободной.
При пероральном введении AUC0-oo в свободной форме на 21 % выше (р 0,05), чем в ниосомальной. В предстательной железе площадь под фармакокинетической кривой ниосомального препарата на 29,2 % больше (р 0,05), чем свободного.
Таким образом, максимальную концентрацию препарата в сыворотке крови в обеих формах мы наблюдали через час после введения, но через 5 часов в ниосомальной форме она была выше на 45,8 %, чем в свободной, это может свидетельствовать о том, что при внутримышечном введении цефотаксима в ниосомальной форме происходит уменьшение его пиковой нагрузки в сыворотке крови, при сохранении терапевтических значений препарата. Это подтверждает сведения способности препарата распределяться в высоко васкуляризированные органы и о пролонгированном высвобождении цефотаксима из микрокапсул, описанное в предыдущих работах по офлоксацину (Куличенко А.Н., 2014; Беляев В.А., 2016).
При пероральном введении в сыворотке крови цефотаксим в ниосомальной форме создавал максимальную концентрацию через 30 минут, что на 77 % выше, чем в свободной форме. Это связано с биохимическими свойствами сорбитана моностеарата (Span 60), (одной из составляющих ниосомы) который способствует защите лекарственного вещества от нежелательной ферментативной и химической деградации в желудочно-кишечном тракте (El-Ridy et al, 2015), что делает цефотаксим более доступным для тканей при пероральном введении, в короткие сроки создает терапевтическую концентрацию в организме, при длительном времени персистирования лекарств в организме (Bragagni [et al.], 2014; А.Н. Куличенко, 2014).
В гомогенной массе простаты после внутримышечного введения ниосомального цефотаксима его максимальная концентрация была выше на 39,3 %, а площадь под фармакокинетической кривой на 12,3 % (p 0,05), а при пероральном введении на 60,7 % и на 29,2 % (p 0,05) соответственно. Это также говорит о стабильности полиэтиленгликоль-содержащих ниосомальных микро- везикул на основе сорбитана моностеарата в условиях in vivo.
Учитывая наличие барьерных структур в предстательной железе, можно утверждать о более высокой способности цефотаксима в составе ниосом их преодолевать. Известно, что такое неионогенное поверхностно-активное вещество, как сорбитан моностеарат имеет свойство хорошо растворяться в жирах, что позволяет микровезикулам преодолевать электрически заряженную липидную мембрану эпителия предстательной железы и достигать своих терапевтических значений, в отличие от свободной формы препарата. (I.A. Attia, 2007).