Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 9
1.1 Особенности микробиоценоза желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы 9
1.2 Роль кишечной микрофлоры в нормализации процессов жизнедеятельности и повышении продуктивности сельскохозяйственной птицы 11
1.3 Эффективность применения пробиотиков в птицеводстве 18
2 Материалы и методы исследований 40
3 Собственные исследования 51
3.1 Технология получения пробиотической добавки Трилактокор 51
3.2 Токсикологические исследования пробиотической добавки Трилактокор 85
3.2.1 Исследование острой токсичности Трилактокора 85
3.2.2 Исследование хронической токсичности Трилактокора 86
3.2.3 Определение кожно-резорбтивного и раздражающего свойства пробиотической добавки Трилактокор 90
3.2.4 Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса перепелов после использования пробиотика Трилактокор 91
3.3 Фармакологичекие исследования пробиотической добавки Трилактокор 94
3.3.1 Влияние пробиотика Трилактокор на мофологические и биохимические показатели крови перепелов 94
3.3.2 Влияние пробиотика Трилактокор на пищеварение 101
3.3.3 Влияние Трилактокора на мясную продуктивность и качество мяса перепелов 104
3.4 Экономическая эффективность применения пробиотика Трилактокор на перепелах 111
4 Обсуждение результатов исследований 115
Заключение 122
Список использованной литературы 124
Приложения 142
- Роль кишечной микрофлоры в нормализации процессов жизнедеятельности и повышении продуктивности сельскохозяйственной птицы
- Технология получения пробиотической добавки Трилактокор
- Влияние пробиотика Трилактокор на мофологические и биохимические показатели крови перепелов
- Влияние Трилактокора на мясную продуктивность и качество мяса перепелов
Введение к работе
Актуальность темы. Важной целью государственной аграрной политики страны в перспективе до 2020 г. является эффективное импортозаме-щение на отечественном рынке животноводческой и птицеводческой продукции за счет собственного производителя. Однако это требует внедрения инновационных технологий в содержание и питание сельскохозяйственных животных и птицы (Способы повышения …, 2014; Лысенко Ю. А., 2014; Фисенко Г. В., 2015; Научное обоснование …, 2015; Фисинин В. И., 2016).
В условиях ведения интенсивного промышленного птицеводства возникает высокая вероятность развития в хозяйствах патогенной микрофлоры. Это требует систематического применения антибиотиков и химиотерапев-тических препаратов, приводящее к повышению антибиотикорезистентно-сти патогенных штаммов и широкому распространению желудочно-кишечных заболеваний, которые являются основной причиной гибели молодняка (Антипов В. А., 2010; Донник И. М., 2011; Биохимические …, 2015; Кощаев А. Г., 2015; Лысенко Ю. А., 2015; Фисинин В. И., 2016).
Предотвратить развитие многих патологий позволяет использование стабилизированных культур микроорганизмов, а также продуктов их метаболизма, которые способны оптимизировать кишечный микробный баланс, угнетать развитие и рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, при одновременном ускорении процессов обмена веществ и защитных реакций организма-хозяина, а также активизируя все уровни гуморального и клеточного иммунитета (Донник И. М., 2011; Петенко А. И., 2013; Зарытовский А. И, 2015; Метагеномное …, 2016).
Среди пробиотических микроорганизмов наиболее распространенными являются лактобактерии. Аспекты их использования затрагивают обширный круг вопросов и проблем, связанных с нормализацией кишечного микробиоценоза, иммунной, гормональной, а также ферментной систем молодняка и взрослого поголовья птиц (Беспоместных К. В., 2011; Новикова М. В., 2012; Петенко А. И., 2012; Щербатов В. И., 2016).
В связи с этим разработка и внедрение новых биопрепаратов и добавок на основе живых физиологически-адаптированных культур микроорганизмов, которые могут служить заменой существующим антибиотикам, является актуальным вопросом в решении важной народнохозяйственной проблемы обеспечения населения Российской Федерации биобезопасной продукцией птицеводства, в том числе перепеловодства.
Диссертационная работа является частью тематического плана НИОКР, утвержденного Ученым советом Кубанского ГАУ на 2016–2020 гг. (№ госрегистрации 116021110067-4).
Степень разработанности проблемы. Изучением разработки способов выращивания с.-х. птицы с использованием в их рационе пробиотиков занимались ряд ученых: Н. Данилевская др. (2005); И. Егоров, Ш. Иман-
гулов, К. Харламов (2007); Е. А. Волкова, А. Я. Сенько (2010); В. И. Фи-синин, И. А. Егоров (2011); Е. В. Бессарабова и др. (2011); Ф. С. Ха-зиахметов (2011); И. А. Лебедева (2011); Ю. А. Лысенко, А. И. Петенко (2012); В. В. Марченко и др. (2013); М. М. Горячева (2013); А. А. Грозина (2014); А. И. Петенко и др. (2015) и др.
Цель работы - оценка токсикологических и фармакологических свойств пробиотической добавки Трилактокор, а также определение эффективности ее использования в мясном перепеловодстве.
В соответствии с целью исследований были поставлены следующие задачи:
дать характеристику состава, технологии изготовления и контроля качества пробиотической добавки Трилактокор;
изучить токсикологические характеристики пробиотической добавки Трилактокор;
исследовать фармакологическое действие Трилактокора на перепелах;
установить влияние Трилактокора на мясную продуктивность перепелов, качество получаемой продукции;
определить экономическую эффективность применения пробиотической добавки Трилактокор.
Научная новизна. Впервые разработана пробиотическая добавка Трилактокор, включающая в себя ассоциацию трех видов молочнокислых бактерий - Lactobacillus agilis, Lb. intermedins и Lb. salivanus в соотношении 2 : 2 : 1 соответственно (СТО 9291-016-00493209-15). Изучены ее основные токсикологические характеристики и фармакологические свойства. Установлено влияние пробиотической добавки Трилактокор на физиолого-биохимические показатели организма перепелов, сохранность поголовья, мясную продуктивность и качество мясной продукции. Изучено влияние добавки Трилактокор на пищеварение перепелов. Предложена схема применения пробиотической добавки Трилактокор в мясном перепеловодстве. По результатам исследований подана заявка для получения патента РФ на изобретение «Способ получения жидкого пробиотического препарата» № 2017101053.
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований научно обоснована эффективность использования бактериальной добавки Трилактокор при выращивании перепелов на мясо. При его использовании в рационе перепелов наблюдается повышение сохранности птицепоголовья до 10,0 %, прироста их живой массы на 12,2 %, а также снижение конверсии корма на 9,3 %. Выявлено увеличение массы потрошенной тушки на 18,1 % при использовании пробиотика. Трилактокор способствует усилению гемо- и эритропоэза, за счет увеличения в крови перепелов количества эритроцитов и гемоглобина. Полученные результаты могут быть использованы в перепеловодческих хозяйствах для повышения
жизнеспособности птиц, экономически эффективного получения высококачественной мясной продукции.
Разработаны технические условия к пробиотической добавке Трилак-токор (СТО 9291-016-00493209-15). Подготовлены и утверждены «Методические рекомендации по использованию пробиотической добавки Три-лактокор для птицеводства».
Результаты исследований были внедрены в ООО «Красный Терем» Северского района Краснодарского края.
Методология и методы исследований. Методологической основой являлись труды отечественных и зарубежных ученых по теме диссертационной работы в области токсикологии и фармакологии пробиотических кормовых добавок для птицеводства. При выполнении научных исследований использовались общепринятые методы: фармакологические, токсикологические, физиологические, экономические и статистические.
Основные положения, выносимые на защиту:
состав, технология получения и контроль качества пробиотической добавки Трилактокор;
токсикологические характеристики добавки Трилактокор;
фармакологическое действие пробиотической добавки Трилактокор в перепеловодстве;
морфо-биохимические показатели организма перепелов после применения Трилактокора;
сохранность перепелов, продуктивность, качество получаемой мясной продукции при применении пробиотика Трилактокор;
экономическая эффективность использования пробиотической добавки Трилактокор в мясном перепеловодстве.
Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 3 - в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
Апробация работы. Материалы научно-исследовательской работы доложены и обсуждены на: Х Всероссийской конференции молодых ученых «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2016); 72-й научно-практической конференции преподавателей по итогам НИР за 2016 год (Краснодар, 2016); 72-й научно-практической конференции студентов по итогам НИР за 2016 год «Научное обеспечение агропромышленного комплекса» (Краснодар, 2016); III научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых, посвященной 95-летию Кубанского государственного аграрного университета «Современные аспекты производства и переработки сельскохозяйственной продукции» (Краснодар, 2017).
Материалы диссертации вошли составной частью конкурсного проекта, который был отмечен решением российского жюри серебряной медалью XVIII Российской агропромышленной выставки «Золотая осень -
2016» и международным жюри золотой медалью 27-й международной агропромышленной выставки-ярмарки «Агрорусь – 2017».
Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, заключение, список использованной литературы и приложения. Работа изложена на 148 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 28 рисунков, а также включает в себя 6 приложений. Список использованной литературы содержит 178 источников, из которых 28 на иностранном языке.
Роль кишечной микрофлоры в нормализации процессов жизнедеятельности и повышении продуктивности сельскохозяйственной птицы
Микрофлора желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы играет важную роль в их жизнедеятельности, однако на сегодняшний день отсутствует их единая классификация. Согласно одной из существующих классификаций выделено две группы микроорганизмов, которые входят в со 12 став микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы. К ним относятся как автохтонные (непатогенные), так и аллахтонные (условно-патогенные и патогенные) микроорганизмы (Панин А. Н., 2002). Ряд других авторов разделяют микроорганизмы, с которыми взаимодействует макроорганизм в процессе его жизнедеятельности, на четыре основные группы:
- микроорганизмы, появление которых в различных полостях носит случайный характер, так как они не могут длительное время пребывать в данных условиях;
- микроорганизмы, которые входят в состав облигатных представителей бактерий желудочно-кишечного тракта и выполняют одну из важных ролей в активизации процессов жизнедеятельности макроорганизма-хозяина и защиты его от инфекции;
- микроорганизмы, которые распространены у здоровых животных, в основном условно-патогенная микрофлора, которая считается представителями нормальной микрофлоры. При снижении устойчивочти макроорганизма и радикальных изменениях качественного и количественного состава ммик-роорганизмов, именно эти бактерии служат отягощающим звеном при различных заболеваниях или как причинный фактор, способный приводить к появлению болезней с различной степенью тяжести;
- бактерии-возбудители инфекционных болезней, которые встречаются в латентном или активном состоянии (Блохина И. Н., 1980).
Существует также деление бактериальных популяций, которые могут устанавливаться в пищеварительном тракте, по аспекту, учитывающему локализацию внутри кишечной трубки (Тимошко М. А., 1990). К первой группе относятся микроорганизмы, существующие в очень тесном взаимоотношении с эпителием желудочно-кишечного тракта и ассоциированы с его слизистой. Они относятся к мукозным бактериям (М-микрофлора). Вторая группа включает в себя бактерии, встречающиеся свободно в кишечном содержимом. Так как они находятся в просвете кишечника, то входят в состав полостной микрофлоры (П-микрофлоры). Нормальная микрофлора кишечного тракта характеризуется распределением разнообразных видов бактерий не только по горизонтальному (от поверхности слизистой оболочки к центру просвета кишки), но так же и по проксимально-дистальному направлениям. По этим параметрам у отдельных видов микроорганизмов имеются свойственные им места нахождения и ниши. Один и тот же вид микрофлоры может быть индигенным (автохтонным) для данного организма-хозяина, если эти бактерии обитают в «положенном» им месте, и аллохтонным, если они заселяют не свойственные им места обитания (например, при бурном размножении представителей микрофлоры нижнего отдела кишечника, в верхнем отделе тонких кишок в случае подавления перистальтики).
Основными представителями нормальной микрофлоры кишечника являются – молочнокислые микроорганизмы и бифидобактерии. Популяции этих микроорганизмов располагаются на поверхности слизистой, примыкая к мембранам энтероцитов, или находящиеся в непосредственной близости от поверхности эпителия, в слое муцина, который покрывает мембраны эпителиальных клеток (Панин А. Н., 1996).
В норме в 1 г содержимого кишечника находится 108–1012 бифидо-бактерий, а снижение их уровня до 107 и ниже говорит о происшедших нарушениях в кишечном микробиоценозе. Наличие этой группы бактерий в кишечнике препятствует развитию патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способствуя нормализации микробного баланса кишечника в целом. Антибактериальная активность бифидобактерий осуществляется за счет образования компонентов с антибиотической активностью и летучих органических кислот; конкурентоспособной адгезии на энтероцитах; иммуно-модулирующей активностью и пищевой конкуренцией.
Второй по численности и значимости популяцией среди всей микрофлоры желудочно-кишечного тракта птицы являются молочнокислые бактерии. В 1 г содержимого толстого кишечника содержится 104–109 лактобактерий (Дис-бактериозы …, 2005). Они обладают свойствами антагонизма в отношении гнилостной, патогенной и условно-патогенной микрофлоры, а также препятствуют росту группы кишечной палочки, стафилококков, сальмонелл, и других микроорганизмов. Это свойство обеспечивается способностью молочнокислых бактерий вырабатывать многочисленные антибиотические вещества, а также перекись водорода, интерферон, лизоцим и интерлейкин (Панин А. Н., 1998). Кроме этого, молочнокислые микроорганизмы синтезируют углеводы и спирты, отдельные виды разрушают крахмал и вырабатывают белок (Dicks Leon M.T., 1993).
На сегодняшний день имеется достаточно информации о закономерностях динамики колонизационного процесса микроорганизмами желудочно-кишечного тракта птицы. Выявлено, что в кишечнике вновь родившихся птенцов в первые дни превалируют кокковые микроорганизмы и клостридии, затем начинают преобладать неспоровая анаэробная микрофлора, а к концу первого месяца жизни формируется микробный консоциум, сходный с таковым у взрослого поголовья. Микробиоценоз пищеварительного тракта кур очень многообразен по видовому составу, но превалирующими являются молочнокислые бактерии (Langouht P., 2000).
Согласно данным литературы у сельскохозяйственной птицы имеются два основных участка бактериальной деятельности – это зоб и слепая кишка (Fuller R., 1984). Из содержимого зоба было выделено 52 штамма (21,8 %), из железистого желудка – 19 штаммов (7,98 %), из химуса тонкого кишечника – 54 (22,7 %), из содержимого слепой кишки – 58 (24,4 %) и из содержимого прямой кишки – 12 (5,1 %) (Thomakov H., 1995).
Численность микроорганизмов в зобе и в особенности в слепых отростках у цыплят и у кур самая высокая, а превалирующими среди микробных видов являются лакто- и бифидобактерии, неспороносные анаэробы, бактероиды и другая микрофлора (Тимошко М. А., 1990).
Полезную кишечную микрофлору делят на облигатную и факультативную. Под облигатной понимают те виды микроорганизмов, которые приспособились к защитной реакции организма, интенсивно развиваются в пищева 15 рительном тракте, а также постоянно встречаются в нем в больших количествах. Вторая группа включает в себя различные виды микроорганизмов, которые спорадически появляются в кишечнике или встречаются постоянно, но в больших количествах, поэтому они не имеют особого функционального значения (Перетц Л. Г., 1955).
Облигатный микробиоценоз кишечника птенцов представлен преимущественно строгими и факультативными анаэробами. У птиц как и у млекопитающих, включая человека, наиболее колонизирован микроорганизмами толстый отдел кишечника. Количество микроорганизмов в содержимом может достигать 1012 КОЕ/г. В химусе присутствуют представители более 400 видов микроорганизмов, при этом число анаэробов в 100–1 000 раз превышает количество аэробных бактерий (Simon G. L., 1984).
На видовой микробный состав оказывают влияние антимикробные секреты желудка, двенадцатиперстной кишки, желчи, кишечного сока, состав и количество муцина, концентрация рН, скорость обновления, созревания и метаболизма мукозного эпителия (Hill M. J., 1982; Nagy E., 1994).
Результаты многочисленных исследований взаимоотношений макроорганизма с его нормальной кишечной микрофлорой свидетельствуют о том, что последняя принимает активное участие в самых разных физиологических функциях. Однако важнейшей является то, что она вместе с организмом хозяина обеспечивает колонизационную резистентность слизистой оболочки кишечника (Субботин В. В., 2000; Сидоров М. А., 2003; Алямкин Ю., 2005).
Также, полезная микрофлора: принимает активное участие в водно-солевом обмене, в детоксикации экзогенных и эндогенных субстратов, а также в регуляции газового состава кишечника; способна проявлять морфокине-тическое действие; вырабатывает ферменты, принимающие активное участвующие в обмене белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот, а также аминокислоты и биологически активные соединения (антибиотики, витамины, гормоны и др.); способна обеспечивать колонизационную резистентность и рециркуляцию желчных кислот, холестерина и других веществ; в формиро 16 вании иммуного ответа на внедрившийся в организм антиген; является местом локализации микробных хромосомных плазмидных генов; является источником энергии для клеток организма-хозяина (Сидоров М. А., 2000; Сидоров М. А., Субботин В. В., 2000).
Немаловажной функцией нормальной кишечной микрофлоры является способность вырабатывать витамины. Как правило, цыплята за счет собственной микрофлоры покрывают свои потребности в фолиевой, никотиновой, пантотеновой кислотах, рибофлавине, витамине К, биотине и витаминах группы В (Coates M. R., 1968). К микрофлоре, способной вырабатывать витамины группы В относятся: лактобациллы, бифидобактерии, энтерококки, азотобактерии и кишечная палочка (Пепелина В. А., 1969).
Микроорганизмы кишечника влияют на регуляцию газового состава полостей организма-хозяина. В процессе микробной метаболизации различных соединений внешнего и внутреннего происхождения в организме животных и птиц образуются различные газообразные продукты, которые выделяются в окружающую среду с выдыхаемым воздухом и фекалиями (Cummings I. H., 1981).
На сегодняшний день наиболее глубоко изучены процессы образования водорода, аммиака, метана, углекислого газа, сероводорода микрофлорой, населяющими желудочно-кишечный тракт. Водород также может формироваться в результате окисления формиата (Christl S. V., 1992).
Метан образуется в желудочно-кишечном тракте облигатно анаэробными микроорганизмами, которые берут энергию в результате конверсии водорода, формата, углекислого газа, ацетата и метанола в метан. Одним из главных источником при образовании метана в кишечнике является индол (Wang Yi Tin, 1984).
Аммиак образуется в толстой кишке вследствие микробного разложения мочевины или аминокислот. Установлено, что наибольшее количество аммиака в слепой кишке у птиц образуется из мочевины и амида глутаминовой кислоты (Karasawa Y., 1988).
Технология получения пробиотической добавки Трилактокор
Получение чистых культур наиболее значимых видов рода Lactobacillus желудочно-кишечного тракта перепелов. Генетическая селекция по признакам высокой продуктивности поголовья и особенности промышленной технологии выращивания сельскохозяйственной птицы в настоящее время привела к понижению естественной резистентности организма и, как следствие, широкому использованию противомикробных препаратов в составе кормов. Альтернативой применения антибиотиков может быть коррекция эндомикро-экологии птицы с помощью живых микроорганизмов, которые при введении в физиологических количествах приносят пользу здоровью организма-хозяина (Neef A, 2013). Поэтому наиболее предпочтительны для этих целей штаммы, входящие в естественные для данного вида и эволюционно закрепленные микробные ассоциации, обладающие повышенной функциональной адаптацией к физиологическим особенностям выращиваемой птицы. Их поиск и характеризация с целью выделения автохтонных бактериальных штаммов организма-хозяина и создания на их основе биопрепаратов вызывают постоянный интерес (Neef A, 2013; Su H., 2014).
Профилирование микробиома птицы по отделам желудочно-кишечного тракта. Анализ относительной представленности таксономических групп бактерий проводился методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени в двух или трех повторах из образцов метаге-номной ДНК отделов желудочно-кишечного тракта (зоба, мускульного желудка, слепой кишки, подвздошной кишки, а также нижней трети прямой кишки) перепелов с использованием набора реактивов ПЦР-Микс в присутствии красителя EvaGreen и референсного красителя ROX (Синтол, Россия) согласно рекомендациям производителя. Для получения статистически достоверных результатов все эксперименты проводились на 20 гол птиц. В исследованиях использовались самки японского перепела (Coturnix japonica) породы «японские серые», полученные в селекционно-племенном и генофондном стаде перепелок Всероссийского научно-исследовательского и технологического института птицеводства (ВИНИТИП, г. Сергиев Посад, Россия). При выращивании птицы применялся комбикорм комбинированный ПКП-1, в котором отсутствовали кормовые добавки, содержащие пробиотики и антибиотики.
Перепелов выводили из эксперимента в 42-45-дневном возрасте после стабилизации яйценесения c живой массой тушки около 150170 г. Умерщвление проводилось путем декапитации. Вскрытие осуществлялось с соблюдением правил асептики. Полученные образцы помещались в индивидуальные стерильные пробирки типа Эппендорф. Часть из них подвергалась быстрому замораживанию в жидком азоте и убирались на хранение при минус 80 С без предварительного разделения содержимого просвета соответствующего участка ЖКТ (химуса) и тканей птицы. Из другой части образцов извлекался химус, взвешивался и ресуспендировался в массовом отношении 1/3 в стерильном физиологическом растворе (0,9%-й раствор хлорида натрия при значении рН 7,4), содержащем дополнительно 15,0 % глицерина. Полученные образцы использовались для микробиологических исследований и выделения общей бактериальной хромосомной ДНК.
Бактериальная геномная ДНК выделялась из свежих образцов отделов желудочно-кишечного тракта перепела (зоб, мускульный желудок, слепая кишка, подвздошная кишка, а также нижняя треть прямой кишки) с использованием набора Genomic DNA PurificationKit (ThermoScientific, CША) согласно инструкции изготовителя. Полученную в количестве 50 мкл метаге-номную ДНК разаликвочивали в стерильные пробирки по 10,0 мкл и хранили при -20С.
После выделения чистота образцов качественно оценивалась с помощью электрофореза в 1%-м агарозном геле при окрашивании интеркалирующим красителем - бромистым этидием. На рисунке 2 представлено электрофоре 53 тическое разделение образцов метагеномной ДНК из зоба (1), мускульного желудка (2), слепой кишки (3) и подвздошной кишки (4) двух перепелов (I и II). В качестве ДНК маркера (M) использовали стандартный коммерческий препарат #SM1103 (Fermentas, Литва). Количество метагеномной ДНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 2000 («ThermoScientific», CША).
Подбор и синтез специфичных праймеров для таксономической идентификации групп бактерий. Поскольку проверка индивидуальности выделенных клонов бактерий осуществляется с помощью полуколичественной ПЦР с использованием в качестве матрицы коротких нуклеотидных последовательностей, колирующих специфичные участки генов 16S РНК изучаемых родов и семейств бактерий («праймеров»), на следующем этапе работы было необходимо подобрать необходимые праймеры. Их нуклеотидная последовательность составлялась с помощью программы PerlPrimer (http://perlprimer.sourceforge.net). Проводилось сравнение с ранее опубликованными последовательностями праймеров изучаемых родов и семейств бактерий (таблица 2).
В таблице 2 приведены синтезированные праймеры (Евроген, Россия) порядковые номера, длина, использованная температура отжига и ссылки на оригинальные работы, на основании которых был сделан выбор (Ребриков Д. В., 2009; Lunedo R., 2014). Применялись следующие комбинации праймеров: DomBacF/DomBacR (1/2) - для идентификации последовательности гена 16SpPHK общего для всего домена Bacteria (образцы нормировали по уровню сигнала этой пары праймеров); EnteroBacF/EnteroBacR (3/4) - для семейства Enterobactenaceae; LacBacilF/LacBacilR (5/6) - для семейства лак-тобацилл (Lactobacillaceae). Также использовалась дополнительная пара праймеров LBacillF/LBacillR (11/12), которая специфична к представителям рода Lactobacillus. Пары праймеров EnterococF/EnterococR (7/8), Bif 55 Bac_F/BifBac_R (9/10) и EscherF/EscherR (13/14) были специфичны для родов Enterococcus, Bifidobacterium и Escherichia соответственно.
Проверки специфичности и подбора оптимальных температурных условий для каждой из синтезированных пар праймеров проводились с помощью полуколичественной ПЦР. Температурно-временной профиль реакции был следующим: денатурация ДНК при 95 С - 2 мин; ПЦР (95 С - 15 сек; отжиг при соответствующей для каждой пары праймеров температуре (таблица 1) -40 С; 72 С - 40 сек) - 32 цикла; конечная элонгация при 72 С- 2 мин. Визуализацию продуктов амплификации каждой используемой пары праймеров осуществляли с помощью электрофореза в 1%-м агарозном геле при окрашивании нтеркалирующим красителем - бромистым этидием.
Анализ относительной представленности таксон-специфических вариантов гена 16S рРНК наиболее значимых групп бактерий. Исходя из предварительно полученных данных полуколичественных ПЦР было решено количественные ПЦР в реальном времени проводить с образцами метагеномной ДНК в количестве 30 нг. Анализ кривых плавления проводились с начальной инкубацией 2 мин при 60 С и последующим повышением температуры на 1 С каждые 10 сек до 95 С. На рисунке 3 показан пример протокола программы и графическое представление результатов амплификации исследуемых образцов. Специфичность ПЦР в реальном времени оценивалось путем анализа кривых плавления. В реакциях с матрицей наблюдался один пик (соответствующий плавлению специфического продукта), а в случае отрицательного контроля (праймеры без ДНК) - слабые, затухающие стохастические колебания во всем диапазоне температур.
На рисунке 4 представлены результаты изучения содержимого пяти отделов ЖКТ перепела и распределение в них микроорганизмов различных таксономических групп (семейства Enterobacteriaceae - 1, семейства Ente-rococcaceae - 2, семейства Lactobacillaceae - 3, рода Bifidobacterium- 4, рода Lactobacillus- 5, рода Escherichia- 6), полученные методом количественной ПЦР в реальном времени.
Из этого рисунка видно, что максимальное относительное содержание лактобактерий отмечалось в подвздошной кишке, однако с применением пары праймеров Lbacill_F / LBacill_R, которая специфична к представителям рода Lactobacillus, наряду с основным присутствием в подвздошной кишке, отмечался незначительный сигнал в содержимом зоба и мускульного желудка. Представители рода Bifidobacterium колонизуют подвздошную и слепую кишку, а также в значительной мере представлены в содержимом нижней трети прямой кишки.
Влияние пробиотика Трилактокор на мофологические и биохимические показатели крови перепелов
Как указывалось в разделе «Материалы и методы исследований» для изучения влияния отдельных культур микроорганизмов, а также их смеси в составе пробиотической добавки Трилактокор на организм перепелов был проведен научно-хозяйственный эксперимент. Методом групп-аналогов было сформировано пять групп перепелов по 50гол. в каждой: 1-я группа контрольная - в рационе птиц присутствовал основной полноценный комбикорм, рекомендованный ВНИТИП, а также птица имела свободный доступ к питьевой воде; 2-я опытная группа - с основным рационом перепелам выпаивали Lb. salivarius; 3-я опытная группа - птица получала отдельную культуру Lb. intermedius; 4-я опытная группа - перепела выпаивались культурой Lb. agilis; 5-я опытная группа - с основным рационом перепела получали пробиотическую добавку Трилактокор. Продолжительность эксперимента - 49 дн.
Для изучения морфо-биохимического статуса крови птиц на 28-е и 49-е сут из каждой группы было взято по 6 гол перепелов. Морфологические показатели крови перепелов представлены на рисунке 23.
Результаты исследований показали, что морфологические показатели крови перепелов на 28-е сутки находились в диапозоне физиологических норм. При этом хотелось отметить, что в 4-й и 5-й опытных группах зафиксировано незначительное повышение содержания гемоглобина на 7,4 и 8,0 %, а также эритроцитов на 4,5 и 4,2 %, соответственно.
Результаты изучения морфологических показателей крови перепелов на 49-е сутки после применения биопрепаратов показали, что количество эритроцитов в 1 мл крови птиц в контрольной группе составляло 3,37 1012/л. Этот показатель в опытных группах был выше контроля на 0,6 % (2-я); 2,3 % (3-я); 4,3 % (4-я) и 4,8 % (5-я). Наибольшее содержание гемоглобина крови наблюдалось в 4-й и 5-й опытных группах и составило 142,83 и 143,08 г/л. Количество лейкоцитов в крови 4 и 5-й опытных групп, было ниже контроля на 4,3 и 4,6 %. Показатели тромбоцитов в исследуемых группах варьировали в приделе 125,04-128,31 109/л, количество в контрольной группе составило 124,04 109/л.
Статистически верных различий между группами не наблюдалось, исследуемые морфологические показатели крови находились в приделах физиологических норм, однако введение в основной рацион пробиотической добавки Трилактокор и отдельных её компонентов оказывает положительное влияние на эритропоез крови перепелов, что выражено в снижении уровня лейкоцитов и повышении уровня, как гемоглобина, так и эритроцитов.
На рисунке 24 представлены основные биохимические показатели сыворотки крови перепелов, позволяющие определить функциональность внутренних органов, а также развитие патологических и воспалительных процессов в организме птицы.
Из таблицы видно, что использование исследуемых биопрепаратов в рационе перепелов способствовало положительной динамике биохимических показателей сыворотки крови как на 28-е, так и 49-е сут. В особенности хотелось отметить позитивное влияние на биохимические показатели сыворотки крови птиц пробиотиков на 49-е сутки. Так в 3-й, 4-й и 5-й опытных группах уровень общего белка был выше, чем в контрольной группе на 3,4; 7,1 и 8,6 %, а белковый индекс - на 7,4 и 8,5 %, соответственно. В 1-й опытной группе пробиотик существенно не повлиял на показатель белкового коэффициента и оставался в пределах 0,76, что на 1,3 % выше данного показателя в контрольной группе.
В той или иной степени липидный обмен отражается показателем холе-стернина, статистически достоверное (Р 0,05) понижение которого выявлено в 4-й и 5-й опытных группах на 8,1 и 6,7 %, соответственно. Полученные данные по уровню АЛТ и АСТ свидетельствовали о положительной работе печени и сердца и их статистически достоверные (Р 0,05) понижения наблюдались в 4-й и 5-й опытных группах. АСТ и АЛТ в 4-й опытной группе снизились на 4,22 и 5,09 %, понижение данных показателей в 5-й группе составило 3,52 и 4,62 %, соответственно. Немаловажными компонентами крови, которые принимают участие в обмене минеральных веществ являются фосфор и кальций. Показатели 4-й и 5-й опытных групп по количество фосфора в крови были выше, чем в контроле на 14,1, и 13,3 %, а по содержанию кальция – на 16,5 и 18,9 % при статистически достоверной разнице (Р 0,05). Таким образом, использование биопрепаратов на основе живых микроорганизмов, в частности пробиотической добавки Трилактокор, оказывает позитивное влияние на организм перепелов.
Влияние Трилактокора на мясную продуктивность и качество мяса перепелов
Рост и развитие перепелов. Для изучения влияния пробиотической добавки Трилактокор на организм перепелов Техасской породы методом групп-аналогов были сформированы группы птиц с физиологически нормальными признаками без проявления какой-либо патологии. В процессе всего эксперимента велось наблюдение за состоянием перепелов с учётом поведения птицы, сохранности, изменения живой массы и расхода комбикормов. Данные представлены на рисунке 25 и в таблице 13.
Согласно полученным данным самый высокий процент сохранности -100,0 % - наблюдался в 5-й опытной группе, где перепела получали 0,5 мл/гол Трилактокора, сохранность в 4-й и 3-й опытных группах была на уровне 98,0 %. Во 2-й опытной группе сохранность составила 96,0 %. Самый низкий процент сохранности наблюдался в контрольной группе, который составил 90,0 %.
На протяжении опыта проводилось периодическое взвешивание птицы. По результатам первого контрольного взвешивание разницы в показателях прироста живой массы перепелов не выявлено, что обусловлено уравнительным периодам роста птицы. Живая масса перепелов 3-й, 4-й и 5-й опытных групп к 14 дн жизни превышала показатели контрольной на 2,3; 2,8 и 3,6 %.
На 21 дн проведения опыта показатель динамики живой массы в 5-й опытной группе превышал контрольную на 5,5 %. К четвертой, пятой, шестой и седьмой неделям жизни перепелов сохранилась тенденция увеличения разности прироста живой массы птицы в сравнении с контрольной, однако в эти возрастные периоды только в 5-й опытной группе наблюдалась статистически достоверное повышение живой массы птицы на 8,7; 11,3; 12,3 и 11,9 %, соответственно (Р 0,05).
Введение с основным рационом биопрепаратов положительно повлияло на показатель прироста живой массы перепелов. Наибольший суточный прирост массы тела птицы зафиксирован в 5-й опытной группе, который составил 6,4 г. Затраты корма на одну голову в данной группе был 950,11 г. Однако, с учетом прироста, показатель конверсии корма в 5-й опытной группе был ниже, чем в контрольной на 0,31 кг или 9,3 %.
Таким образом, обосновать повышенную динамику живой массы перепелов в опытных группах, в частности в 5-й опытной группе, можно за счет положительного воздействия пробиотической добавки Трилактокор, которая способствует лучшему усвоению энергии и питательных веществ комбикорма.
Мясная продуктивность, развитие внутренних органов и качество мяса перепелов. Для изучения влияния пробиотической добавки Трилактокор и её отдельных компонентов на показатели мясной продуктивности, развитие внутренних органов, а также качество мяса перепелов в 49-дневном возрасте проводился убой птиц с полной анатомической разделкой. Данные показателей мясной продуктивности представлены в таблице 14.
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что статистически достоверное (Р 0,05) превышение изучаемых показателей отмечалось только в 5-й опытной группе относительно контроля. Установлено, что масса потрошенной тушки в 5-й опытной группе была выше, чем в контрольной на 18,1 %, в то время как во 2-4-й опытных группах данный показатель составил - 2,1; 3,2 и 4,2 %, соответственно.
Проведена оценка съедобных частей тела перепелов с целью определения мясных качеств птицы. Наибольшую массу грудных мышц имели перепела из 5-й опытной группе, которая составила – 73,25 г против 62,58 г в контрольной. Анализ мышц голени установил, что достоверное (Р 0,05) увеличение их массы наблюдалось в 4-й и 5-й группах, относительно контроля на 30,7 и 29,0 %. В целом, масса всех мышц в 5-й опытной группе составила 129,72 г, что на 21,5 % выше, чем в контрольной группе.
Для полной оценки влияния пробиотической добавки Трилактокор и отдельных её штаммов на мясную продуктивность перепелов произведен анализ развития их внутренних органов в 49-дневном возрасте, данные представлены на рисунке 26 и в таблице 15.
Анализ развития внутренних органов перепелов в 49-дневном возрасте показал, что в связи с увеличением живой массы птиц в опытных группах наблюдалась незначительная тенденция к увеличению изучаемых показателей, однако статистически достоверной разницы не отмечено.
Питательные качества мяса перепелов оценивали по результатам химического состава мышц и их энергетической ценности, представленным на рисунке 27 и в таблице 16.
На основании полученных данных можно сделать вывод, что количество жира в мышцах 4-й и 5-й опытных групп было статистически меньше контроля и составляло 3,72 и 3,69 %, а во 2-й и 3-й опытных группах - 4,51 и 4,12 %. Количество белка лишь в 3-й, 4-й и 5-й опытных группах превышало результаты контрольной на 0,8; 1,8 и 1,7 %. Показатель энергетической ценности 1 кг мышц в исследуемых группах был практически равнозначным и варьировала в приделах 532,02-534,03 кДж. Таким образом, введение про-биотической добавки Трилактокор положительно влияет на химический состав мяса, повышая его диетические качества.
С целью проведения дегустационной оценки мяса и бульона перепелов была проведена проба варкой грудных и бедренных мышц. Сводные дегустационные данные представлены на рисунке 28.
Существенных различий в исследуемых образцах не выявлено, мясо имело коричнево-серый цвет, специфический запах и приятный вкус. Бульон был прозрачный, со скоплением жира на поверхности. Однако дегустаторами отмечено, что мясо опытных групп было более нежным и сочным.
Таким образом, использование биопрепаратов положительно сказывается на мясной продуктивности и качестве получаемой продукции.