Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1. Искусственное осеменение и роль производителей сельскохозяйственных животных в репродукции животных 11
1.2. Факторы, влияющие на сперматогенез у производителей сельскохозяйственных животных и качество получаемой от них спермы
1.2.1. Влияние режимов содержания и кормления на развитие половой системы и спермопродукцию у производителей сельскохозяйственных животных 14
1.2.2. Влияние генетических факторов на спермопродукцию у производителей животных 16
1.2.3. Роль иммунно-инфекционных факторов в регуляции сперматогенеза у производителей сельскохозяйственных животных 18
1.2.4. Значение гормональных факторов в формировании сперматогенеза у животных 22
1.2.5. Влияние стресс-факторов на сперматогенез у производителей сельскохозяйственных животных 27
1.3. Методы и препараты, повышающие сперматогенез и качество спермы у производителей сельскохозяйственных животных 29
1.4. Обоснование актуальности разработки ветеринарных препаратов на основе соматостатинсодержащих белков 40
ГЛАВА 2. Собственные исследования 49
2.1. Материалы и методы исследований 49
2.1.1. Исследование острой токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при внутрижелудочном введении 50
2.1.2. Исследование острой токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при подкожном введении з
2.1.3. Исследование токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при накожном применении 51
2.1.4. Оценка раздражающего действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на кожу и слизистые глаз 52
2.1.5. Изучение субхронической токсичности препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме 53
2.1.6. Исследование эмбриотоксических и тератогенных свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме 55
2.1.7. Подготовка субстанции соматостатинсодержащего белка для приготовления препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме 56
2.1.8. Исследование иммуногенных свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме 57
2.1.9. Определение оптимальной дозы препарата Сат-Сом для повышения сперматогенеза и биологического качества спермы у хряков-производителей 59
2.1.10. Исследование эффективности применения препарата Сат-Сом в
новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза у быков производителей 61
2.2. Схема проведения исследований 62
2.3. Обоснование необходимости совершенствования лекарственной формы препарата Сат-Сом 2.3.1. Совершенствование технологических процессов получения соматостатинсодержащего белка 65
2.3.2. Изучение иммуногенной активности соматостатинсодержащих белков 69
2.4. Изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на лабораторных и сельскохозяйственных животных 70
2.4.1. Острая токсичность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при внутрижелудочном и подкожном введении 70
2.4.2. Токсичность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при накожном применении 72 2.4.3. Раздражающее действие препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме при нанесении на кожу и слизистые глаз 73
2.4.4. Субхроническая токсичность препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме 74
2.4.5. Эмбриотоксические и тератогенные свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме 84
2.4.6. Переносимость препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на продуктивных животных 90
2.5. Применение препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для нормализации сперматогенеза и повышения биологических качеств спермы производителей сельскохозяйственных животных 91
2.5.1. Экспериментальное обоснование терапевтической дозы препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме у производителей сельскохозяйственных животных 91
2.5.2. Применение препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза и биологического качества спермы у хряков-производителей 98
2.5.3. Применение препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения сперматогенеза и биологического качества спермы у быков-производителей молочной и мясной пород 102
2.6. Обсуждение результатов собственных исследований 108
Выводы 117
Практические предложения 119
Список использованной литературы
- Влияние режимов содержания и кормления на развитие половой системы и спермопродукцию у производителей сельскохозяйственных животных
- Методы и препараты, повышающие сперматогенез и качество спермы у производителей сельскохозяйственных животных
- Оценка раздражающего действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на кожу и слизистые глаз
- Изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на лабораторных и сельскохозяйственных животных
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Решение проблемы продовольственной безопасности и обеспечения населения России продукцией животноводства во многом определяется показателями репродуктивной способности сельскохозяйственных животных. В последние годы в животноводческих хозяйствах РФ получают менее 75 телят на 100 коров. Снижение показателей репродукции сельскохозяйственных животных является общемировой тенденцией и характерно для стран с развитым животноводством.
Эффективность репродукции животных во многом зависит от биологического и санитарного качества спермы производителей. Специалисты отмечают устойчивую тенденцию к снижению биологического качества спермы у производителей сельскохозяйственных животных. Одной из возможных причин этого является повышение неблагоприятной экологической нагрузки на организм животных и, как следствие, нарушение физиологических, биохимических процессов, регулирующих процесс сперматогенеза.
Достаточно много внимания специалисты уделяют изучению роли соматотропного гормона (СТГ) в регуляции процессов роста и повышения мясной и молочной продуктивности животных. Результаты экспериментальных исследований, проведенных в последние годы, показали, что помимо вышеуказанных регуляторных механизмов, СТГ также влияет на регуляцию репродуктивных процессов животных и на развитие эмбрионов млекопитающих. Тем не менее, детальные механизмы влияния СТГ на вышеуказанные процессы еще недостаточно изучены. Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют о перспективности разработки лекарственных соединений, повышающих репродуктивный потенциал сельскохозяйственных животных, и оказывающих регуляторное воздействие на содержание в организме гормона роста.
Степень разработанности темы. Теоретической предпосылкой для разработки и изучения фармако-токсикологических свойств ветеринарного препарата на основе соматостатинсодержащего белка является регулирующее
влияние соматостатина на содержание СТГ в организме животных, который, как показали исследования последних лет, играет важную роль в сперматогенезе у производителей сельскохозяйственных животных.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и исследование его фармакологической активности при применении у хряков и быков-производителей.
Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:
-изучить фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и определить иммуногенную активность соматостатин-содержащего белка;
-установить оптимальную дозу и схему применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на хряках-производителях;
-изучить фармакологическое действие препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на спермопродукцию и биологическое качество спермы у хряков и быков-производителей;
- изучить фармакологическое действие препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола в крови у быков-производителей молочной и мясной пород и установить взаимосвязь этих показателей с уровнем спермопродукции и биологическим качеством спермы животных;
-определить эффективность применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на оплодотворяющую способность спермы, полученной от быков-производителей, у которых первоначальный брак спермы по биологическим показателям превышал 40%.
Научная новизна. Изучены фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и экспериментально доказана безопасность его применения в практике ветеринарии и животноводства.
Экспериментально доказана более высокая иммуногенность сомато-статинсодержащего белка препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме.
Впервые доказано регулирующее влияние применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола у быков-производителей. Впервые обоснована перспективность применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме для повышения спермопродукции и биологического качества спермы у быков и хряков-производителей. Экспериментально подтверждена высокая оплодотворяющая способность спермы, полученной от хряков и быков-производителей, которым применяли препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме.
Научная новизна исследований подтверждена Патентом РФ № 2493873 «Инъекционный препарат для повышения спермопродукции у производителей сельскохозяйственных животных и петухов и способ его применения (приоритет изобретения от 07.06.2012г.).
Теоретическая и практическая значимость работы. В результате выполнения научных исследований определены фармако-токсикологические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме. Установлена высокая оплодотворяющая способность спермы хряков и быков-производителей, полученной после введения животным препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме. Экспериментально доказано регулирующее влияние применения препарата Сат-Сом на содержание тестостерона и эстрадиола в крови у быков-производителей молочной и мясной пород и взаимосвязь этих показателей с уровнем спермопродукции и биологическим качеством спермы.
Методология и методы исследований. Предметом исследований явилось изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме и его эффективности для повышения сперматогенеза, качества спермы хряков и быков-производителей. Исследования по изучению фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме проводили в соответствии с положениями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» с использованием следующих методов:
токсикологические: определение острой токсичности препарата при внутрижелудочном и подкожном введении, субхронической токсичности, накожной токсичности, раздражающих, эмбриотоксических и тератогенных свойств;
иммуно-биохимические и гистологические: изучение иммуногенной активности соматостатинсодержащего белка, гематологических и биохимических показателей крови, проведение гистологического анализа органов и тканей;
клинические: изучение переносимости препарата, наблюдение за физиологическим состоянием лабораторных и сельскохозяйственных животных, изучение показателей сперматогенеза и качества спермы хряков и быков-производителей ;
статистические: статистическую обработку данных проводили методом вариационной статистики с помощью простого сравнения средних по двухстороннему t-критерию Стьюдента. Различия определяли при 0,05 уровне значимости. Статистический анализ выполняли с помощью программы «Student-200».
Апробация и реализация результатов исследований. Основные научные положения, выводы и рекомендации диссертации доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии воспроизведения животных», посвященной 85-летию со дня рождения профессора Г.А. Черемисинова и 50-летию создания Воронежской школы ветеринарных акушеров (18-19 октября 2012г., г. Воронеж), международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарного акушерства и репродукции животных», посвященной 75-летию со дня рождения и 50-летию научно-практической деятельности доктора ветеринарных наук, профессора Г. Ф. Медведева (10-12 октября 2013 г., Горки, Республика Беларусь). Практические предложения, изложенные в материалах диссертации, включены в инструкцию по применению препарата Сат-Сом для повышения продуктивности и качества спермы быков и хряков-производителей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ, из которых 3- в научных изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-фармако-токсико логические свойства препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме;
-результаты изучения фармакологического действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на спермопродукцию и биологическое качество спермы у хряков и быков-производителей;
- влияние применения препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на содержание тестостерона и эстрадиола у быков-производителей молочной и мясной пород и взаимосвязь этих показателей с уровнем спермопродукции и биологическим качеством спермы;
-результаты искусственного осеменения коров и телок спермой быков-производителей после применения им препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного набора, включая введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, заключение, список использованной литературы, приложения. Работа содержит 25 таблиц. Список использованной литературы включает 211 источников, в том числе 74 зарубежных.
Влияние режимов содержания и кормления на развитие половой системы и спермопродукцию у производителей сельскохозяйственных животных
Увеличение производства животноводческой продукции во многом связано с повышением продуктивных качеств скота за счет максимального использования потомства племенных быков-производителей, основная масса которых находится на предприятиях по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных. В то же время, рациональное использование животных иногда становится невозможным из-за частых возникающих расстройств их воспроизводительной функции. Ценность быка как источника генетического потенциала возрастает после его проверки по потомству. Статистика выбраковки быков в отечественных предприятиях по искусственному осеменению показывает, что не менее 20 % быков-производителей специалисты племпредприятий выбраковывают вследствие потери потенции и снижения качества спермы, что обусловлено генетическими, технолого-эксплуатационными, алиментарными, экологическими факторами, либо их сочетаниями [56].
Одной из основных задач теории и практики современного животноводства, в частности репродукции животных с использованием метода искусственного осеменения, является изучение зависимости между условиями содержания животных и динамикой развития половой системы и их гормонального статуса.
Известно, что условия кормления и содержания племенных животных влияют на их развитие, половое созревание, качество спермопродукции и продолжительность использования как донора спермы [96; 114]. При интенсивной динамике развития животных повышается скороспелость и сокращается доэксплуатационный период у быков, улучшается качество спермы, но несколько уменьшаются ее экстрагонадные резервы, заметно замедляется восстановление половой реакции, снижается экономичность обмена веществ, а также сокращается продолжительность продуктивного периода производителей [159]. Авторами отмечено, что при снижении содержания в корме перевариваемого протеина на 25 % у быков в возрасте 2,5-4 года не регистрировали уменьшение объема эякулята, общего содержания сперматозоидов, в том числе и с прямолинейно-поступательным движением [148; 181]. Любая несбалансированность кормового рациона животных в сторону дефицита либо превышения рациональных норм кормления отрицательно влияет на все этапы сперматогенеза: деление сперматогенного эпителия, формирование и созревание сперматозоидов, биохимический состав секрета добавочных половых желез [56].
Ускорению наступления половой зрелости быков-производителей, повышению количественных и качественных показателей спермы способствует концентратный тип кормления животных в раннем возрасте. При этом отклонение от принятых нормативов (снижение доли концентратов в корме до 38-39 % или их повышение до 79-95 %) приводит к замедлению полового созревания, нарушению физиологического статуса и снижению качества спермы у взрослых быков [55; 67]. Исследованиями А. А. Алиева и Э. М. Алиевой установлено, что увеличение содержания в рационе перевариваемого протеина влияет на увеличение объема спермы на 17 %, и на повышение концентрации сперматозоидов (17 %), положительно сказывается на качественных характеристиках половых клеток (подвижность и жизнеспособность сперматозоидов). В период скармливания животных рационов со сниженным содержанием протеина авторы отмечали снижение объема эякулята на 0,2 мл [5].
К технолого-эксплуатационным факторам выбраковки быков-производителей на племпредприятиях относят нарушения и извращения половых рефлексов, обусловленные неправильными манипуляциями персонала при взятии семени, заболевания опорно-двигательного аппарата животных, приводящие к нарушению функции гормональной системы. Высокие значения брака нативной спермы по биологическим показателям (более 20 %) зафиксированы у животных, находящихся в племпредприятиях, расположенных в районах с неблагоприятной экологической обстановкой. Пусковыми факторами нарушений спермопродукции в этом случае могут быть загрязнение внешней среды (вода, воздух, фауна) экотоксикантами, наиболее опасными из которых являются соли тяжелых металлов, радиоактивные отходы, хлорированные диоксины, дибензофураны и целый ряд других ксенобиотиков. Иными причинами снижения потенции быков-производителей могут быть наличие микотоксинов в кормах, в частности зераленона [56]. В последнее десятилетие исследователи отмечают нарушение воспроизводительной функции самцов у всех видов сельскохозяйственных животных, что обусловлено как внешними факторами (условия содержания, кормления, увеличение отрицательной экологической нагрузки), так и нарушениями развития половых органов в пре- и постнатальный периоды онтогенеза [59]. Причины этих явлений полностью не изучены и требуют своего решения, так как выявление факторов, влияющих на сперматогенез и качество спермы, будет способствовать поиску научно-обоснованных методов, позволяющих нормализовать функцию эндокринной системы, ответственной за сперматогенез и биологическое качество спермы.
Методы и препараты, повышающие сперматогенез и качество спермы у производителей сельскохозяйственных животных
Известно, что тестикулы, несмотря на их иммунный статус, полностью не изолированы от иммунной системы организма животных. В дополнение к макрофагам-«резидентам» в тестикулах присутствуют циркулирующие иммунные клетки, включая Т-лимфоциты [153; 162]. Обнаружено, что тестикулы обладают эффективным дренажем к региональным лимфатическим узлам, в которых субпопуляция ТН1-клеток, участвующих в реакциях клеточного иммунитета (гиперчувствительность замедленного типа, клеточная цитотоксичность и воспаление), присутствует чаще, чем субпопуляция ТН-2 клеток, участвующих в гуморальном иммунитете (синтез антител и аутоантител). Установлено, что ТН1-клетки синтезируют IFN-y коммитированный на синтез IgA, который, соединяясь с секреторным компонентом слизистых оболочек тестикул, формирует slgA, представленный в семенной плазме. Кроме того, среди функций IFN одной из важнейших является активация макрофагов - их микробиоцидности и цитотоксичности, а также участие в продукции супероксидных и нитрооксидных радикалов и простагландинов. Установлено, что пролактин способен вызывать активацию опосредованного макрофагами тестикула синтеза TNFa и, как следствие, уменьшение наработки клетками Лейдига тестостерона, стимулируемого гонадотропином [191].
Увеличение уровня тестостерона в крови усиливает клеточный иммунитет. Цитокины из общего сосудистого русла способны проявлять свои эффекты на тестикулярном уровне. Об этом свидетельствуют факты активного участия цитокинов в формировании гамет и регуляции сперматогенеза [178], а также их вклад в иммуносупрессию семенной плазмы [205]. Иммуносупрессивные свойства связывают с наличием в семенной плазме TGF a/B, IJ-10, IL-IRA, sTNF-R I/II, которые вырабатываются в семенных пузырьках и предстательной железе и содержатся в сперме в довольно высоких концентрациях. Основными продуцентами цитокинов, содержащихся в эякуляте, являются клетки Лейдига, Сертоли, перитубулярные и эпителиальные клетки придатков тестикула, добавочных половых желез (семенных пузырьков, желез Купера, предстательной железы), а также лимфоциты и макрофаги. Существует предположение, что сперматоциты и сперматозоиды способны к синтезу IL-la фактора [203]. Кроме того, обнаружено, что мужские половые клетки экспрессируют на своей поверхности функциональные рецепторы к ряду цитокинов (TGFa / В,НСР, IGF-IR, GM-CSF, IL-2). Наличие такого широкого спектра цитокинов, связанных с мужскими половыми клетками, определяет их активное участие в репродуктивной функции. В ряде работ отмечена тесная взаимосвязь уровней спермальных цитокинов (IFN-y,TNFa, 11-6,11-12) с числом, подвижностью, морфологией сперматозоидов [171; 182]. Для успешного оплодотворения семенная плазма, в которой находятся мужские гаметы, должна содержать сигнальные факторы, контролирующие движение сперматозоидов по репродуктивному тракту самки и их функциональную активность. Так показано, что содержащиеся в семенной плазме TGFB и IL-8 факторы не только способствуют выживанию сперматозоидов в женских репродуктивных путях, но и «кондиционируют» иммунные реакции материнского организма с целью успешной имплантации и развития эмбриона [190]. Таким образом, представленные данные литературы свидетельствуют о важной роли цитокинов в сперматогенезе. Изменение их содержания в плазме спермы ассоциируется не только с возникновением патологического процесса в мужском репродуктивном тракте, но и с эффективностью сперматогенеза, что может послужить основой для понимания и последующей разработки патогенетических методов терапии бесплодия самцов [102].
Другим патогенетическим механизмом нарушения репродуктивной функции самцов является инициация аутоиммунных процессов [146]. Аутоиммунные процессы, развитие которых обусловлено особенностями иммунологических процессов мужского генитального тракта, служат причиной возникновения инфертильности в 10 % случаев. По данным А. В. Боже домова и соавторов аутологичные антиспермальные антитела (ACAT) являются фактором нарушения фертильности у 18 % мужчин в бесплодных супружеских парах [24]. Так было обнаружено, что АСАТ способны оказывать влияние на сперматогенез в яичках, подвижность сперматозоидов в эякуляте, пенетрацию цервикальной слизи и на ряд других процессов. В настоящее время известно, что нарушение фертильности, развивающееся на фоне воспалительных заболеваний половых органов самцов, относится к группе экскреторного бесплодия. Доказано, что микроорганизмы вызывают нарушение фертильности путем прямого токсического воздействия на сперматозоиды, ухудшая качество эякулята. Так гемолизин кишечной палочки, воздействуя на акросому, среднюю часть и хвост сперматозоида, разрушает его мембрану, снижая подвижность половой клетки и оплодотворяемость яйцеклетки [207]. Представленные в настоящем разделе литературные данные указывают на важную роль иммунной системы в формировании и регуляции сперматогенеза.
Известно, что андрогены, относящиеся к группе стероидных половых гормонов, необходимы для реализации репродуктивных функций у производителей сельскохозяйственных животных: эти гормоны обеспечивают половую дифференциацию при эмбриогенезе, определяют функцию тестикул, простаты, семенников [72]. Биосинтез андрогенов происходит в основном в семенниках и интерстициальных клетках Лейдига. В митохондриях клеток Лейдига холестерин превращается в прегненолон, из которого под действием ряда ферментов образуется, в конечном итоге, тестостерон. Контроль уровней секреции тестостерона принадлежит фолликулостимулирующему (ФСГ) и лютеинизирующему (ЛГ) гормонам и она имеет импульсный характер: поступление тестостерона из клеток Лейдига происходят каждые 60-90 минут. Важная роль принадлежит тестостерон-эстрадиол-связывающему глобулину, который обладает высоким сродством к тестостерону и эстрадиолу. Низкий уровень тестостерона в сыворотке крови на фоне повышенного содержания лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов могут быть причиной первичной и вторичной тестикулярной недостаточности. У всех млекопитающих сперматогенез находится под контролем пептидных и гонадотропных гормонов - ФСГ, ЛГ, тестостерона, эстрадиола и других биологически активных веществ [167]. Известно, что для поддержания половой активности необходимо в два раза меньше содержание тестостерона, чем для функционирования механизма обратной связи между семенниками и гипоталамо-гипофизарной системой [99]. Физиологическое значение функционального метаболизма тестостерона заключается в регуляции и модификации гормонального сигнала. Он также необходим для индукции сперматогенеза в пубертатный период и его поддержания в зрелом возрасте, в стимуляции размножения сперматогониев и мейозе сперматоцитов. Даже незначительное нарушение ритма секреции тестостерона или его недостаток может привести к торможению сперматогенеза [167]. Тестостерон активизирует синтез ДНК, деление клеток, биогенез рибополисом и синтез белка, в том числе андрогензависимых ферментов, а также вовлечен в структурные изменения соответствующих участков хроматина [99]. Проводя количественные исследования сывороточного тестостерона у плодов мужского пола и новорожденных бычков, J. Kozumplik отмечал, что концентрация этого гормона зависит от возраста в период от 2-4 месяцев до 2 лет. У животных старше 2 лет достоверно значимых различий в содержании тестостерона не было при отсутствии влияния на эндокринную систему негативных факторов [172]. Авторы изучали динамику концентрации тестостерона в крови быков-производителей в зависимости от возраста, сезона года, породы животных.
Оценка раздражающего действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на кожу и слизистые глаз
Исследования по определению оптимальной дозы препарата Сат-Сом проводили в ОАО «Агрокомбинат Юбилейный» (Витебская область, Республика Беларусь) на хряках-производителях крупной белой породы и породы дюрок. В опытные группы были отобраны животные в возрасте 1,5-2 года без клинических признаков нарушения сперматогенеза. До применения препарата у животных в течение месяца анализировали показатели сперматогенеза: объемы эякулятов, концентрацию сперматозоидов в эякулятах, число полученных спермо доз. Непосредственно перед первой инъекцией препарата Сат-Сом животные были осмотрены ветеринарным врачом и методом случайной выборки разделены на три группы по три головы в каждой. Новую лекарственную форму препарата Сат-Сом в дозе 25 мкг, 50 мкг, 100 мкг соматостатинсодержащего белка на килограмм живой массы тела в форме масляной эмульсии вводили подкожно в область лопатки с межинъекционным интервалом в 14 суток. Объем вводимого препарата составлял 2,0 мл. Показатели сперматогенеза (объемы эякулятов, концентрация сперматозоидов в эякулятах, число полученных спермодоз) анализировали через 30,60,90 суток после второй инъекции препарата Сат-Сом. Эякуляты получали от хряков мануальным методом, при режиме полового использования животного один раз в 4-5 дней. Полученные результаты подвергали статистическому анализу.
Изучение влияния применения препарата Сат-Сом на сперматогенез и биологические качества спермы хряков-производителей проводили на станции искусственного осеменения свиноводческого комплекса ЗАО «Агрофирма Дороничи» (г. Киров, Российская Федерация) на хряках-производителях породы крупная белая в возрасте 1,5-2 года и на 120 основных свиноматках. Исследования проводили на фоне сбалансированного по основным показателям кормления согласно нормам и рационам РАСХН [82].
В экспериментах по изучению влияния препарата Сат-Сом на сперматогенез и биологические качества спермы хряков-производителей препарат животным вводили в форме масляной эмульсии подкожно в область лопатки в дозе 50 мкг соматостатинсодержащего белка на килограмм живой массы. Повторная инъекция препарата Сат-Сом была проведена хрякам через 14 суток после первого введения. Объем вводимого препарата составлял 2,0 мл. Ни у одного животного в экспериментах не было отмечено проявлений каких-либо побочных действий при введении препарата.
В сыворотке крови хряков, до и через 14 суток после каждого применения препарата, определяли морфологические, биохимические и иммунологические показатели крови животных. Изучение лизоцимной активности сыворотки крови проводили согласно методике, описанной В. Я. Сарухановым с соавторами [109]. Эякуляты получали от хряков мануальным методом, при режиме полового использования животного один раз в 4-5 дней. Оценку качества полученных эякулятов осуществляли до применения препарата Сат-Сом ( в течение 5 недель) и через 30, 45 суток после проведения второй инъекции препарата. Оценку качества спермы проводили в соответствии с установленными методиками, используя основные показатели: объем эякулята, внешний вид, цвет, подвижность, концентрацию и выживаемость сперматозоидов. Санитарные показатели спермы хряков оценивали по определению коли-индекса. После оценки качества спермы каждый эякулят разбавляли средой ГХЦС. Основных свиноматок осеменяли спермой хряков, полученной до применения препарата (п = 40, исходное значение), по истечении 30 суток (п = 40) и 45 суток (n = 40) после второй инъекции препарата Сат-Сом. Свиноматок осеменяли при помощи катетера «Фаомтип» двукратно в одну охоту с интервалом 24 часа спермодозой объемом 100 мл с содержанием в ней 3 млрд сперматозоидов с прямолинейно поступательным движением. Эффективность осеменения свиноматок определяли по результатам оплодотворения по данным УЗИ, по фактическим опоросам маток, по их многоплодию и качеству полученного молодняка.
Экономическую эффективность применения препарата Сат-Сом рассчитывали на основе затрат, сложившихся в период проведения исследования, а также по полученной стоимости приплода при рождении.
Изучение переносимости препарата Сат-Сом проводили на 9 бычках голштинской породы живой массой 100-110 кг в ОАО «Агрокомбинат Юбилейный» (Республика Беларусь, Витебская область). Животные были разделены на три группы. Одной группе животных (3 головы) препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме в дозе, превышающей терапевтическую в три раза, вводили подкожно в область лопатки в объеме 6 мл (концентрация белка Сат-Сом составила 2,5 мг/мл), другой группе животных (3 головы) препарат Сат-Сом в дозе, превышающей терапевтические значения в пять раз, вводили подкожно в область лопатки в объеме 10 мл. Третья группа животных была выбрана в качестве контроля. Наблюдение за физиологическим состоянием животных проводили в течение 15 суток.
Исследования фармакологического действия препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на спермопродукцию и биологическое качество спермы у быков-производителей проведены на базе организаций по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных: ОАО «Московское» (Московская область, г. Ногинск) и ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» (Московская область, пос. Быково). Для проведения исследований на базе ОАО «Московское» было отобрано 9 быков голштинской породы и 7 быков породы абердино-ангусской в возрасте от 4-х до 6 лет, у которых брак спермы по биологическим показателям превышал 35 %. В ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» для проведения исследований были отобраны 10 быков-производителей, из них 7 животных голштинской породы и 3 быка абердино-ангусской породы в возрасте от 4-х до 6 лет, у которых по данным контрольных взятий спермы показатель брака составлял 35-38 %.
Препарат Сат-Сом в новой лекарственной форме вводили животным подкожно в область лопатки в дозе 50 мкг/кг живой массы тела дважды с интервалом 14 суток между инъекциями. Перед началом исследований, а также на 30, 60, 90 сутки после повторного применения препарата Сат-Сом у животных брали кровь для определения в ней содержания тестостерона и эстрадиола. Полученную сыворотку крови хранили при -18 С в холодильной камере до проведения исследований. У контрольной группы животных голштинской породы в количестве 10 голов того же возраста также получали сыворотку крови в те же периоды времени, что и в опытных группах. Исследования проводили в осенне-зимний период года (ноябрь - февраль) 2012-2013 годов.
Содержание тестостерона и эстрадиола в крови животных определяли иммуноферментным методом анализа с использованием диагностического набора фирмы «Casubio» (Китай). В период проведения исследований учитывали основные показатели качества спермы быков-производителей: объем эякулятов и количество спермодоз, пригодных для искусственного осеменения коров и телок.
Изучение фармако-токсикологических свойств препарата Сат-Сом в новой лекарственной форме на лабораторных и сельскохозяйственных животных
Существующая лекарственная форма препарата Сат-Сом, применяемого в ветеринарии и животноводстве для регуляции метаболических процессов сельскохозяйственных животных и птицы, представляет собой масляную эмульсию для инъекций. Препарат Сат-Сом содержит в качестве действующего вещества субстанцию Сат-Сом - белок, состоящий из ферментативно неактивной хлорамфениколацетилтрансферазы и антигенной детерминанты соматостатина-14.
Состав препарата по ТУ 9337-002-59141457-13: субстанция (белок) Сат-Сом - 0,250 г, воск пчелиный - 1,0 г, вода для инъекций - 1,0 мл, подсолнечное масло до 100,0 мл. По внешнему виду препарат представляет собой масляную эмульсию беловато-серого цвета. При длительном хранении возможно выпадение осадка.
В соответствии с действующей инструкцией по применению для повышения молочной продуктивности у коров препарат Сат-Сом вводят двукратно в дозе 2 мл (5 мг белка) на 100 кг живой массы тела. Первую инъекцию препарата проводят на 70-75-е сутки после отела животных, вторую инъекцию -через 14 суток после первой инъекции [136].
Для повышения мясной продуктивности крупного рогатого скота препарат Сат-Сом применяют в дозе 2 мл (5 мг белка) на 100 кг живой массы тела. Первую инъекцию препарата проводят телятам 3-4-месячного возраста, вторую инъекцию - через 14 суток после первой инъекции, затем трехкратно с интервалами 2 месяца между инъекциями.
В свиноводстве препарат Сат-Сом применяют в дозе 2 мл (5 мг белка) на 100 кг живой массы тела: супоросным свиноматкам за 50-45 суток до опороса, дважды с интервалом 14 суток между инъекциями; поросятам 15-18-суточного возраста препарат применяют дважды с интервалом 14 суток, затем через два месяца дважды в той же дозе с интервалом 60 дней [87; 105]. Анализ использования препарата Сат-Сом в животноводческих хозяйствах показал, что применяемая в практике лекарственная форма препарата Сат-Сом нуждается в оптимизации состава, вследствие повышенной вязкости масляной эмульсии, обусловленной наличием в прописи пчелиного воска. Необходимость внесения в состав препарата 1,0 г пчелиного воска на 100,0 мл растительного масла ранее диктовалась необходимостью создания «матрицы» эмульсии, в которой замедлялся процесс седиментации белка Сат-Сом, вследствие крупноразмерности его гранул.
Возникла необходимость в совершенствовании лекарственной формы препарата Сат-Сом, характеризующегося сниженной вязкостью, при сохранении остальных прикладных характеристик препарата. Совершенствование технологических процессов получения соматостатинсодержащего белка Препарат, содержащий рекомбинантный белок Сат-Сом, получают путем микробиологического синтеза белка клетками штамма Escherichia coli В-6519 с последующим его выделением, очисткой и сушкой.
Особенность лиофильного высушивания белковых препаратов заключается в том, что конечная форма вещества по окончании процесса высушивания представляет лиофилизат в виде рыхлой подвижной массы, которая достаточно трудно поддается последующему размолу и измельчению.
В процессе исследований был оптимизирован режим сублимационного высушивания белка Сат-Сом. Поскольку белок используется как инъекционный препарат, поэтому целесообразно избежать внесения компонентов защитных сред.
В процессе экспериментальных исследований была подобрана максимальная толщина слоя замороженного раствора белка в поддоне для высушивания. Это обеспечивалось при розливе по 400-500 см ренатурированного белка в поддон и замораживании при температуре -40С в течение не менее суток.
Сублимационную сушку раствора белка производили в вакуум-сушильных аппаратах марки КС-30. По достижении рабочего вакуума, не превышающего 100 микрон, препарат охлаждали до минус (30 ± 3)С и выдержали при указанной температуре в течение 45-60 минут. Длительность процесса высушивания составляет 24-28 часов.
После окончания процесса высушивания субстанцию рекомбинантного белка Сат-Сом диспергировали в роторной мельнице (модель «Retsch Zm200», производство Retsch Gmbx, ФРГ). Режимы размола в предварительных экспериментах были выбраны следующие: скорость вращения ротора мельницы -18 000 об/мин., время размола 3000 мг высушенного препарата белка Сат-Сом -60-65 секунд. Сито с перфорационными отверстиями диаметром 0,08 мм. Препарат непосредственно перед диспергированием помещают в морозильную камеру при температуре -70С и выдерживают при этом температурном режиме 60 минут. Средний размер частиц получаемого после размола препарата составляет 0,01-0,001 мм. По завершении процесса диспергирования полученный сухой белок контролируют на наличие истинного соматостатинсодержащего белка методом электрофореза в полиакриламидном геле. Результаты анализа должны показывать наличие доминирующей белковой полосы молекулярного веса 28 кДа.