Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Основные функции печени и ее роль в реализации генетического и продуктивного потенциала у крупного рогатого скота 11
1.2 Этиопатогенетические факторы в развитии гепатозов и методы их диагностики у коров молочного направления продуктивности 17
1.3 Свободнорадикальные процессы в организме животных и их влияние на развитие гепатопатологий 26
1.4 Наиболее распространенные средства терапии и профилактики гепатозов у коров 33
1.5 Возможности использования средств, обладающих антиоксидантным действием, в профилактике и лечении заболеваний печени у коров 40
2 Собственные исследования 46
2.1 Материалы и методы исследований 46
2.2 Результаты исследований 55
2.2.1 Разработка препарата «Димикар» 55
2.2.2 Изучение токсикологических свойств препарата «Димикар» 58
2.2.2.1 Изучение параметров острой токсичности препарата «Димикар» 58
2.2.2.2 Определение кумулятивного эффекта препарата «Димикар» 72
2.2.2.3 Изучение раздражающих свойств препарата «Димикар» 74
2.2.2.4 Изучение эмбиотоксических и тератогенных свойств препарата «Димикар» 75
2.2.3 Изучение влияния препарата «Димикар» на гематологические и биохимические показатели крови кроликов 80
2.2.4 Оценка действия препарата «Димикар» при экспериментальном моделировании окислительного стресса у кроликов 98
2.2.5 Оценка профилактического действия препарата «Димикар» при экспериментальном моделировании острого токсического поражения печени у белых мышей 104
2.2.6 Изучение эффективности препарата «Димикар» при профилактике гепатозов у коров 107
2.2.7 Влияние препарата «Димикар» на эффективность комплексной схемы лечения гепатозов у коров 132
Заключение 148
Список сокращений и условных обозначений 155
Список литературы 156
Приложения 184
- Свободнорадикальные процессы в организме животных и их влияние на развитие гепатопатологий
- Изучение параметров острой токсичности препарата «Димикар»
- Оценка действия препарата «Димикар» при экспериментальном моделировании окислительного стресса у кроликов
- Влияние препарата «Димикар» на эффективность комплексной схемы лечения гепатозов у коров
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Современная аграрная политика
подразумевает внедрение рентабельных форм ведения животноводства,
направленных на получение максимального количества высококачественной
продукции. Однако стремление к значительному возрастанию
продуктивности за счет использования интенсивных промышленных технологий без соответствующего учета физиологических потребностей животных ведет к функциональным перегрузкам организма, на фоне которых развивается патология (В. А. Мищенко, 2008; И. А. Шкуратова и соавт., 2013; И. И. Калюжный и соавт. 2016; S. LeBlanc, 2010; M. Mari et al., 2010).
Селекция молочного скота, направленная на увеличение удоев, привела к тому, что у животных генетический потенциал продуктивности стал превалировать над физиологическими возможностями. В результате возникла проблема несоответствия фактического потребления расхода энергии и ее поступления в организм коров с кормами на разных этапах физиологического цикла (Е. В. Душкин и соавт., 2008; И. А. Никулин и соавт., 2016; C. Gerspach et al., 2017).
Проявляемая энергетическая диспропорция тем сильнее, чем выше продуктивность животного. Наиболее напряженными по интенсивности обмена веществ у молочных коров является промежуток в течение последних трех-четырех недель до родов и послеродовой период, когда происходят существенные изменения в работе органов и гормональном статусе организма (Р. А. Мерзленко и соавт., 2012; С. П. Ковалев, 2015; G. Bobe, 2004).
В отдельных хозяйствах высокая молочная продуктивность коров
достигается путем введения в их кормовой рацион большого количества
концентрированных кормов, что является одной из основных причин
поражения печеночной патологии (Ю. Н. Алехин, 2008;
И. Ф. Хазимухаметова и соавт., 2010; М. П. Семененко и соавт., 2016; C. Gerspach et al., 2017).
Из болезней печени у высокопродуктивных животных наиболее часто
отмечается гепатоз. Данному заболеванию в различной степени подвержены
до 60 % коров от общего стада. Гепатоз у крупного рогатого скота является
одной из актуальных проблем, стоящих перед ветеринарной наукой и
практикой. Данная патология наносит значительный экономический ущерб,
который складывается из утраты продуктивности, снижения
воспроизводительных качеств и развития сопутствующих заболеваний (М. З. Андрейцев, 2000; Е. В. Душкин и соавт., 2008-2015; Е. В. Кузьминова и соавт., 2013; Р. А. Мерзленко и соавт., 2014).
Сложность диагностики и лечения гепатоза состоит в том, что данное заболевание дифференцируется на поздних стадиях развития и имеет длительное латентное течение (И. А. Никулин, 2002; Ю. Н. Алехин, 2011; М. П. Семененко и соавт.. 2014-2016; Р. А. Добрунов, 2017).
Одним из основных звеньев этиопатогенеза гепатоза является некомпенсированная активация свободнорадикального окисления, снижение активности ферментативного звена системы антиоксидантной защиты и накопление продуктов перекисного окисления липидов в организме животных (М. Р. Баратова и соавт., 2016; М. П. Семененко и соавт., 2016; M. Yin et al., 2017; Y. Yang et al., 2017).
Повреждающему действию свободных радикалов противостоит система антиоксидантной защиты организма. Антиоксидантная система удерживает процесс перекисного окисления на стационарном уровне, не препятствующем нормальной жизнедеятельности. Формирующееся тем самым прооксидатно-антиоксидантное равновесие является важнейшим механизмом гомеостаза (М. И. Рецкий и соавт., 2008; В. С. Авдеенко и соавт., 2016; О. А. Горошко и соавт., 2016; Y. V. Nancharaiah et al., 2015).
Следовательно, на этапе возникновения метаболических и
морфофункциональных изменений в печени, при ранней диагностике нарушений функций данного органа, необходимо проводить адекватную фармакологическую профилактику, предупреждающую дальнейшее развитие повреждений гепатоцитов. Поэтому, создание новых поликомпонентных препаратов, сочетающих гепатопротекторные и антиоксидантные свойства, способных минимизировать морфофункциональные нарушения в печени, остается весьма актуальной задачей ветеринарной науки и практики.
Степень разработанности проблемы. В нашей стране вопросами
изучения проблем диагностики и терапии болезней печени занимались
Ю. Н. Алехин (2011. 2012), М. З. Андрейцев (2000), А. М. Гертман (2012,
2016), Е. В. Душкин (2008-2015), И. И. Калюжный (2013-2016), С. П. Ковалев
(2015), Е. В. Кузьминова (2011-2017), Р. А. Мерзленко (2012-2014),
И. А. Никулин (2002, 2016, 2017), М. П. Семененко (2011-2017),
И. Ф. Хазимухаметова (2008, 2010), И. А. Шкуратова (2010, 2016) и другие.
Изучению проблем гепатопатологий у коров посвящены работы зарубежных ученых J. K. Darckley (2001), C. K. Reynold (2003), G. Bobe (2004), B. G. Young (2004), J. R. Aschenbach (2010), G. Weijers (2010), F. S. Lima (2011) et al.
Вопросами применения антиоксидантов, в качестве средств
профилактики и лечения заболеваний печени занимались М. И. Рецкий
(2008), М. П. Семененко (2011-2017), Е. В. Кузьминова (2011-2017),
А. М. Гертман (2012, 2016), В. С. Авдеенко (2016) и другие. Среди иностранных ученных наиболее значимые работы F. Fraschini (2002), F. Delco (2005), S. C. Pradhan (2006), M. J. Zamek-Gliszczynski (2006), Jhy-Wen Wu (2007), P. Cusack (2009), et al.
Несмотря на наличие работ, посвящнных терапии и профилактике гепатозов у животных, их доля, затрагивающая вопросы применения антиоксидантов в качестве средств лечения патологий печени чрезвычайно мала. Поэтому, разработка и внедрение новых антиоксидантных препаратов,
обладающих гепатопротекторным действием, продолжает оставаться актуальной.
Цель и задачи исследования. Целью работы явились разработка, фармако-токсикологическая оценка и клинико-терапевтическое обоснование применения нового препарата «Димикар» для профилактики и лечения гепатозов у коров.
Для достижения данной цели поставлены следующие задачи:
-
Разработать новый препарат «Димикар» и изучить его фармако-токсикологические свойства.
-
Провести доклинические испытания препарата «Димикар» на лабораторных животных.
-
Изучить эффективность препарата «Димикар» при его применении для профилактики гепатозов у коров.
-
Изучить влияние препарата «Димикар» на эффективность лечения гепатозов у коров, при включении его в комплексные терапевтические схемы.
Научная новизна. разработан новый препарат «Димикар». Впервые в
ветеринарной практике обоснована возможность его применения в качестве
профилактического средства и в составе комплексной схемы лечения
гепатоза у коров. Получены экспериментальные данные о фармако-
токсикологических свойствах димикара, установлено его гепатопротекторное
и антиоксидантное действие на лабораторных животных и у
высокопродуктивных коров. На основании комплексной оценки применения препарата «Димикар» предложена экономически эффективная схема его применения в молочном скотоводстве.
Теоретическая и практическая значимость работы. В ходе
выполнения диссертационных исследований, полученные данные,
расширяют и дополняют сведения о применении антиоксидантных препаратов, в частности их использования для профилактики и в составе комплексной схемы лечения гепатозов у коров.
Результаты диссертационного исследования апробированы и
используются в практической деятельности ОАО «Урожайное»,
Новоалександровского района, Ставропольского края.
Результаты исследований используются в учебном процессе по курсам дисциплин «Ветеринарная фармакология. Токсикология» и «Внутренние незаразные болезни» в ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный университет», ФГБОУ ВО «Саратовский государственный аграрный университет», ФГБОУ ВО «Оренбургский государственный аграрный университет».
Методология и методы исследования. Диссертационные
исследования выполнены с использованием широкого спектра современных фармакологических, токсикологических, морфологических, клинических, функциональных и лабораторных методов исследования с применением статистического анализа.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
По токсикологическим параметрам препарат «Димикар» относится к малоопасным веществам, имеет слабо выраженную кумуляцию в организме и не оказывает эмбриотоксического, тератогенного и раздражающего действия.
-
В условиях моделирования окислительного стресса и токсического повреждения печени у животных применение димикара оказывает выраженный антиоксидантный и гепатопротекторный эффект.
-
Применение димикара коровам в сухостойный и послеродовой периоды является эффективным способом профилактики и лечения гепатозов.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность, полученных результатов, подтверждается использованием современных методов исследования, сертифицированного оборудования и проведением статистической обработки данных. Результаты исследования опубликованы в рецензируемых изданиях и апробированы на специализированных научных конференциях.
Основные положения диссертационной работы были представлены,
обсуждены и положительно охарактеризованы: на кафедре терапии и
фармакологии ФГБОУ ВО «Ставропольский государственный аграрный
университет» (Ставрополь, 2015-2018); 81, 82, 83-й научно-практической
конференции «Аграрная наука – Северо-Кавказскому федеральному округу»
(г. Ставрополь, 2016-2018); Всероссийской научно-практической
конференции «Инновационные идеи молодых исследователей для
агропромышленного комплекса России» (г. Пенза, 2017); Международной
научно-практической конференции «Инновационные решения в
ветеринарной медицине, зоотехнии и биологии в интересах развития
агропромышленного комплекса» (г. Казань, 2017); Всероссийской научно-
практической конференции «Продовольственная безопасность: от
зависимости к самостоятельности» (г. Орел, 2017); Международной научно-
практической конференции «Аграрная наука – сельскому хозяйству»
(г. Барнаул, 2018); VI Международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы науки и образования в области естественных и
сельскохозяйственных наук» (г. Петропавловск, Казахстан, 2018).
Исследования были представлены и удостоены дипломов I степени на II и III
этапе Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов,
аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений Министерства
сельского хозяйства Российской Федерации (г. Махачкала, 2017;
г. Ставрополь, 2017).
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа является
результатом исследований автора. Организация и проведение
экспериментальной части работы, а также статистическая обработка результатов, их интерпретация выполнены лично соискателем. Доля участия автора при выполнении работы составляет 85%.
Публикация результатов исследования. По материалам
диссертационной работы опубликовано 12 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, входящих в Перечень российских рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученых степеней кандидата и доктора наук. Разработаны и изданы 1 методические рекомендации. Получен 1 патент РФ на изобретение.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 191 страницах
компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы,
собственных исследований, заключения, списка литературы, списка
условных сокращений и обозначений, приложений. Диссертация
Свободнорадикальные процессы в организме животных и их влияние на развитие гепатопатологий
Окислительно-восстановительные реакции играют решающую роль в обмене веществ и энергии в организме и между организмом и внешней средой. Неразрывно с этим связано образование свободных радикалов, которые обладают высокой химической активностью и способны инициировать реакции неферментативного свободнорадикального окисления и модификации биологических субстратов [127, 239].
Свободными радикалами называются нестабильные частицы (атомы, молекулы), имеющие на внешней оболочке неспаренные электроны, отличающиеся высокой реакционной способностью (в норме концентрация свободных радикалов в тканях равна 10-6-10-8 моль/г ткани) [20, 183]. Физиологическая роль свободных радикалов достаточно велика. Большая их часть генерируется в митохондриях и выполняют защитную роль, лизируя патогенные микроорганизмы, мутировавшие клетки. Особую роль они играют при поддержании жизнедеятельности организмов в окружающей среде, в адаптивных реакциях, в обеспечении надежности работы защитных систем организма, то есть в процессах, которые обеспечивают гомеостаз, физиологический статус и взаимоотношения организмов в биоценозах [16, 219].
Свободнорадикальное окисление является универсальным механизмом, который контролирует важнейшие гомеостатические физико-химические параметры клетки: вязкость, проницаемость и целостность клеточной мембраны. С участием свободных радикалов протекает обмен веществ. Радикалы и продукты свободнорадикального окисления влияют на иммунитет, структуру и функцию биологических мембран [14, 32, 51, 179, 180].
Ю. А. Гаврилов и соавт. (2012) считают, что свободнорадикальное окисление определяет до 25 % всех физико-химических процессов и химических реакций в организме [21]. J. D. Dimitrov et al. (2008) отмечают, что наибольшая интенсивность свободнорадикальных процессов проявляется в тех биологических системах, где скорость метаболизма особенно высокая [198].
Перекисное окисление липидов – нормальный метаболический процесс во всех органах и тканях, который играет важную роль в физиолого-биохимическом гомеостазе здоровой клетки, но также выступает как универсальное неспецифическое звено механизма развития различных патологических состояний организма [71, 123]. Известно, что перекисное окисление липидов представляет собой процесс непосредственного переноса кислорода на субстрат с образованием пероксидов, кетонов, альдегидов и других соединений. Реакция эта носит цепной самоиндуцирующий характер и возникает под действием активных форм кислорода [68, 78, 81, 141].
Для оценки состояния процессов перекисного окисления липидов обычно определяют содержание первичных (диеновых конъюгатов), промежуточных (малонового диальдегида) и конечных продуктов (флуоресцирующие основания Шиффа) процесса пероксидации [5, 236].
Продукты перекисного окисления липидов рассматриваются как биодеструктивные факторы, накопление которых в организме инициирует развитие оксидативного (окислительного) стресса, оказывающего влияние на все адаптационные механизмы в живом организме [133]. Под окислительным стрессом понимают состояние тканей с избыточным образованием в них свободных радикалов (активных форм кислорода). Окислительный стресс и воспаление являются неразрывно связанными процессами [81, 241].
Активированные лейкоциты продуцируют, наряду с агрессивными медиаторами воспаления, свободные радикалы кислорода. Если при этом страдает запуск механизмов обратной регуляции процессов воспаления и перекисного окисления липидов, то активация клеток иммунной системы, гиперпродукция провоспалительных медиаторов. В итоге оксидативный стресс приводит к и развитию патологий невоспалительного характера [216]. Продукты перекисного окисления являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью [19]. Повреждающему действию свободных радикалов и переменных соединений противостоит многокомпонентная система антиоксидантной защиты.
Антиоксидантная система удерживает процесс перекисного окисления липидов на стационарном уровне, не препятствующем нормальной жизнедеятельности. Складывающееся тем самым прооксидантно-антиоксидантное равновесие является важнейшим механизмом гомеостаза [17, 96]. Многоэтапность этого процесса позволяет осуществить его регуляцию в клетке на различных этапах, регуляция свободнорадикального окисления осуществляется системами как ферментативной, так и неферментативной природы [6, 152].
В настоящее время антиоксидантом называют вещество, которое, присутствуя в низких по сравнению с окисляемым субстратом концентрациях, существенно задерживает или ингибирует его окисление [81, 147, 212].
Физиологическая система антиоксидантной защиты включает в себя ферменты (каталазу, супероксиддисмутазу, миелопероксидазу, глутатионредуктазу, глутатионпероксидазу, церулоплазмин, ферритин) и биоантиоксиданты прямого (токоферол, аскорбат, биофлавоноиды, ретинол, цистеин, эрготионеин) и непрямого (рибофлавин, никотиновая кислота, метионин, селен, медь, цинк, марганец) действия [191, 222]. Жирорастворимые антиоксиданты (токоферол, -каротин, полифенолы, убихинон) локализованы преимущественно в липидных структурах - мембранах, непосредственно в месте образования свободных радикалов. Внутри клетки, в цитозоле, функционируют водорастворимые антиоксиданты, к которым относят аскорбиновую кислоту, глутатион, эрготионеин, антиперекисные и протеолитическис ферменты, SH-группы белков. Во внеклеточном пространстве находятся различные металлопротеины (церулоплазмин, трансферрин, лактоферрин, гемоглобин), а также мочевая и аскорбиновая кислоты [203].
Следовательно, все клеточные структуры и внеклеточная среда, находятся под контролем физиологической антиоксидантной системы. Эта система включает биоантиоксиданты, ингибирующие переокисление на начальной стадии образования свободных радикалов липидов [144, 215]. По данным И. Ю. Кушнир (2002), И. В. Коневой (2003), Ю. А. Гаврилова (2012), О. В. Бяковой (2012, 2014) установлено, что длительная некомпенсированная активация перекисного окисления липидов и накопление продуктов свободнорадикального окисления в организме приводит к развитию свободнорадикальной патологии, являющейся одним из существенных факторов, снижающих резистентность, предрасполагающих к возникновению значительного числа заболеваний животных и человека [13, 14, 21, 85, 97].
Начальные этапы запуска реакции генерации активных форм кислорода при различных патологических состояниях могут отличаться, но уже на следующих этапах направленность и интенсивность свободнорадикальных процессов теряют свою специфичность и зависят от состояния и степени мобилизации антиоксидантной защиты [142, 216].
По мнению Е. Ю. Горошко и соавт. (2016) свободные радикалы участвуют в развитии более двухсот различных заболеваний, а нарушение энергетического метаболизма сопровождает многие известные патологические состояния. Сейчас все еще сложно сказать, что первично: патология или окислительный стресс, однако это два неразрывно связанных понятия [81].
Р. А. Цыганский (2003) и Н. В. Трегубова (2016) установили, что у животных с клиническими признаками нарушения обмена веществ наблюдается усиление пероксидного окисления липидов (в среднем на 60 %) и снижение емкости антиоксидантной системы (в среднем на 15 %) [153, 162].
Печень является высокоаэробной, кислородзависимой тканью, что обуславливает высокую чувствительность гепатоцитов к повреждающему действию различных токсикантов [174, 186, 204, 221, 230].
Почти при всех интоксикациях первично повреждаются клетки печени, а нарушение функционирования данного органа сопровождается поражением других органов продуктами метаболизма. Действие многих токсических соединений направлено на белковые компоненты клеточной мембраны. Изменения в активности мембранных ферментов, каналов и рецепторных белков, вызванные неблагоприятными факторами, усиливает активность свободнорадикального окисления липидов [17].
Изучение параметров острой токсичности препарата «Димикар»
Определение острой токсичности разработанной лекарственной формы препарата «Димикар» проводили путем первичной токсиметрической оценки с изучение симптомокомплекса отравления при ее однократном поступлении в организм.
Для определения макимально переносимой дозы димикара использовали клинически здоровых лабораторных животных: 144 белых мышей (самцы и самки, масса тела 18-22 г, возраст 2,0-2,5 месяца) и 96 белых крыс (самцы и самки, масса тела 170-210 г, возраст 3,0-3,5 месяца) предварительно прошедшие 14-дневный карантин. Все животные были разделены на опытные и контрольные группы по восемь особей в каждой с учетом принципа аналогов.
Отправным моментом для поиска доз послужили известные литературные данные по острой токсичности компонентов препарата [116, 119, 120].
За состоянием здоровья животных наблюдали 14 дней после введения препарата, при этом в первый день мыши и крысы находились под непрерывным наблюдением. Учитывали общее состояние и поведение экспериментальных животных, реакцию на воздействие внешних раздражителей, отношение к воде и пище, характер и время возникновения интоксикации, ее клиническую выраженность и характер обратимости.
Определение острой токсичности препарата на белых мышах
Белые мыши из группы № 1 являлись контрольными животными, им вводили 0,5 мл воды для инъекций. В группе № 2 стартовая доза составила 1000 мг/кг живой массы (по действующему веществу). Мышам из групп № 3-7 препарат вводили в дозах 1100, 1200, 1300, 1400, 1500 мг/кг по действующему веществу, с интервалом дозы 100 мг. Введение препарата осуществлялось однократно внутрижелудочно, посредством обрезанной и отшлифованной с напоем инъекционной иглы. Объем вводимой жидкости не превышал 0,5 мл на мышь, что является максимально допустимой для данного вида лабораторного животного при указанном пути введения. При введении препарата животных фиксировали в вертикальном положении с незначительно запрокинутой головой. Корм мышам давали спустя два часа после введения препарата.
В группах № 2–3 видимых внешних клинических изменений не отмечено, но после введения препарата наблюдалось кратковременное возбуждение, через 1,5±0,5 часов состояние животных нормализовалось. Белые мыши из группы № 4 через 20-30 минут после введения препарата испытывали угнетение, вялость, частичный отказ от воды и корма, но через 2±0,5 часа проявление данных симптомов прекратилось. В группе № 5, при введении препарата в дозе 1300 мг/кг массы тела, у шести животных наблюдалась вялость, угнетение, частичный отказ от корма и воды, через 4±1,0 часа их состояние стабилизировалось. При наблюдении за белыми мышами из группы № 6 отмечали такие же клинические признаки, что и у лабораторных животных из группы № 5, но изменения регистрировали у всех мышей. У животных группы № 7 после введения препарата в дозе 1500 мг/кг массы тела наблюдали кратковременные периоды возбуждения, сменяющиеся периодами угнетения, светобоязнью, отказ от корма и воды. По истечении 6,5±1,0 часов состояние животных в данной группе стабилизировалось.
После регистрации ряда клинических изменений в группе № 7 было принято решение уменьшить интервал дозы до 20 мг/кг массы тела по действующему веществу. Данное изменение было необходимо для более точного определения максимально переносимой дозы лабораторных животных. Следовательно, мышам из групп № 8-12 ввели препарат в дозах 1520, 1540, 1560, 1580 и 1600 мг/кг массы тела по действующему веществу.
В группах № 8-9 все мыши испытывали глубокое угнетение, сменяющееся периодами возбуждения, при попадании яркого света интенсивно перемещались по клетке и сбивались в кучу. При испытании дозы в объеме 1560 мг/кг у животных группы № 10 отмечали те же признаки, что и у мышей из групп № 8-9, но в более выраженной форме, дополнительно отмечен полный отказ от воды и корма. Животные из группы № 11 после введения препарата в дозе 1580 мг/кг по действующему веществу были малоподвижны, испытывали глубокое угнетение, вялость, полностью отказывались от воды и корма, но при этом гибели мышей не отмечено. При испытании дозы 1600 мг/кг по действующему веществу у животных из группы № 12 отмечали те же клинические изменения, что и у мышей из группы № 11. Через 1,5±1,0 часа после введения препарата в данной группе пало 2 лабораторных животных.
На седьмой день наблюдений в каждой испытуемой группе у восьми животных провели декапитацию под эфирным наркозом для последующего взятия крови и проведения гематологического исследования (таблица 1).
При анализе гематологических показателей установлено, что уровень гемоглобина по мере увеличения дозы препарата в соответствующих группах постепенно снижался. Уменьшение уровня гемоглобина в группах № 2-12 составило от 3,22 % до 23,01 %, в сравнении с контрольной группой. Изменения содержания гемоглобина в крови животных из групп № 10-12 достигли достоверных различий, которые составили 19,22 %, 22,12 % и 23,01 % в сравнении с показателями крови животных из группы № 1, соответственно.
Аналогичные изменения наблюдались относительно количества эритроцитов в крови. Минимальные количества по данному показателю наблюдались в группах № 11-12, значения данного показателя были ниже на 20,94 % и 25,29 %, в сравнении с контрольной группой.
С возрастанием дозы препарата происходило постепенное увеличение количества лейкоцитов в крови животных. В группах № 8-11 значения данного показателя были выше, чем в группе № 1 на 16,07 %, 17,6 %, 19,45 % и 22,4 %, соответственно. Количество лейкоцитов в крови белых мышей из группы № 12 было больше, чем у животных из контрольной группы на 26,99 %, достигнув достоверных различий.
Количество тромбоцитов в крови белых мышей в группах № 2-12 возросло от 2,11 % до 26,95 %. В группах № 10-12 изменения достигли достоверных различий, в сравнении с группой № 1, где показатели были выше на 23,05 %, 24,88 % и 26,95 %, соответственно.
При анализе данных лейкограммы, количество базофилов в группах № 11-12 достигли статистически достоверных различий, в сравнении с группой № 1, где значения по данному показателю были ниже на 21,6 % и 23,2 %. С увеличением вводимой дозы препарата количество эозинофилов в каждой последующей группе снижалось, а в группах № 10-12 количество эозинофилов достигли статистически достоверных различий, в сравнении с контрольной группой, где разница между группами составила 33,54 %, 37,2 % и 42,07 %.
Количество сегментоядерных нейтрофилов в каждой последующей группе с увеличенной дозой препарата постепенно уменьшалось. В группах № 8-12 значения по данному показателю были ниже, чем в группе № 1 на 14,08 %, 15,14 %, 16,2 %, 17,61 % и 17,25 %. Количество палочкоядерных нейтрофилов – наоборот, с возрастанием вводимой дозы препарата увеличивалось. В группах № 8-12 количество палочкоядерных нейтрофилов было выше на 8,63 %, 9,01 %, 9,39 %, 9,96 % и 10,48 %, чем в контрольной группе, соответственно.
Количество лимфоцитов в группах № 2-12 было больше относительно группы № 1, разница составила от 0,91 % до 7,1 %. Максимальные различия зафиксированы между контрольной группой и группами № 10-12, что составило 6,27 %, 6,62 % и 7,1 %. Количество моноцитов в группах № 7-12 имели наивысшее показатели, относительно контрольной группы разница составила 2,21 % и 2,58 %.
При испытании дозы равной 1580 мг/кг на белых мышах из группы № 11 были обнаружены значительные признаки интоксикации, подтверждающиеся изменением клинического состояния лабораторных животных и результатами гематологического исследования. Поэтому данная доза была принята в качестве максимально переносимой и стартовой для проведения опыта по определению летальных доз препарата «Димикар» (таблица 2).
Оценка действия препарата «Димикар» при экспериментальном моделировании окислительного стресса у кроликов
Экспериментальное моделирование окислительного стресса проводили для изучения возможности его фармакологической коррекции с использованием препарата «Димикар». Для постановки эксперимента использовали 30 кроликов в возрасте 7-9 месяцев, которых разделяли с учетом принципа аналогов на три группы по десять животных в каждой. Животные из первой группы служили контролем. У кроликов из второй группы проводили моделирование окислительного стресса, путем перорального введения раствора сульфата железа (II) в дозе 0,5 мл на 1 кг массы тела, из расчета 0,04 мг на 1 мл воды для инъекций, один раз в сутки, на протяжении семи дней. Применение сульфата железа (II) связано с тем, что он реагирует с целым рядом органических соединений в клетке животного, сдвигая его редокс-статус в прооксидантную сторону, т.е. в ряде биохимических реакций (Хабера-Вайса, Фентона, Осипова) ускоряет катализ образования активных форм кислорода и свободных радикалов [198]. Животных третьей группе подвергли аналогичной схеме воздействия сульфатом железа (II), но, начиная со второго дня исследований, стали вводить препарат «Димикар», внутримышечно, из расчета 3,4 мг/кг массы тела по действующему веществу, для активизации системы антиоксидантной защиты организма.
У всех животных провели взятие крови из ушной вены до введения сульфата железа (II), через одни, трое, пять и семь суток после введения препарата «Димикар» для последующего биохимического анализа. В крови определяли основные показатели системы антиоксидантной защиты: активность каталазы, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, глутатион восстановленный, а также продукты перекисного окисления липидов – диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид, основания Шиффа. Произвели контрольное взвешивание кроликов на момент начала исследований, через трое суток и по их завершению. Полученные результаты исследования крови свидетельствуют об изменении активности основных ферментов системы антиоксидантной защиты организма у кроликов (таблица 16). Активность каталазы в первой группе постепенно увеличивалась, но незначительно – от 0,81 % до 1,58 %, а в группах, где производили моделирование окислительного стресса – наоборот, уменьшалась. Во второй группе активность фермента снижалась от 4,08 % до 7,79 %, а третьей – от 0,77 % до 6,84 %. Если рассматривать динамику активности каталазы за весь период эксперимента, то можно отметить, что в контрольной группе она увеличилась на 5,34 %, во второй группе – уменьшилась на 22,82 %, а в третьей – на 9,12 %, соответственно.
Динамика активности супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы была менее показательной. В контрольной группе активность ферментов за весь период опыта значительно не изменилась, во второй группе – уменьшилась на 11,04 % и 10,19 %, а в третьей – на 2,47 % и 2,27 %, соответственно.
Восстановленный глутатион через одни сутки после введения димикара уменьшился во всех группах, в первой – на 2,86 %, во второй – на 10,81 %, а в третьей – на 7,89 %, соответственно. Данный показатель максимально уменьшился во второй группе через 5 суток после введения сульфата железа (II) и достиг статистически достоверных различий, в сравнении с контрольной группой. За весь период эксперимента уровень глутатиона во второй группе уменьшился на 29,73 %, а в третьей группе – на 13,16 %, соответственно.
Концентрация продуктов перекисного окисления в крови у кроликов постепенно увеличивалась во всех группах. Содержание диеновых конъюгатов в крови животных из первой группы за весь период эксперимента увеличилось на 3,23 %, во второй группе – на 40,0 %, а в третьей – на 15,63 %, соответственно (рисунок 15). Концентрация малонового диальдегида увеличилась в первой группе на 1,21 %, во второй – на 21,47 %, а в третьей – на 9,76 % (рисунок 16).
Концентрация оснований Шиффа через пять суток после введения димикара в первой группе увеличилась на 4,0 %, во второй группе – на 25,93 %, а в третьей – на 15,38 % и достигла достоверных различий (рисунок 17). В сравнении с контрольной группой. Если рассматривать динамику значений по данному показателю, то можно сказать, что в контрольной группе концентрация флуоресцирующих оснований Шиффа практически не изменялась и находилась в равных пределах, а во второй и третьей группах она увеличилась на 29,63 % и 11,54 %, соответственно.
В первой группе масса тела животных постепенно увеличивалась, а во второй и третьей группах происходило ее снижение, при этом максимальное уменьшение обнаружено при взвешивании, проведенном через три дня после введения препарата «Димикар» (таблица 17). Во второй группе масса тела через трое суток после введения препарата «Димикар» снизилась на 4,1 %, а в третьей – на 2,9 %, соответственно. Если рассматривать динамику массы тела за весь период опыта, то положительной она была только в первой группе, где увеличение составило 1,6 %, во второй группе масса тела уменьшилась на 5,3 %, а в третьей – на 3,2 %, соответственно.
В результате проведенных исследований установлено, что введение сульфата железа (II) у кроликов повлекло за собой изменение антиоксидантного статуса организма, выражающееся в снижении активности основных ферментов системы антиоксидантной защиты и увеличении концентрации продуктов перекисного окисления липидов. Применение препарата «Димикар» кроликам в дозе 3,4 мг/кг по действующему веществу способствует снижению уровня свободных радикалов и нормализации антиоксидантных показателей в крови.
Таким образом, установлено, что применение препарата «Димикар» кроликам в условиях экспериментального моделирования окислительного стресса сопровождается выраженным антиоксидантным эффектом, исходя из чего может быть рекомендован для клинического испытания на продуктивных животных в качестве антиоксидантного препарата.
Влияние препарата «Димикар» на эффективность комплексной схемы лечения гепатозов у коров
Объектом исследований явились коровы черно-пестрой породы, в возрасте 4-6 лет, массой тела 400-500 кг. Эксперименты проводились в послеродовой период у животных с клиническими признаками гепатоза. Постановку диагноза на гепатоз производили на основании данных, полученных при пальпации, перкуссии и ультразвуковой диагностике печени. Из группы отелившихся коров было выявлено 30 животных, больных гепатозом, которых с учетом принципа аналогов разделили на три группы по десять голов в каждой. Коровы первой группы служили контролем, им применяли принятую в хозяйстве схему лечения, включающая введение препарата «Катозал», внутримышечно, в дозе 5 мл на 100 кг массы тела, в сочетании с применением препарата «Кальфосет», внутривенно, в дозе 12,5 мл на 100 кг живого веса, один раз в сутки, в течение пяти дней, сразу после отела. Животным из второй группы применяли препарат «Гепатоджект», внутривенно, в дозе 25 мл на 100 кг живого веса, в течение пяти дней, сразу после родов. Животным из третьей группы комплексно вводили препараты «Димикар» и «Гепатоджект». Димикар вводили внутримышечно, в дозе 1 мл на 100 кг массы тела, в течение пяти дней, начиная с первого дня послеродового периода, гепатоджект применяли по аналогичной схеме, как и у животных из второй группы. Отбор крови у коров осуществляли сразу после родов (до лечения), через 7, 14 и 21 сутки после родов. Кровь от животных получали при помощи вакуумных систем «S-Monovette» с активатором свертываемости («Sarstedt», Германия), в утреннее время до кормления.
У всех животных проводили перкуссию печени до и после лечения гепатоза с целью определения ее границ по обнаружению областей притупления с использованием плессиметра и перкуссионного молоточка по технике «стокатто», а также выполняли ультразвуковое исследование печени с использованием портативного ультразвукового сканера DRAMINSKI 4VET mini («DRAMINSKI», Польша).
Для определения влияния препаратов проводили лабораторное исследование крови, при этом определяли биохимические показатели крови: количества общего белка и соотношение его фракций, количество глюкозы, холестерина, кетоновых тел и общего билирубина, содержание ферментов в крови аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, щелочной фосфатазы и гамма-глутамилтрансферазы, а также определение показателей системы антиоксидантной защиты организма (активность глутатионпероксидазы, уровень восстановленного глутатиона и концентрацию малонового диальдегида).
Анализ результатов перкуссии печени у коров свидетельствует о том, что размеры зоны притупления данного органа достоверно снизились у животных из второй и третьей групп (таблица 23). В контрольной группе границы печени снизились на 11,58 %, в группе, где применяли препарат «Гепатоджект» - на 27,46 %, а в группе, где вводили и димикар, и гепатоджект уменьшение составило 35,29%. Если сравнивать результаты диагностики после проведенного лечения, можно отметить, что в третьей группе границы печени были меньше, чем в первой и второй группах на 27,98 % и 13,57 %, соответственно.
Результаты ультразвуковой диагностики печени коров после родов свидетельствуют о гепатомегалии. Контур печени неровный, нечеткий, плохо отграничивается от окружающих тканей. Наблюдалась выраженная очаговая неоднородность: наличие очагов пониженной эхогенности и участков повышенной эхогенности без четких контуров. При анализе эхограммы также установили изменение сосудистого рисунка: с разной частотой наблюдались утолщение стенок внутрипеченочных ветвей портальной вены, ослабление архитектоники по переферии. Отмечены очаги повышенной эхогенности от 15 x 20 мм до 42 x 30 мм, которые хорошо визуализировались. Данные очаги являлись признаками жировой инфильтрации печени. У животных с тяжелой степенью жировой дистрофии печени наблюдали картину «светлой печени» при ультразвуковом исследовании.
В результате проведенных биохимических исследований установили, что применение препаратов способствовало положительной динамике показателей белкового обмена в крови коров (таблица 24). Через семь суток после родов количество общего белка в крови животных из первой группы увеличилось на 7,69 %, во второй группе – на 16,93 %, а в третьей – на 23,26 %, соответственно (рисунок 39). Через 14 суток после родов происходило дальнейшее увеличение содержания общего белка в крови животных из всех групп, но возрастание было менее значительное: в первой группе – на 1,9 %, а во второй и третьей группах – на 3,08 % и 5,1 %. К концу эксперимента количество данного показателя обмена веществ снизилось во всех группах от 0,38 % до 1,8 %.
Динамика содержания альбуминов в крови характеризовалась увеличением их уровня во всех группах. У коров из первой группы через 14 суток после родов произошло возрастание количества альбуминов в крови на 10,55 %. У животных из второй группы, которым применяли только «Гепатоджект», содержание данного показателя в крови увеличилось на 21,15 %. В крови коров из третьей группы, которым комплексно вводили «Димикар» и «Гепатоджект», уровень альбуминов возрос на 29,6 % и достиг статистически достоверных различий, в сравнении с контрольной группой. К окончанию послеродового периода содержание альбуминов в крови животных снизилось во всех группах: в первой – на 3,31 %, во второй – на 1,77 %, а в третьей группе – на 1,18 %, соответственно.
Применение препаратов благоприятно отразилось на динамике -, - и глобулинов, тем самым способствуя поддержанию белкового постоянства в организме. За весь период эксперимента концентрация -глобулинов в крови коров из первой группы практически не изменилась, а у животных из второй и третьей групп увеличилась на 9,86 % и 18,25 %. Содержание -глобулинов от начала к завершению опыта снизилась во всех группах: в первой – на 18,63 %, во второй – на 29,91 %, а в третьей группе – на 35,89 %, соответственно.
Динамика -глобулинов также характеризовалась уменьшением их концентрации в крови животных. В контрольной группе за весь период эксперимента содержание -глобулинов снизилось на 2,02 %, в группе, где применяли «Гепатоджект», – на 8,49 %, а в группе, где комплексно использовали «Димикар» и «Гепатоджект» данный вид глобулинов уменьшился на 14,86 %.
Концентрация холестерина в крови коров сразу после родов находилась на уровне верхних границ референтных значений, после проведенного лечения, уровень данного показателя липидного обмена снизился. Через семь суток после родов содержание холестерина в крови коров из первой группы уменьшилось на 11,51 %, из второй группы – на 16,84 %, а из третьей – на 21,51 %, соответственно. Такую динамику холестерина можно объяснить тем, что на момент начала опыта в крови животных были нарушены процессы жирового обмена, произошло усиленное производство липидов, в частности общего холестерина. Через 14 суток после родов концентрация холестерина в третьей группе достигла достоверных различий в сравнении с контрольной группой и составила 3,53 ммоль/л, что на 13,69 % и 6,12 % меньше, чем в первой и второй группах.
Через семь суток после лечения уровень глюкозы в крови коров из контрольной группы был ниже, чем во второй и третьей группах на 12,5 % и 20,0 %, соответственно. Применение препаратов способствовало восполнению баланса углеводного обмена и возрастанию концентрации глюкозы в крови животных. Через 14 и 21 сутки после родов, произошло постепенное снижение данного показателя во всех группах: в первой – на 2,23 % и 2,74 %, во второй группе – на 5,08 % и 1,23 %, а в третьей группе концентрация глюкозы уменьшилась на 5,36 % и 4,91 %, соответственно. Снижение содержания глюкозы в крови животных мы связываем ее с расходом при процессах молокообразования. К концу опыта концентрация глюкозы в крови коров из третьей группы была выше, чем у животных из второй и третьей групп на 18,31 % и 5 %, соответственно.
Концентрация кетоновых тел в крови животных из первой группы через 14 суток после отела снизилась на 27,18 % (рисунок 40). За аналогичный период содержание кетоновых тел в крови коров из второй и третьей групп уменьшилось на 47,78 % и 56,73 %, соответственно. К концу эксперимента значения по данному показателю увеличились во всех группах от 4,93 % до 8,49 %. Минимальная концентрация кетоновых тел в завершении послеродового периода была в третьей группе и составила 0,97 ммоль/л, что на 30,22 % и 11,82 % меньше, чем в первой и второй группах, соответственно.