Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Биологическая роль и особенности метаболизма железа 15
1.2. Биологическая роль и особенности метаболизма йода 19
1.3. Биологическая роль и особенности метаболизма меди 22
1.4. Биологическая роль и особенности метаболизма селена 26
1.5. Биологическая роль и особенности метаболизма кобальта 29
1.6. Железодефицитная анемия животных 33
1.7. Реакции свободно-радикального окисления в условиях гипоксии 37
1.8. Разработка и применение препаратов железа и принципы терапии железодефицитной анемии 39
1.9. Патофизиологическое обоснование применения антиоксидантов в комплексной терапии железодефицитных состояний
2. Материалы и методы исследований 49
3. Собственные исследования
3.1. Современное состояние фармацевтического рынка железосодержащих лекарственных средств для ветеринарного применения в РФ 63
3.2. Скрининг соединений железа представленных на фармацевтическом рынке 65
3.2.1. Острая токсичность соединений железа 66
3.2.1.1. Острая токсичность соединений железа для энтерального приме нения 69
3.2.1.2. Острая токсичность соединений железа для парентерального применения 79
3.2.2. Хроническая токсичность соединений железа 83
3.2.2.1. Хроническая токсичность соединений железа для энтерального применения 83
3.2.2.2. Хроническая токсичность соединений железа для парентерального применения
3.3. Выбор наиболее безопасных соединений железа и разработка комплексных лекарственных препаратов 91
3.4. Изучение стабильности препаратов в процессе хранения 94
3.5. Токсикологическая характеристика препаратов 98
3.5.1. Острая токсичность 98
3.5.2. Хроническая токсичность препаратов 108
3.5.3. Токсичность препаратов при нанесении на кожу 123
3.5.4. Кожно-резорбтивные свойства препаратов 124
3.5.5. Токсичность препаратов при нанесении на слизистые оболочки 125
3.5.6. Аллергенные свойства препаратов 126
3.5.7. Эмбриотоксичность и тератогенные свойства препаратов 127
3.5.8. Влияние препаратов на постнатальное развитие потомства 133
3.6. Фармакологические свойства препаратов
3.6.1. Влияние препаратов на систему ПОЛ – АОЗ лабораторных животных 135
3.6.2. Влияние препаратов на уровень тиреоидных гормонов и морфологию щитовидной железы лабораторных животных 139
3.6.3. Терапевтическое действие препаратов при экспериментальном гипотиреозе
3.6.4. Терапевтическое действие препаратов при экспериментальной постгеморрагической анемии 153
3.6.5. Профилактическая эффективность при железодефицитной анемии поросят 1 3.6.6. Профилактическая эффективность при железодефицитной анемии телят 181
3.6.7. Профилактическая эффективность при железодефицитной анемии ягнят 192
3.6.8. Терапевтическая эффективность при железодефицитной анемии поросят 201
3.6.9. Эффективность при гипотрофии поросят
3.6.10. Эффективность применения у супоросных и лактирующих свиноматок 215
3.6.11. Влияние на поросят-сосунов, полученных от подопытных свиноматок 221
3.6.12. Профилактическая эффективность при эндемическом зобе телят 227
3.6.13. Профилактическая эффективность при эндемическом зобе ягнят 230
3.6.14. Профилактическая эффективность в условиях хронического инкорпорированного облучения 233
3.6.15. Влияния препаратов на развитие акушерско-гинекологической патологии коров и полученных от них телят 240
3.6.16. Эффективность применения препаратов в кролиководстве 245
3.7. Ветеринарно-санитарная экспертиза животноводческой продукции 253
3.7.1. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса кроликов 253
3.7.1.1. Послеубойный ветеринарно-санитарный осмотр туш и органов 253
3.7.1.2. Токсичность и безопасность мяса 254
3.7.1.3. Органолептические показатели и общая биологическая ценность мяса 255
3.7.2. Ветеринарно-санитарная экспертиза мяса поросят 256
3.7.2.1. Послеубойный ветеринарно-санитарный осмотр туш и органов 256
3.7.2.2. Токсичность и безопасность мяса 257
3.7.2.3. Органолептические показатели и общая биологическая ценность мяса 258
3.8. Экономическая эффективность
4. Заключение 260
5. Выводы 276
6. Практические предложения 281
7. Список литературы
- Железодефицитная анемия животных
- Скрининг соединений железа представленных на фармацевтическом рынке
- Терапевтическое действие препаратов при экспериментальной постгеморрагической анемии
- Органолептические показатели и общая биологическая ценность мяса
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Существенным фактором, сдерживающим рост и развитие животноводства, являются дисбаланс обмена микроэлементов (В.Т. Самохин, 1986; С.С. Абрамов, 2004; В.А. Антипов, А.Н. Трошин и др., 2005, 2012).
Микроэлементозы (железодефицитная анемия, эндемический зоб, ги-покобальтоз, гипокупроз, и другие болезни), занимают значительную долю среди всей незаразной патологии и наносят животноводству значительный экономический ущерб. (А.И. Карелин, 1975,1983; С.М. Сулейманов, 1996; B.C. Бузлама, С.В. Шабунин 1997; В.И. Дорожкин и др., 2005, 2012).
Для борьбы с микроэлементозами используют лекарственные средства, включающих макро и микроэлементы, а разработка данных препаратов является одним из приоритетных направлений ветеринарной фармакологии, которое направленно на повышение сохранности и продуктивности животных (М.И. Рецкий, 1978; М.И. Рабинович, 1997; Г.М. Бажов, А.И. Бараников, 2009; И.Д. Александров, 2013).
В настоящее время для лечения и профилактики железодефицитной анемии применяют препараты железа для энтерального и парентерального введения (Н.З. Хазипов, 1992, 2000; И.М. Карпуть, 2003; А.С. Гасанов, К.Х. Папуниди, 2006).
Однако, неблагоприятным моментом является не только недостаток железа, но и его избыток, поскольку, являясь металлом с переменной валентностью, железо обладает прооксидантным действием, т.е. в ряде биохимических реакций (Фентона, Хабера—Вайса, Осипова) приводит к образованию активных форм кислорода и оказывает токсическое действие на функции печени, сердечно-сосудистой системы, нарушает гормональный статус, вызывает дисфункцию иммунной системы (А.И. Журавлев, 1987; И.П. Ништ, 1999; Ю.А. Владимиров, 2000; E. Kurtoglu, 2003; C.S. Lim, 2004).
В тоже время активация процессов свободно-радикального окисления и снижения антиоксидантной защиты организма происходит при многих болезнях, включая железодефицитную анемию и другие микроэлементозы, что и объясняет противопоказание применения препаратов железа при гиповитаминозе E (М.И. Рецкий, и др. 1978)
При гипоксии и ишемии в первую очередь усиливается образование малоактивного супероксидного анион-радикала, являющегося слабым окислителем и не способным непосредственно инициировать реакции перекисно-го окисления липидов. В связи с этим очевидна важная роль в индукции процессов липопероксидации более агрессивных гидроксильного и гидроперок-сильного радикалов, образование которых резко усиливается при участии ионов металлов с переменной валентностью, в том числе железа, препараты которого используют для профилактики и лечении железодефицитной анемии.
Восполнение дефицита железа не только активирует свободноради-кальное окисление но и инициирует печеночную экспрессию гепсидина,
который в свою очередь препятствует усвоению железа, то есть чем больше вводить в организм железа, тем хуже оно усваивается (Р.Р. Starzyski, CMM Laarakkers, H. Tjalsma, DW Swinkels, М. Pieszka, и др. 2011).
Таким образом, в современных условиях при профилактике и лечении железодефицитной анемии возникает необходимость коррекции изменений свободнорадикальных процессов обусловленных как проводимой ферротера-пией с одной стороны, явлениями гипоксии с другой стороны при одновременном стимулировании усвоения железа не активирующем экспрессию геп-сидина.
Этот момент особенно важен при разработке и применении современных лекарственных препаратов для лечения и профилактики железодефицит-ной анемии, потому что именно препараты железа являются основой успешного лечения железодефицитной анемии.
В связи с тем, что важное значение в патогенезе анемии имеет не столько усиление образования активных форм кислорода, сколько ослабление антиоксидантной защиты организма, следует особое внимание уделить новым комплексным препаратам, содержащим не только железо, но и такие важные микроэлементы, участвующие в обмене железа, кроветворении и системе антиоксидантной защиты организма, как селен, йод, медь и кобальт.
Таким образом, проблема ферротерапии требует дальнейшего изучения, разработки и исследования фармакологических свойств и показаний к применению современных комплексных препаратов железа.
Степень разработанности темы исследования.
Теоретической и методологической базой для разработки и исследования железосодержащих препаратов послужили труды: А.И. Карелина (1983), В.В. Ермакова, В.В. Ковальского (1985), В.Т. Самохина (1992), В.И. Дорож-кина (1998), А.С. Гасанова (2006), А.Н. Трошина (2013) и других ученых.
В.А. Оробец, А.А. Сазонов, С.В. Новикова (2013) изучили препарат Ферран с позиции антианемического действия на поросятах.
Препарат Ферранимал-75 изучал Д.Ю. Макаров (2012) с позиции влияния на рост и среднесуточные приросты поросят. С.Н. Варнавский (2013) изучил комплексные препараты содержащие железо, селен и йод, с позиции профилактики железа и йододефицита. А.А. Антипов (2012) установил морфологические изменения при использовании монопрепаратов железа на примере Ферроглюкина-75.
Однако, многие фармакологические эффекты комплексных препаратов при энтеральном и парентеральном путях введения, в условиях нормы и патологии изучены не полностью.
Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований является разработка новых комплексных препаратов железа, изучение их фармако-токсикологических свойств и лечебно-профилактической эффективности при некоторых заболеваниях животных.
В соответствии с поставленной целью определены задачи:
-
на основании анализа современного состояния фармацевтического рынка железосодержащих лекарственных средств и сравнительных скри-нинговых токсикологических исследований выбрать наиболее перспективные соединения и, на их основе, разработать новые комплексные железосодержащие препараты для орального и парентерального применения
-
изучить токсические свойства новых препаратов (острая, хроническая, эмбрио- и фетотоксичность, токсичность при нанесении на кожу и слизистые оболочки, кожно-резорбтивное, аллергическое действие, влияние на постнатальное развитие животных)
-
изучить фармакологические свойства разработанных препаратов на лабораторных животных (влияние на систему перекисного окисления ли-пидов – антиоксидантная защита (ПОЛ-АОЗ), уровень тиреоидных гормонов и морфологию щитовидной железы, эффективность при экспериментальном гипотиреозе и при экспериментальной постгеморрагической анемии)
-
оценить возможность применения препаратов в свиноводстве, скотоводстве, овцеводстве и кролиководстве с целью профилактики и терапии некоторых незаразных заболеваний животных
-
изучить особенности применения препаратов в условиях хронического инкорпорированного облучения
-
провести ветеринарно-санитарную оценку качества продукции, полученной от сельскохозяйственных животных после использования разработанных препаратов
-
оценить экономическую эффективность ветеринарных мероприятий с использованием разработанных фармакологический средств
-
разработать проекты нормативной документации для осуществления процедуры Государственной регистрации препаратов.
Научная новизна. Впервые созданы новые комплексные железосодержащие лекарственные препараты на основе железо-декстранового комплекса для инъекций (седимин-Se+, седимин-Fe+, ферранимал-75М, ферра-нимал-100М) и железо-гидроксид полимальтозного комплекса для орального применения (био-железо с микроэлементами).
Впервые разработана и апробирована рецептура комплексных железосодержащих препаратов, определены показания к применению и разработаны способы орального и инъекционного применения препаратов с профилактической и терапевтической целями.
Изучено фармакологическое действие комплексных железосодержащих препаратов на физиологические системы лабораторных и сельскохозяйственных животных в норме и в условиях патологии.
Научная новизна подтверждена четырьмя патентами на изобретения: № 2535086 «Способ коррекции окислительного стресса при профилактике и лечении железодефицитной анемии телят в условиях хронического инкорпорированного облучения», № 2555773 «Способ качественной и количественной морфологической диагностики наличия патологического влияния желе-зодекстрана на состояние печени поросят», №2576779 «Способ профилакти-
ки и лечения железодефицитных состояний поросят и телят при гиповитаминозе Е», №2586275 «Способ определения эффективности гемопоэтических железосодержащих препаратов по морфологии печени при лечении острой постгеморрагической анемии».
Теоретическая и практическая значимость работы.
Для применения в ветеринарной медицине и животноводстве предложены новые железосодержащие препараты: седимин-Se+, седимин-Fe+, фер-ранимал-75М, ферранимал-100М и био-железо с микроэлементами.
Проведенные исследования имеют большое теоретическое и практическое значение в области ветеринарной фармакологии. Созданные комплексные лекарственные препараты имеют значительное преимущество в сравнении с ранее применяющимися аналогами, за счет более низкой токсичности и более высокой степени усвоения.
Выявлено, что лекарственные препараты оказывают корректирующее действие на кроветворение, уровень антиокислительной активности и сво-боднорадикального окисления, морфофункциональное состояние щитовидной железы, способствуют выздоровлению и повышению продуктивности животных, не оказывая негативного влияния на качество продукции животноводства, в том числе в условиях хронического инкорпорированного облучения.
На основании результатов исследований разработаны и утверждены:
- технические условия на препараты седимин-Fe+ (ТУ 9337-008-
17628719-15), седимин-Se+ (ТУ 9337-007-17628719-15), ферранимал-75М (ТУ
9337-003-17628719-15), ферранимал-100М (ТУ 9337-004-17628719-15), био
железо с микроэлементами (ТУ 9296-002-17628719-2014).
- инструкции по применению на препараты седимин-Fe+ (инструкция от
18 мая 2015 г.), седимин-Se+ (инструкция от 18 мая 2015 г.), ферранимал-75М
(инструкция от 18 мая 2015 г.), ферранимал-100М (инструкция от 18 мая 2015
г.), био-железо с микроэлементами (инструкция от 25 апреля 2014 г.).
Результаты исследований можно использовать в научных и учебных целях, при разработке лекарственных препаратов, составлении учебных пособий, чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий.
На основании результатов собственных исследований, и анализа литературных данных, в соавторстве изданы методические рекомендации и монография:
-методические рекомендации «Ветеринарно-санитарная оценка качества мяса кроликов при применении препарата био-железо с микроэлементами» утверждены РАСХН, от 22 октября 2013 г.
-Биологическая роль железа. Применение железосодержащих препаратов в ветеринарной медицине (монография) / Д.Н. Уразаев, А.А. Дельцов, Л.П. Парасюк, Р.Д. Уразаева// М.: «Колос», 2010. –104 с.
Методология и методы исследования. Методологическим подходом в достижении цели и решении поставленных задач явилось системное изучение объектов исследования, анализ и обобщение полученных результатов.
Предметом исследования являются фармакологические эффекты комплексных железосодержащих препаратов используемых с профилактической и терапевтическими целями на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Методология исследования в процессе выполнения диссертационной работы включает следующие методы: клинические, этологические, биохимические, гематологические, копрологические, патологоанатомические, гистологические, морфометрические, дозиметрический контроль, спектрометрический анализ, иммуноферментный анализ, ветеринарно-санитарная экспертиза, экспериментальное моделирование с использованием лабораторных животных, статистические методы обработки данных.
Положения, выносимые на защиту:
результаты разработки новых комплексных препаратов железа
результаты изучения токсичности и фармакологических свойств разработанных препаратов;
результаты ветеринарно-санитарной экспертизы продукции животноводства
экономическая эффективность мероприятий с использованием разработанных препаратов
результаты практического внедрения разработанных препаратов
Степень достоверности и апробация результатов работы.
Статистическая обработка экспериментальных данных проведена на персональном компьютере с использованием программы Microsoft Excel и Statistica 5.0, и включала в себя расчеты средних арифметических значений, коэффициента вариации и достоверности различия сравниваемых показателей с использованием критерия Стъюдента.
Результаты экспериментальных и клинических исследований были представлены и обсуждены на: Международной научной конференции «Лекарственные препараты для животных (разработка, производство, эффективность и качество) посвященная 80-летию организации ВГНКИ.- Москва, 2011; 3-м съезде фармакологов и токсикологов России «Актуальные проблемы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации».- Санкт-Петербург, 2011;17-й Всероссийской научно-методической конференции по патологической анатомии животных «Современные проблемы патологической анатомии, патогенеза и диагностики болезней животных».- М.:ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2011; II Международном конгрессе ветеринарных фармакологов и токсикологов, посвященного восьмидесятилетию заслуженного деятеля науки РФ, профессора Соколова В. Д. «Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии», Санкт-Петербург, 2012; Международной научно-практической конференции посвященной 100-летию со дня рождения Заслуженного деятеля науки РСФСР, д. в. н., проф. Абуладзе К. И. и д. в. н., проф. Колоболотского Г. В. г. Москва, 2012; Международной Российско-Чешской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии». Москва, 2012; Научно-практической конференции молодых ученых и спе-
циалистов «Актуальные вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии». Москва, 2013; IV съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России «Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации». – Москва, 2013; 18-ой Международной научно-методической конференции по патологической анатомии животных. Москва, 2014; Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии». Москва, 2014; Международной научно-практической конференции «актуальные вопросы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии» посвященной 95-летию со дня основания Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина. Москва, 2014; Международной научной конференции «Современные проблемы зоологии, экологии и охраны природы» посвященной памяти и 100-летию со дня рождения А.Н. Банникова. Москва, 2015; Международной научно-практической конференции «Проблемы и пути развития ветеринарии в высокотехнологичном животноводстве» посвященной 45-летию создания ГНУ ВНИВИПФиТ. Воронеж, 2015
Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 60 научных работах, в том числе 24 в изданиях рекомендованных ВАК РФ. Получено четыре патента на изобретение, опубликована 1 монографии и 1 методическая рекомендация утвержденная РАСХН.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 348 страницах и включает введение - актуальность темы исследования, степень её разработанности, цели и задачи, научную новизну, теоретическую и практическую значимость работы, методологию и методы исследований, положения выносимые на защиту, степень достоверности и апробацию результатов; результаты собственных исследований, их обсуждение; заключение - выводы, предложения, список литературы и приложения. Диссертационная работа проиллюстрирована 79 таблицами и 41 рисунком. Список литературы включает 486 источников, в том числе 120 на иностранных языках.
Железодефицитная анемия животных
Обмен железа: поглощение из корма, передвижение к участкам гемо-поэза, синтеза гемоглобина, эритропоэза, распада эритроциов и хранения железа в депо[241, 242, 436, 438].
У молодняка животных увеличение роста опережает развитие, в частности гемопоэтических органов, в результате формируется анемический синдром. У поросят наблюдают характерные отличия, включая гемопоэз. [190,193, 270] Кроветворение в этот временной отрезок происходит вне красного костного мозга. В эмбриональном периоде кроветворение проходит в большей степени в печени. После рождения формируется гемопоэз, осуществляемый костным мозгом. Одновременно с этим у только что родившихся поросят печень не прекращает кроветворение, что содействует формированию анемии в первые недели их существования [54, 118, 213]. Нехватка желчи и соляной кислоты, одновременно с формированием микробиоценоза кишечника поросят также содействуют развитию анемии [459].
Алиментарная гипопластическая анемия развивается из-за недостатков эритропоэза. Норма эритроцитов и гемоглобина поддерживается благодаря кроветворению, и почти не находятся в зависимости времени жизни эритроцитов. Из колониеобразующей мультипотентной клетки формируется бур-стообразующая, позднее колониеобразующая еденица эритроцитов,которые под воздействием эритропоэтина дифференцируются в эритробласты. Через 1 - 2 суток они выходят в кровяное русло, становятся двояковогнутыми, лишаясь ядра и органелл.[109, 129, 218, 226] Пока ранее образованные клетки полностью не сформируются либо не выйдут из костного мозга в кровоток, вновь образовавшиеся клетки для их замены не формируются [19].
Недостаток железа обусловливается отсутствием баланса поступления и переработки. В случае если саногенез либо лечебные мероприятия не сбалансируют явления патогенеза, начинается состояние анемического синдрома [52, 54, 55, 285]. Потребность сочетания таких элементов как железа, меди, марганца и кобальта с целью нормального гемопоэза сформулирована в трудах В.В. Ковальского (1964), Кудрявцева А.П. (1970) и других авторов. Образование и созревание ретикулоцитов находится под воздействием кобальта, который входит в состав цианокобаламина. [229-234, 253, 254]
Иммунобиологическая реактивность организма животных при нехватке железа падает из-за уменьшения миелопероксидазной активности полиморфных нейтрофилов, гипофункции тимуса, сокращения фагоцитарной активности и замедления передвижения макрофагов [405], интерлейкин-2 производится в малых количествах лимфоцитами [326]. Изменения являются обратимыми, восстановление происходит при адекватной ферротерапии.
У скороспелых животных наиболее часто встречается анемия при активном обменом веществ (свиньи и птица). [215, 404, 461].
Иммунодефицит возникает, как правило, через три недели после рождения. Для повышения неспецифического иммунитета и иммунной реактивности требуется применение железосодержащих препаратов, иммуномодуля-торов [2, 154, 469]
Животные, перенесшие анемию, опаздывают в развитии, имеют более низкие показатели репродуктивности [3,467].Из типичных анемического и сидеропенического синдромов формируются клинические признаки анемии. [392, 393, 409]. Через неделю после рождения у поросят снижается аппетит, возникает бледность кожи и слизистых оболочек. Они становятся малоподвижными, истощенными, опаздывают в росте. Через некоторое время кожа начинает морщиниться, щетина грубеть и ломаться, появляется диарея, часто возникают бронхопневмонии. [4, 213, 214] Развитию малокровия у поросят способствует и дефицит железа у свиноматок.[466] Гематологические и биохимические исследования считаются главными методами для постановки диагноза железодефицитной анемии. В процессе исследований определяется количество эритроцитов и гемоглобина. С целью доказательства гипохромии определяют средний размер эритроцитов - MCV , а также среднее количество гемоглобина в эритроците - MCH. Концентрация сывороточного железа при железодефицитной анемии падает. Возрастает латентная железосвязывающая способность (ЛЖСС) сыворотки крови, общая железосвязывающая способность (ОЖСС) сыворотки крови. [8, 60]
Показатель насыщения трансферрина железом (НТЖ) - менее 15%, концентрация ферритина в сыворотке (СФ) крови - 15 нг/мл. [27, 56]
При содержании Hb ниже 110 г/л диагностируется анемия. Выделяют три степени тяжести: тяжелая – при концентрации Hb 69 г/л и ниже, средне-тяжелая - Hb 89–70 г/л, легкая - Hb 109 - 90 г/л. 80 г/л - минимальное физиологическое количество гемоглобина для месячных поросят. Рассчитывая цветовой показатель, который при железодефицитной анемии ниже единицы, связывают концентрацию гемоглобина с количеством эритроцитов, что необходимо учитывать у болеющих животных, у животных с обезвоживанием. При потере организмом жидкости наблюдаем нормальное или повышенное содержание гемоглобина в единице крови. При таких условиях об анемии свидетельствуют показатели микроцитарности красноватых кровавых клеток. [75, 209, 424]
Очень важным диагностическим значением является количество сывороточного железа (Lemacher S, Bostedt H., 1994), так как количество железа в сыворотке крови ниже 18 мкмоль/л указывает на железодефицит. [13, 203]
Излишек железа в организме животных фиксируется реже недостатка. Новорожденным поросятам ферропрепараты вводят парентерально в первые сутки после рождения.
В результате активного роста у поросят в первые месяцы появляется железодефицит, который доходит до 150 мг. Поскольку в организме новорожденного поросенка содержится лишь 50 мг железа, необходимо применять ферропрепараты в разовых дозах 35 - 200 мг в пересчете на трехвалентный ион железа. В результате, в организме возникает место с огромной концентрацией железа, превышающей в разы норму, что является объектом исследований на гиперферриемию и вероятные риски (463, 477, 531, 546).
Скрининг соединений железа представленных на фармацевтическом рынке
Данные результаты дали возможность определить параметры острой токсичности хелатного комплекса железа. Для белых крыс LD50 хелатного комплекса железа равна 800 мг/кг. Следовательно, хелатное соединение железа для приема внутрь по степени воздействия на организм на основе нормативов ГОСТ 12.1.007-76 принадлежит к 3-му классу опасности – вещества опасные.
Однократное применение подопытным животным протеината железа внутрь в дозах 200, 300, 400, 500 мг/кг и 600 мг/кг в пересчете на железо к летальным исходам не приводило. Но, несмотря на это, общее состояние подопытных крыс было неудовлетворительное. В течение 14 суток у крыс из этой группы отмечали симптомы интоксикации: снижение двигательной активности, угнетение аппетита, апатия и ухудшение реакции на внешние раздражители. Характерным для данной группы крыс было отсутствие ярких признаков расстройства пищеварения при интоксикации и болезненности в области брюшной стенки, выражающееся сильным беспокойством, наблюдаемым при малейших манипуляциях с ними.
Патогистологическое исследование ЖКТ и паренхиматозных органов показало, что наблюдаються деструктивные изменения, выраженные в меньшей степени, чем при использовании минеральной соли и хелатного соединения железа (рисунок 6,7).
Не представилось возможным определить параметры острой токсичности протеината железа на основании проведенных исследований, потому что используемые дозы не приводили к летальным исходам. Последующее повышение доз физически не возможно, следовательно, можно говорить о том, что LD50 протеината железа выше, чем изучаемые дозы.
Применение железа в форме железа гидроксид-полимальтозного комплекса внутрь подопытным крысам в дозах 1000, 1250 и 1500 мг/кг не привело к появлению видимых симптомов токсикоза. При применении его в дозах 1750 и 2000 мг/кг летальные исходы не зафиксированы, но отмечено кратковременное угнетение, которое полностью проходило через 15-30 мин. Это не результат специфической интоксикации препаратами железа, такое состояние объясняется введением большого объема жидкости, что подтверждается схожей картиной и в контрольной группе крыс. Все белые крысы в течение опыта были активны, подвижны, адекватно реагировали на раздражители, все физиологические показатели были в пределах физиологической нормы.
Проведение патологоанатомического изучения подопытных животных не обнаружило существенных изменений в структурной организации внутренних органов, кроме незначительной гиперемии слизистой оболочки желудка и тонкого отдела кишечника. Рис. 6 - Гистоархитектоника кишечника крысы опытной группы животных получавших протеинат железа. Видно разлитое кровоизлияние в собственной пластинке слизистой (а). Окраска гематоксилином и эозином. Окуляр Х10, объектив Х10
Рис. 7 – Гистоархитектоника Печень крысы опытной группы животных получавших протеинат железа. Видна переполненная кровью центральная вена (а). Окраска гематоксилином и эозином. Окуляр Х10, объектив Х10 При проведении исследования гистологических срезов внутренних органов не было выявлено значимых нарушений изменений в структурной организации паренхиматозных органов (рисунок 8, 9).
На основании проведенных исследований параметры острой токсичности железа в форме железа гидроксид-полимальтозного комплекса не были определены, потому что используемые дозы не приводили к летальному исходу. Последующее повышение доз физически не возможно, следовательно, можно говорить о том, что LD50 гидроксид-полимальтозного комплекса железа выше, чем исследуемые дозы.
На основе полученных данных, можно сделать вывод о том, что препараты железа в виде минеральной соли, хелатного комплекса, протеината железа и гидроксид-полимальтозного комплекса железа по-разному воздействуют на подопытных животных и морфологию внутренних органов. Препарат трёхвалентного железа для энтерального применения в форме гидроксид-полимальтозного комплекса железа является наиболее безопас ным и произвел самое слабое патологическое воздействие на ткани внутрен них органов при применении в максимально возможных дозах. Выявленные морфологические изменения внутренних органов описываются протеканием компенсаторно-приспособительных процессов, которые выражены в виде умеренной артериальной гиперемии и гемосидероза на фоне повышенной фагоцитарной активности клеток, относящихся к мононуклеарно макрофагальной системе. В своих работах Л.В. Ловцова и В.Б. Кузин (2013) выявили, что гидроксид-полимальтозный комплекс железа у подопытных животных отмечается главным образом в ретикулоэндотелиальной системе, где в дальнейшем протекает постепенная утилизация препарата и инкорпорация железа эритроцитами. Следовательно, в виде гемосидерина в макрофагах представлена большая часть железа, другими словами, в неактивной и безопасной для организма форме. В данной химической форме, это предотвращает губительное воздействие железа, оказываемого на клетки и ткани. И находит подтверждение и в результатах наших исследований.
Терапевтическое действие препаратов при экспериментальной постгеморрагической анемии
Среди исследуемых соединений железа для энтерального введения наиболее низким отрицательным воздействием на организм подопытных животных обладает железо в трехвалентной форме в комплексе с полисахаридами (гидроксид-полимальтозный комплекс железа), что подтверждается анализом полученных результатов. Более высокий уровень токсичности характерен для протеината железа и особенно минеральных солей и хелатных соединений железа. Более низкий уровень повреждающего воздействия среди соединений железа для парентерального введения характерен железодек-страновому комплексу. Наибольший токсический эффект оказывают хелат-ные соединения железа. Следовательно, для инъекционного использования самым безопасным среди соединений железа является железодекстрановый комплекс, для орального использования – гидроксид-полимальтозный комплекс.
Результат профилактической и терапевтической работы полностью зависит от выбора препарата. Поэтому этому выбору необходимо уделять особое внимание. При использовании железосодержащих препаратов необходимо помнить, что железо- элемент, обладающей переходной валентностью, возможно образование свободных радикалов и активных форм кислорода, что является нежелательной эффектом. Железо, находясь в двухвалентной форме, участвует в цепном патогенном перекисном окислении мембранных липидов. В результате происходит превращение гидроперекиси липидов в алкоксильные свободные радикалы в молекулярном соотношении 1:2, разветвляя цепную реакцию на два радикалообразующих пути. Т ҐЛҐЛЛ Т7„+2 ГіТГ і Т7„+3 г\ LUUH + г є - ОН + г є + LU Под воздействием супероксида на трехвалентное железо образует двухвалентное железо. Перекись водорода в его присутствии распадается с образованием гидроксильного радикала (реакция Фентона): H2O2 + O2- = OH- + OH + O2
Необходимо учитывать, что для железодефицитного состояния характерно развитие тканевой гипоксии, характеризующейся в свою очередь активацией свободнорадикальных процессов на фоне уменьшения антиоксидант-ной защиты организма. (Зенков Н.Ж.; Меньшикова Е.Б. 2001; Зарубина И.Ш. 2004; Новикова В.Е; Парфенов Э.А. 2005; Рецкий М.И. соавт. 20085; Евсеев А.В. соавт. 2008; Gibson G., Huang М. 2004). Гиповитаминоз Е и недостаток селена приводит к уменьшению антиоксидантной защиты организма. А так как эти вещества способствуют ликвидации отрицательных последствий, сопряженных с активизацией свободнорадикального окисления при ферротера-пии, то их недостаток является одним из противопоказаний применения монокомпонентных препаратов железа. В случае недостатка антиоксидантов, нежелательные реакции образования свободных радикалов и активных форм кислорода проявляются сильнее. При терапии ЖДА остро встает вопрос потребности коррекции изменений свободнорадикальных процессов, возникающих и при ферротерапии, и под действием гипоксии.
Содержание железа в лекарственном препарате оказывает непосредственное влияние на степень активности пероксидного окисления липидов. При этом нельзя забывать и об условиях, оказывающих воздействие на усвоение железа организмом, к которым относятся: -присутствие таких элементов как медь, кобальт и йод, участвующих в процессе гемопоэза и обмене веществ; -уровень гепсидина – гормона, который синтезируется печенью и воздействует отрицательно на обмен железа в организме; его влияние обусловлено тем, что при внедрении больших доз железа синтез гепсидина становится интенсивным, что противодействует использованию железа. Следовательно, при улучшении и создании новых рецептур ферропре-паратов следует принимать во внимание химическую природу соединений железа; присутствие антиоксидантов и других элементов, оказывающих большое влияние на кроветворение и обмен веществ, и блокирующее воздействие гепсидина при внедрении высоких доз железа.
Это свидетельствует о том, что улучшение рецептур лекарственных препаратов железа должно развиваться не через повышение содержания железа в препарате, а через снижение его уровня с одновременным повышением использования элемента в результате грамотного выбора химического соединения железа, назначением в то же время антиоксидантов и элементов, улучшающих усвоение железа.
Разработка новых комплексных препаратов и их производство происходило при совместном участии научно-производственной фирмы ООО «А-БИО» (г. Москва), и шло в направлениях оптимизации состава препаратов с целью увеличения терапевтического эффекта и снижения негативных последствий введения железа. Идея разработки развивалась в двух направлениях.
Первое – это введение в матрицу коллоидной частицы железо-декстрана антиоксидантов, блокирующих всплеск прооксидантной активности в результате инъекции значительных доз трехвалентного железа.
Второе – это поиск синергистов железа, которые позволяют снизить его терапевтическую дозу, при одновременном ускорении и усилении фармакологического эффекта, за счет увеличения его усвоения из-за синергетическо-го действия. Снижение дозы необходимо не только для уменьшения СРО но и для минимизации печеночной экспрессии гепсидина, который в свою очередь препятствует усвоению железа, при ферротерапии, обусловливая тем самым порочный круг.
Органолептические показатели и общая биологическая ценность мяса
Для исследований использовались белые крысы обоего пола, масса тела которых составляла от 180 г до 200 г. Крысы были разделены на 5 групп, в каждую из которых входило по 10 особей. С первой по третью группы – опытные, им применяли изучаемые комплексные препараты железа, добавочно содержащие йод, седимин-Fe+, седимин-Se+ и био-железо с микроэлементами. Препараты вводили внутримышечно, дважды с промежутком в 10 суток. Био-железо с микроэлементами использовали вместе с кормом на протяжении 20 суток. Четвертая и пятая группы – контрольные, им вводили изотонический раствор натрия хлорида внутримышечно и внутрь по аналогичной с исследуемыми препаратами схеме.
На протяжении 30 суток животные находились под контролем, постоянно проходили клиническое обследование по общепринятым методам.
Кровь для изучения получали трижды: до применения препаратов, на 10 и 20 сутки эксперимента.
Патологоанатомическое вскрытие части животных осуществлялось на 10-ые и 20-ые сутки эксперимента, одновременно брали пробы тканей и органов (щитовидная железа) для проведения гистологического исследования.
После эвтаназии у животных отделяли щитовидные железы, совершали морфологические исследования. Их исследование состояло из определения их размеров, формы, массы, относительной массы, цвета, симметричности долей, консистенции и состояния паренхимы, относительной массы железы, то есть количества ее грамм на 100 кг массы тела животного.
Любому отклонению в функциональной активности щитовидной железы сопутствует перестройка ее гистоструктуры, выражающаяся в изменении ее тканевых компонентов. Проведения патоморфологического анализа щитовидной железы основывалось на алгоритмах гистологического описания, разработанных О.К.Хмельницким. Морфометрию структурных компонентов щитовидной железы проводили с помощью метода точечного счета; высоту фолликулярного эпителия; среднюю площадь фолликулов, средний диаметр фолликулов определяли с помощью объект-микрометра. Для определения относительного объема основных тканевых компонентов щитовидной железы, а именно эпителия, коллоида, стромы, воспользовались окулярной точечной сеткой. Данные применяли для вычисления индекса накопления коллоида (индекс Брауна) и фолликулярно-колоидного индекса (ФКИ, индекс активности железы).
Анализ полученных результатов не выявил отклонений в общем состоянии животных при применении препаратов в указанных дозах.
Анализ крови выявил повышение уровня трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) в опытных группах животных.
Итак, после применения в опытных группах животных инъекционных препаратов седимин-Fe+, седимин-Se+ в первый раз содержание Т4 и Т3 составил 53,09; 0,82 и 56,00; 0,78 моль/л соответственно, а это при сравнении с контрольными группами больше на 7,8; 24,3 и 8,4; 19,2%.
При повторном применении препаратов седимин-Fe+, седимин-Se+ содержание гормонов Т4 и Т3 у животных было равно 71,23; 0,61 и 72,45; 0,66 нмоль/л соответственно, что превышает значения уровня Т4 и Т3 у животных конрольной группы на 14,7; 26,2 и 12,3; 28,6% соответственно.
Применение орального препарата био-железо с микроэлементами ежедневно не выявило различий в общем состоянии лабораторных животных.
Так, на 10-е сутки применения у животных, которым давали препарат био-железо с микроэлементами, содержание Т3 и Т4 было равно 61,13; 0,58 нмоль/л, что превышает на 8,1; 6,9% соответственно показатели у животных из контрольных групп. Уже на 20 сутки после начала применения этого же препарата у животных количество Т3 и Т4 соответственно составляло 62,09; 0,64 нмоль/л , что на 5,4; 8,1 % больше показателей контрольной группы животных.
В ходе исследований нами выявлено, что на уровень содержания тире-ойдных гормонов трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) в крови белых крыс исследуемые препараты оказывают стимулирующее действие. Отмечено, что применение инъекционных препаратов орального препарата не приводит к значительным различиям в значениях показателей уровня содержания Т3 и Т4 между группами.
Применение полуколичественных и количественных методов при анализе гистологической структуры щитовидной железы дало возможность установить закономерно изменения морфологических и морфометрических показателей щитовидной железы между животными из контрольных и опытных групп (таблица 35). Оценивая гистологические препараты ткани щитовидной железы у животных контрольных групп, выявлены симптомы, указывающие на перестройку микроархетектоники железы, которые указывают на уменьшение функциональной активности органа (рисунок 19).
На гистологических срезах зафиксирована сильная гетерогенность размеров фолликулов - от мелких до крупных, с преобладанием последних. Среднее значение площади фолликулов - 16320,43 ±1042,2 мкм2, а диаметра - 137,3±4 мкм. Они имеют округло-овальную форму, не редко неправильную. Фолликулы сформированы плоским эпителием, принимающим эту форму из-за роста величины фолликула и растяжения стенки скопившимся коллоидом. Среднее значение высоты интрафоликуллярного эпителия составляет 4,32±0,22 мкм, также в фолликулах отмечается десквамация тироцитов в просвет фолликулов. Полость фолликулов в основном заполнена неоднородным слабо оксифильным хрупким коллоидом, плотность которого неравномерна, в редких случаях полость заполнена плотным оксифильным коллоидом. Также выявлено наличие в редких случаях небольших резорбционных вакуолей, свидетельствующее о фагоцитозе коллоида. Слабо развитая меж-дольковая соединительная ткань представлена тонкими интенсивно-эозинофильными межфолликулярными прослойками, которые в отдельных полях зрения разрыхлены. Отмечено наличие сосудов междольковой стромы, которые имеют узкий просвет или слиплись.