Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 12
1.1 Биологическая активность полисахаридов 12
1.2 Неспецифическая резистентность организма и её нарушения 23
1.3 Средства, используемые для повышения защитных свойств организма животных 31
1.4 Иммунокоррегирующая терапия при иммунодефицитных состояниях 35
2 Основное содержание работы 52
2.1 Методология и методы исследований 52
2.2 Результаты собственных исследований 62
2.2.1 Токсикологические свойства полисахаридного препарата «Гемив» 62
2.2.1.1 Изучение острой токсичности 62
2.2.1.2 Изучение кумулятивных свойств 64
2.2.1.3 Изучение хронической токсичности 66
2.2.1.4 Изучение раздражающего и аллергизирующего действия полисахаридного препарата «Гемив» 75
2.2.1.5. Изучение эмбриотоксических и тератогенных свойств 76
2.2.2 Эффективность применения полисахаридного препарата «Гемив» для повышения резистентности лабораторных животных 80
2.2.2.1 Влияние разных доз полисахаридного препарата «Гемив» белым крысам при экспериментальном иммунодефиците 80
2.2.2.2 Влияние разных доз полисахаридного препарата «Гемив» кролика при экспериментальном иммунодефиците 84
2.2.3 Сравнительная иммуностимулирующая эффективность полисахаридного препарата «Гемив» и циклоферона 93
2.2.3.1 Результаты клинико-гематологических исследований 93
2.2.3.2 Результаты биохимических исследований 97
2.2.3.3 Результаты иммунологических исследований 100
2.2.4 Производственные исследования полисахаридного препарата «Гемив» 103
2.2.4.1 Условия содержания и кормления кроликов в КФХ «МИАКРО-КАРАТАУ Фермерское хозяйство» 103
2.2.4.2 Влияние полисахаридного препарата «Гемив» на иммунокомпетентные клетки периферической крови при вакцинации кроликов против сальмонеллеза 107
2.2.4.3 Ветеринарно-санитарная оценка мяса кроликов после введения полисахаридного препарата «Гемив» на фоне иммунизации против сальмонеллеза 113
2.2.4.4 Биологическая оценка мяса кроликов 115
2.2.4.5 Микроструктура отдельных внутренних органов кроликов после применения полисахаридного препарата «Гемив» на фоне иммунизации 116
2.2.5 Экономическая эффективность разработанных мероприятий 140
3 Заключение 143
Предложение производству 152
Список сокращений 153
- Неспецифическая резистентность организма и её нарушения
- Иммунокоррегирующая терапия при иммунодефицитных состояниях
- Изучение раздражающего и аллергизирующего действия полисахаридного препарата «Гемив»
- Условия содержания и кормления кроликов в КФХ «МИАКРО-КАРАТАУ Фермерское хозяйство»
Введение к работе
Актуальность темы. Одной из важнейших задач для эффективного ведения животноводства является сохранение здоровья молодняка. В условиях ведения промышленного животноводства молодняк подвергается воздействию различных неблагоприятных факторов, таких как нарушение норм кормления, скученность содержания, нарушение микроклимата и санитарного состояния помещений, а также воздействие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (Выдрин В.Л., 1998; Захаров П.Г. и др., 2001).
Поэтому, восстановление иммунологических нарушений - актуальная
задача, так как большинство хронических, соматических, инфекционных болезней
у животных сопровождается вторичной иммунологической недостаточностью.
Алгоритмизация иммунокоррекции (иммуномодуляции) предполагает
использование фармакологических средств, которые способны увеличивать (иммуностимуляция) или снижать (иммуносупрессия) уровень иммунного ответа (Федоров Ю.Н., 2013).
На сегодняшний день имеется большой выбор новых коммерческих готовых
или находящихся на стадии разработки и испытаний иммуностимуляторов,
иммуномодуляторов, предназначенных для разных видов животных,
направленных на инициацию различных типов иммунного ответа, сочетающих в себе различные уровни показателей эффективности и безопасности. Как перспективный комплекс биологически активных веществ для создания новых лекарственных средств для коррекции различных нарушений иммунной системы рассматриваются и полисахариды.
Степень разработанности проблемы. Состояние иммунной системы, как и любого другого органа, характеризуется комплексом морфологических, функциональных и клинических показателей, присущих иммунной системе в норме и они определяют иммунный статус (Боряев Г.И., 1999). Изменение какого-либо одного или нескольких показателей свидетельствует о нарушении иммунного статуса, т.е. отклонении его от норм, и трактуется как иммунодефицит (Морякина С.В., 2008).
В центре внимания научного поиска остается проблема острой недостаточности эффективных лекарственных препаратов при иммунодефицитах, высокая их стоимость на фармакологическом рынке сдерживает проведение соответствующих профилактических и лечебных мероприятий. Поэтому исследования по определению токсических, иммуностимулирующих свойств полисахарида микробного происхождения «Гемив», проводимых на лабораторных и других животных весьма актуальны.
Тема работы является составной частью научных исследований, проводимых кафедрой зоогигиены ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана».
Цель и задачи исследований. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось изучение фармако-токсикологических свойств полисахарида микробного происхождения «Гемив» и эффективности его применения для повышения неспецифической резистентности кроликов.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-
Определить токсичность и безвредность полисахаридного препарата «Гемив» на организм лабораторных животных;
-
Разработать оптимальную схему применения и выявить дозу, при которой достигается наиболее высокая продуктивность животных.
-
Экспериментально определить иммуностимулирующую активность полисахаридного препарата «Гемив»;
-
Изучить влияние полисахаридного препарата «Гемив» на морфологический и биохимический состав крови и естественную резистентность кроликов на фоне вакцинации против сальмонеллеза;
-
Провести ветеринарно-санитарную оценку мяса кроликов полученного после применения полисахаридного препарата «Гемив»;
-
Рассчитать экономическую эффективность применения полисахаридного препарата «Гемив» при вакцинации кроликов против сальмонеллеза.
Научная новизна работы. Впервые изучены фармако-токсикологические
свойства полисахаридного препарата микробного происхождения «Гемив»,
влияние его на морфобиохимические показатели крови животных. Установлено
положительное влияние на среднесуточные приросты животных,
иммунологические показатели. Изучена гистоморфология тканей и органов кроликов, получавших полисахаридный препарат «Гемив» на фоне иммунизации против сальмонеллеза.
Теоретическая и практическая значимость работы. На основе
проведенных исследований установлена доза и схема применения
полисахаридного препарата «Гемив» для повышения резистентности,
продуктивности кроликов. Полученные результаты исследований включены во «Временные правила по применению полисахаридного препарата «Гемив» в ветеринарии», утвержденным начальником Главного управления ветеринарии Кабинета Министров Республики Татарстан А.Г. Хисамутдиновым (от 07 апреля 2015 года).
Основные положения, вытекающие из материалов диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедрах фармакологии и токсикологии, эпизоотологии, микробиологии, зоогигиены, физиологии и патофизиологии ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана», на факультете биотехнологии и ветеринарной медицины ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный аграрный университет»; на кафедре морфологии, акушерства и терапии факультета ветеринарной медицины и зоотехнии ФГБОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия».
Методология и методы исследований. В лабораторных, научно-хозяйственных и производственных опытах использовано 300 белых крыс, 112 крысят-отъмышей и 96 кроликов породы советская шиншилла.
Для изучения влияния полисахаридного препарата «Гемив» на
физиологическое состояние животных использовали токсикологические,
клинические, морфологические, биохимические, иммунологические,
зоогигиенические методы исследований. Ветеринарно-санитарные качества мяса
кроликов определяли органолептическими, физико-химическими и
бактериологическими исследованиями. Учитывали зоотехнические показатели роста кроликов и определяли экономическую эффективность применения полисахарида общепризнанными методиками. Обработку экспериментально полученного цифрового материала проводили методом вариационной статистики с применением критерия достоверности по Стъюденту на персональном компьютере с использованием программного пакета Microsoft Excel, 2007.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Полисахаридный препарат «Гемив» является малотоксичным соединением, не обладает местно-раздражающим, аллергизирующим, кумулятивным, эмбриотоксическим и тератогенным свойствами;
-
Полисахаридный препарат «Гемив» позволяет повышать неспецифическую резистентность организма при иммунодефицитных состояниях;
-
Применение «Гемив» способствует увеличению среднесуточных приростов, не оказывает отрицательного влияния на вкусовые, физико-химические свойства мяса кроликов и дает значительный экономический эффект чем препарат «Циклоферон».
Степень достоверности и апробация результатов. Научные выводы и практические предложения теоретически и экспериментально обоснованы, что подтверждается фактическими данными. Они логически вытекают из содержания работы, согласуются с поставленными целью и задачами.
Основные результаты диссертации представлены и обсуждены на
всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы
научного и кадрового обеспечения инновационного развития АПК»
(г. Казань, 2012 г.); международной научной конференции студентов, аспирантов и
молодых ученых «Знания молодых для развития ветеринарной медицины и АПК
страны» (г. Санкт-Петербург, 2013 г.); международной научно-практической
конференции «Научное и кадровое обеспечение инновационного развития
агропромышленного комплекса», посвящнной 140-летию КГАВМ (г. Казань,
2013 г.); в материалах международной научно-практической конференции,
посвященной 80-летию образования Иркутской государственной
сельскохозяйственной академии и 10-летию первого выпуска ветеринарных врачей «Фундаментальные и прикладные исследования в ветеринарии и биотехнологии» (10-11 декабря 2014 г., г. Иркутск); в Ученых записках Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана (г. Казань, 2015 г.); в материалах VI международной научно-практической конференции «Актуальные направления фундаментальных и прикладных исследований» (22 - 23 июня 2015 г., North Charleston, USA).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК России.
Неспецифическая резистентность организма и её нарушения
Полисахариды могут составлять до 80 % сухого веса растения. В состав клеточных стенок растений входят целлюлоза, гемицеллюлозы и пектины (пектиновые вещества). Кроме того, в растениях содержатся резервные полисахариды (крахмалы, инулин и т.д.), камеди и слизи. Целлюлоза и резервные полисахариды – нейтральные полимеры, построенные из остатков нейтральных моносахаридов. Остальные группы включают как нейтральные полисахариды, так и кислые, содержащие остатки глюкуроновых кислот (Оводов Ю.С. Полисахариды цветковых растений: структура и физиологическая активность / Ю.С. Оводов // Биоорганическая химия. - 1998. - Т. 24. - № 7. - С. 483 – 501).
Полисахариды представляют интерес и как группа неспецифических транспортных макромолекул, так как эти полимеры способны обеспечивать эффективную направленную доставку действующего лекарственного вещества к биомишеням (Глозман О. М. Производные декстрана. XII. Присоединение производных у-аминомасляной кислоты к декстрану / О. М. Глозман, Л.A. Журенко, В.В. Шавырина [и др.] // Журнал общ. химии. 1980. Т. 50. № 7. С. 1640 - 1648.; Niemela K. Identification of the products of hydrolysis of carboxymetyl cellulose / K. Niemela, E. Sjostrom // Carbohydrate Research. 1988. -V. 180. - P. 43 - 52.; Xu J. Immobilization of trypsin on sefarose derivatives using various covalent bonding methods / J. Xu, S. Qi, Zh. Yyan // Shengwu Gongcheng Xuebao. - 1993. V.9,№1. - P. 69 - 73). Они в наибольшей степени отвечают требованиям, предъявляемым к матрицам при создании физиологически активных полимеров (ФАП). Полисахариды, как правило, не токсичны, не вызывают аллергических реакций, легко выводятся из организма. Химическая фиксация лекарственных субстанций на полисахаридной матрице позволяет создавать препараты пролонгированного действия с низкой токсичностью и необходимым балансом липофильно-гидрофильных свойств (Глозман О. М. Производные декстрана. XII. Присоединение производных у аминомасляной кислоты к декстрану /О. М. Глозман, Л.A. Журенко, В.В. Шавырина [и др.] // Журнал Общ.химии. - 1980. - Т. 50. - № 7. - С. 1640 - 1648.; Коршак В.В. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных соединений. / В.В. Коршак, М.Н. Штильман. - М.: Наука, 1984. 671 с.; Алюшин М.Т. Современное состояние научных исследований по применению полимеров в фармации / М.Т. Алюшин, И.С. Грицаенко, М.В. Каменская // Научн. тр. ВНИИ Фармации. 1990. - Вып.28. -с. 5 - 11.; Рустамов Я.И. Особенности технологии синтеза натрий карбоксиметил целлюлозы из различных сырьевых материалов./ Я.И. Рустамов, Ф.М. Садыков, Г.А. Карамамедов [и др.] // Химическая промышленность. - 1997. - №9. - С 606 -610).
В последнее время большое внимание уделяется поиску и изучению средств, оказывающих влияние на иммунные реакции организма. Многие исследователи связывают иммуномодулирующие свойства растений и фитопрепаратов с полисахаридами (Мельникова Т.И., Николаев В.О. Сравнительная иммунофармакологическая оценка растительных экстрактов с полифенольными и полисахаридными комплексами / Т.И. Мельникова, В.О. Николаев // Фармация в ХХI веке: инновации и традиции – СПб, 1999. С.179; Кузьмина А.А. Разработка фитопрепаратов для профилактике и лечения заболеваний органов дыхания у детей: автореф. канд. фарм. наук: 15.00.02 и 14.00.25 / Кузьмина А.А. - СПб, 2000. – 29 с.).
Некоторые фракции растительных полисахаридов оказывают влияние на факторы гуморального иммунитета: повышают количество лизоцима и титр комплемента в сыворотке крови (Басс-Шадхам Х.Ф., Зейдака А.А. Биологическая активность полисахаридных фракции, выделенных из лишайника Cetraria islandica. В книге: Новые иммунореагирующие препараты и иммунологические методы. Рига. 1978. С. 9 - 14., Демидов В.К., Басс-Шадхан Х.Ф. Морфологическая характеристика лимфатических узелков и печени крыс линии Вистар, получавших полисахариды из лишайника Cetrariaislandica. В книге: Новые иммунореагирующие препараты и иммунологические методы. - Рига, 1978.-С.17 - 18.). Эти же полисахариды, выделенные в чистом виде, оказывают в опытах “in vitro” и “in vivo” на модели фагоцитоза иммуномодулирующие действия (Lawery S.D. Biological role of lichen substances / S.D. Lawery // Bryologist. - 1986. -V 89, 2. - P 112 – 122; Ingolfsdottin K. In vitro inhibition of 5-lipoxygen as ebyprotolichester in coccid from Cetrariaislandica / K. Ingolfsdottin, W. Breu, S. Huneek, [et. all.] // Phytomedicine. 1994 a. № 1 P. 187 – 191.).
Полисахариды некоторых растений стимулируют физическую работоспособность, увеличивая при этом мышечную массу животных. Как правило, полисахариды растений не обладают токсичностью, пирогенностью, аллергенностью (Сычев И.А. Лечебные свойства препаратов водорастворимых полисахаридов из растений донника желтого / И.А. Сычев, А.К. Рачков // Инф. Листок ЦНТИ г. Рязани. - 1993. - № 169. - 3с; Сычев И. А. Иммуннокоррегирующее, антианемическое и адаптогенное действие полисахаридов из донника лекарственного / И. А. Сычев, А. А. Подколзин, В. И. Донцов [и др.] // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1996. – № 6. – С. 661-663; Сычев И.А. Изучение противовоспалительного действия полисахаридов Донника желтого / И.А. Сычев, В.М. Смирнов, Т.Ю. Колосова // Российский медико-биологический вестник им. Академика И.П. Павлова. - Рязань: РГМУ, 2003. - № 1 - 2. - С. 58 - 63; Сычев И.А. Влияние полисахарида Донника желтого пектин на некоторые свойства иммунной системы животных / И.А. Сычев // Российский медико-биологический вестник им. Академика И.П. Павлова. - Рязань: РГМУ, 2004. - № 1 - 2. - С. 75 - 82;Сычев И.А. Механизм повышения неспецифической резистентности организма под действием полисахарида Донника желтого / И.А. Сычев, В.М. Смирнов, Г.В. Порядин // монография. - Рязань, 2006. – С. 13).
Многие полисахариды, выделенные из низших, высших растений и животных, нашли применение в медицинской и ветеринарной практике, при этом основное внимание исследователей было сфокусировано на таком фармакологическом эффекте, как дезинтоксикационная энтеросорбция (элиминация через желудочно-кишечный тракт радионуклидов, тяжелых металлов, бактериальных токсинов и др.) (Гнидой И.М. Пищевые волокна в лечении заболеваний гепатобилиарной системы у детей / И.М. Гнидой, И.И. Дихтярюк // Педиатрия. - 2000. - № 5. - С. 97).
В ряду веществ, способных восстанавливать функциональную активность иммунокомпетентных клеток, особое место отводится растительным полисахаридам, которые могут не только модулировать различные свойства иммунной системы, но и обладают способностью к сорбции радионуклидов, тяжелых металлов и бактерий, нормализации липидного обмена, активации секретирующей и моторной функций кишечника (Lahaye M. Sea weed dietary fibers: structure, physicochemical and biological properties relevant to intestinal physiology / M. Lahaye, B. Kaeffer // Sciences and Aliments. - 1997. - Vol. 17. - P. 563 – 584; Kilpatric D.C. Immunological aspects of the potential role of dietary carbohydrates and lectinsin human health / D.C. Kilpatric // Eur. J. Nutr. 1999. -Vol. 38. - P. 107 - 117; Roshade SouzaM.C. Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds / M.C. Roshade Souza, C.T. Marques, C.M. Guerra Dore // J. Appl. Phycol. - 2007. - Vol. 19. - P. 153 - 160).
Иммунокоррегирующая терапия при иммунодефицитных состояниях
На основании проведенных исследований были определены оптимальные дозы применения полисахаридного препарата «Гемив» на белых крысах и кроликах. Нами был разработан режим и дозировка применения полисахаридного препарата «Гемив». В эксперименте отправной точкой при подборе испытуемых доз полисахаридного препарата «Гемив» служила 126 мг/кг живой массы, после введения которой были получены положительные результаты. В качестве фактора, вызывающего иммунодефицитное состояние использовали препарат циклофосфан (иммунный статус и показатели неспецифической резистентности изучали путем моделирования иммунодефицитного состояния).
В дальнейших исследованиях изучали влияние полисахаридного препарата «Гемив» на организм кроликов при применении с вакциной против сальмонеллеза.
С целью изучения влияния полисахаридного препарата «Гемив» на формирование иммунитета у кроликов и эффективности специфической профилактики сальмонеллёза, при двукратной вакцинации, было сформировано три группы кроликов по 12 животных в каждой.
В качестве иммунокоррегирующего препарата для сравнительного анализа мы применяли циклоферон, который является низкомолекулярным индуктором интерферона, что определяет широкий спектр его биологической активности (в том числе противовирусной, иммуномодулирующей, противовоспалительной, антипролиферативной, противоопухолевой). Установлена высокая противомикробная и противохламидийная активность препарата за счет активации системы иммунитета.
Опыты проводили на кроликах, живой массой 4,5 -5,0 кг. Кролики всех групп прививали инактивированной вакциной против сальмонеллеза в дозе 1 мл двукратно с интервалом в 7 дней при применении полисахаридного препарата «Гемив» и циклоферона. Животным первой группы вводили «циклоферон» – в дозе 125 мг/гол в объеме 1 мл, второй группы – полисахаридный препарат «Гемив» в дозе 1 мл/гол в 0,5 % концентрации (с содержанием сахаров 0,7 ммоль/л). Кроликам третьей группы иммуностимулирующие препараты не вводили (контрольная группа – двукратная инъекция инактивированной вакцины против сальмонеллеза в дозе 1 мл с интервалом 7 дней). За подопытными животными вели постоянное клиническое наблюдение. При этом производили взвешивание, а также определяли температуру тела у животных. В сыворотках крови у подопытных животных определяли общий белок и белковые фракции, а также активность отдельных ферментов, в частности, аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы. Через две недели после вакцинации у подопытных кроликов определяли уровень противосальмонеллезных антител в реакции гемагглютинации (РГА). В качестве антигена использовали инактивированные культуры сальмонелл с концентрацией 1 млрд. м.к./мл.
Гистологические исследования по оценке влияния полисахаридного препарата «Гемив» при иммунизации против сальмонеллеза на органы и ткани кроликов проводили на 14 и 21 сутки после начала применения испытуемого соединения. Для выполнения морфологических исследований кусочки печени, почек и селезенки подопытных и контрольных животных фиксировали в 10 % ном нейтральном водном растворе формальдегида, этанол-формальдегиде (9:1). Обезвоженные в спиртах восходящей плотности кусочки органов и тканей уплотняли заливкой в парафин. Изготовленные гистологические срезы толщиной 6-8 мкм окрашивали гематоксилин-эозином (Меркулов М.И., 1969). В ходе изучения микроструктурных изменений в органах и тканях кроликов проводили фотографирование наиболее выраженных изменений. Морфологические исследования были выполнены на кафедре патологической анатомии и гистологии ФГБОУ ВПО КГАВМ под руководством заведующего кафедрой, д-ра ветеринарных наук, профессора Залялова И.Н. Наряду с этим проведены патоморфологические исследования органов и тканей лабораторных животных, использованных при определении острой и хронической токсичности испытуемого полисахаридного препарата «Гемив».
О качестве мяса после применения препаратов судили по результатам ветеринарно-санитарной экспертизы, включающей в себя органолептическую и дегустационную оценку мяса и жира, а также физико-химические показатели мяса кроликов.
Органолептическое исследование для установления степени свежести мяса кроликов проводили по ГОСТ 20235.0-74 (Мясо кроликов. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести).
Определение физико-химических показателей в мясе кроликов на наличие аммиака и солей аммония, активность мышечной пероксидазы, кислотное число жира, содержание амино-аммиачного азота; определение концентрации водородных ионов (рН) проводили в соответствии с ГОСТ 20235.1-74 (Мясо кроликов. Методы химического и микроскопического анализа свежести мяса).
Во время проведения экспериментов у животных определяли морфологический состав крови, выводили лейкоформулу, содержание биохимических показателей. Гематологические показатели определяли общепринятыми методами (А.А. Кудрявцев с соавт., 1974): содержание гемоглобина – гемометром Сали, подсчет эритроцитов и лейкоцитов в 1 мм3 проводили в камере Горяева. При изготовлении мазков крови и выведении лейкоформулы пользовались указаниями по гематологическим исследованиям (А. А. Кудрявцев с соавт., 1974 и Г. А. Симонян с соавт., 1995). Количество Т-клеток подсчитывали в реакции спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК), общую популяцию В-лимфоцитов – в реакции комплементарного розеткообразования (ЕАС-РОК) с эритроцитами, образующими иммунные комплексы с комплементом, по методу M. Jondaletal. (1972) в модификации Р.В. Петрова с соавт. (1984). Биохимические исследования состояли из определения в сыворотке крови общего белка с помощью рефрактометра RL-3, белковых фракций -нефелометрически. Используя шкалу Рейсса, показания рефрактометра переводили в проценты белка (И. М. Карпуть, 1993). В сыворотке крови определяли: общий кальций и неорганический фосфор – унифицированным колориметрическим методом с помощью набора реагентов «Ольвекс диагностикум», активность трансаминаз (АлАТ – аланинаминотрансфераза и АсАТ – аспартатаминотрансфераза) – унифицированным методом Райтмана Френкеля, щелочную фосфатазу по методу Бодански (И.П. Кондрахин, Н.В. Курилов, А.Г. Малахов, 1985).
По результатам производственных испытаний проводили расчет экономической эффективности применения полисахаридного препарата «Гемив»» в кролиководстве. Экономическую эффективность применения «Гемив» с вакциной против сальмонеллеза рассчитали по И.Н. Никитину и др. (2012) с учетом действующих цен.
Результаты исследований подвергали математической обработке на ПК с использованием программного комплекса Microsoft Excel 2007, с вычислением средних арифметических (М), их среднестатистических ошибок (m) и критерия достоверности (р); цифровые данные оценивали с применением степени достоверности по Стъюденту.
Изучение раздражающего и аллергизирующего действия полисахаридного препарата «Гемив»
Полученные результаты по оценке изменения титра антител у кроликов, вакцинированных против сальмонеллеза показывают, что в опытной группе, где проводили вакцинацию против сальмонеллеза в сочетании с полисахаридным препаратом «Гемив» титр антител превосходит показатели контрольной группы, и на 21 день эксперимента были выше на 0,59 log2, что является доказательством выраженного иммуностимулирующего свойства полисахарида.
Как показали результаты гематологических, биохимических исследований, введение кроликам полисахаридного препарата «Гемив» в качестве иммуностимулятора положительно влияет на гематологические показатели; при этом отмечается некоторое увеличение содержания эритроцитов и гемоглобина. А у привитых одной лишь вакциной наблюдали некоторое снижение этих показателей. По уровню лейкоцитов существенных различий нам обнаружить не удалось. При исследовании Т- и В - лимфоцитов через 2 недели после сочетанной вакцинации с применением полисахаридного препарата «Гемив» установлено некоторое увеличение уровня Т - лимфоцитов на 14 % по сравнению с контрольной группой, вакцинированной без применения иммуностимулятора.
Данные таблицы 17 показывают незначительные изменения биохимических показателей в группах. В опытной группе после сочетанной вакцинации с полисахаридным препаратом «Гемив» наблюдали достоверное увеличение содержания альбуминов и на 21 сутки исследования оно было выше на 9,9% по сравнению с исходными показаниями. Количество альбуминов в контрольной группе к концу эксперимента снизился от 61,1% до 55,5% соответственно.
На 14 сутки опыта в опытной и контрольной группе, показатель общего белка незначительно превышал исходные цифры, но на 21 сутки исследования был ниже показателей интактных животных.
К концу эксперимента показатель -глобулинов в опытной группе по отношению к контрольной группе был выше на 0,8%, а по отношению к показателям интактных животных на 3% соответственно.
Наиболее значительные изменения были в содержании аланинаминотрансферазы как в опытной, так и в контрольной группе. Данный показатель значительно увеличился на 14 сутки в опытной группе, а к концу эксперимента был ниже исходных данных.
Показатель соотношения альбуминов к глобулинам (А/Г) на протяжении эксперимента имел недостоверные изменения. К концу эксперимента, в опытной группе этот показатель имел наибольшее соотношение по сравнению с остальными группами.
Исходные показатели живой массы кроликов были одинаковы, но по ходу эксперимента имели различные значения. В опытной группе наблюдали достоверное увеличение живой массы кроликов до конца эксперимента. К концу опыта масса тела у животных была в среднем на 400 г выше, чем у интактных кроликов.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение полисахаридного препарата «Гемив» при иммунизации кроликов против сальмонеллеза дает более высокий результат, вызывая выработку специфических антител больше чем у иммунизированных животных без полисахаридного препарата «Гемив». В то же время полисахаридный препарат «Гемив» положительно влияет и на прирост кроликов
Тушки подопытных и контрольных кроликов по своим органолептическим показателям были идентичными: на поверхности тушек имелась корочка подсыхания бледно-розового цвета, серозные оболочки брюшной полости были влажные и блестящие, внутренний жир белого цвета. Мышечная ткань плотная, упругая, бледно-розового цвета с красноватым оттенком, на разрезе слегка влажная, не оставляющая влажного пятна на фильтровальной бумаге, ямка после надавливания пальцем выравнивалась быстро. Запах мышечной ткани специфический, свойственный запаху мяса кроликов. Жир - плотный, белого цвета, со специфическим запахом, характерным для жира кроликов. Бульон, полученный при постановке пробы варкой, был прозрачный и ароматный.
Результаты физико-химических исследований и микроскопии мазков-отпечатков представлены в таблице 18.
Фермент мышечной ткани пероксидаза (бензидиновая проба) был активным во всех группах, а продукты первичного распада белков не обнаружились. Реакция водных вытяжек мяса на аммиак и соли аммония с реактивом Несслера была отрицательной в первой и во второй группах, а количество амино-аммиачного азота находилось в пределах 0,42-0,56 мг, что характерно для доброкачественного мяса кроликов.
При микроскопии мазков - отпечатков из глубоких слоев мышечной ткани микробных клеток обнаружено не было. В мазках-отпечатках из поверхностных
114 слоев были обнаружены единичные грамположительные кокковые формы микроорганизмов, что не противоречит требованиям действующих нормативных документов. При определении кислотного числа жира было установлено, что оно не превышает 0,22 в одном случае и 0,34 в другом, что соответствует доброкачественному жиру кроликов.
Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что органолептические, физико-химические и бактериоскопические показатели мяса, соответствуют стандартам, предусмотренным для доброкачественного мяса здоровых кроликов, и оно может быть использовано для пищевых целей без каких-либо ограничений.
Биологическую оценку мяса кроликов проводили согласно рекомендациям Н.Г. Беленького (1973) на 20 белых крысятах - отъёмышах. Проваренное мясо кроликов опытной группы животных скармливали крысятам - отъемышам ежедневно в течение 28 дней из расчета 50г/кг массы тела в день. Взвешивание белых крысят проводили на 5, 10, 15, 25 сутки с начала опыта. Результаты исследований представлены в таблице 19.
Условия содержания и кормления кроликов в КФХ «МИАКРО-КАРАТАУ Фермерское хозяйство»
Во время проведения экспериментов у животных определяли морфологический состав крови, выводили лейкоформулу, изучали биохимические показатели сыворотки крови. Гематологические показатели в период опыта изменялись, но эти изменения были в пределах физиологической нормы. Активность аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ) в сыворотке крови белых крыс после введения полисахаридного препарата «Гемив» повысилась у животных опытных групп, тогда как в контрольной группе отмечалось их снижение. Уровень щелочной фосфатазы во всех опытных группах повысился относительно исходных и контрольных показателей (р0,01). Кроме того, в первой опытной группе, отмечалось снижение уровня общего кальция по сравнению с исходными значениями, а уровень неорганического фосфора чуть выше исходных значений (р0,001). Относительно контрольных показателей, уровень общего кальция в сыворотке крови подопытных животных первой, второй и третьей групп был ниже, а уровень неорганического фосфора выше на 0,8, 1,1 и 0,1 ммоль/л соответственно (р0,01).
Содержание - глобулинов как у контрольной, так и в опытных группах крыс на 10 сутки исследований незначительно увеличилось с последующим снижением на 20 сутки у опытных животных. Концентрация -глобулинов в сыворотке крови опытных групп лабораторных животных на 10 сутки исследований имела тенденцию к снижению, но на 20 сутки эксперимента показатели были достоверно выше относительно контрольных показателей (р0,01).
Аналогичные изменения наблюдали и со стороны гамма-глобулинов. На последний день исследований концентрация гамма-глобулинов в первой и второй опытной группе была достоверно выше по сравнению с контрольной группой животных на 17,6 и 12,9 % соответственно (р0,01). Незначительное повышение концентрации общего белка происходило за счет глобулиновой, преимущественно и -глобулиновой фракций.
Что касается биохимических показателей сыворотки крови подопытных животных, то после введения полисахаридного препарата «Гемив» уровень глюкозы во всех группах повышается относительно исходных показателей. На 20 сутки исследований содержание глюкозы по сравнению с исходными данными в первой опытной группе было выше на 1,8 ммоль/л, во второй и третьей – на 0,6 и 0,4 ммоль/л соответственно.
Полученные результаты указывают на то, что полисахаридный препарат «Гемив» не токсичен при максимально вводимых дозах и благоприятно влияет на общее состояние животных, прирост живой массы, морфологические и биохимические показатели крови.
Как показали результаты опытов, изучаемый полисахаридный препарат «Гемив» не обладает раздражающими, аллергизирующими, эмбриотоксическими и тератогенными свойствами.
Следующая серия опытов была направлена на выявление оптимальной, более эффективной дозы и разработке режима применения полисахаридного препарата «Гемив». При сравнительной физиологической оценке действия различных доз полисахаридного препарата «Гемив» на организм крыс и кроликов при экспериментальном иммунодефиците, выявлена оптимальная доза - 126 мг/кг. Применение полисахаридного препарата «Гемив» в указанной дозе более выраженно стимулирует прирост массы тела и положительно влияет на весь организм и состав крови, в частности, при иммунодефицитном состоянии организма.
Для разработки режима применения, так же экспериментально, моделировали иммунодефицит у лабораторных животных с применением препарата циклофосфан. Лабораторным животным первой группы за три дня до введения иммунодепрессанта и через день после инъецировали «Гемив», а второй группы – через 3 дня после введения циклофосфана двукратно. Третья группа крыс не получала полисахарида. Четвертая группа – интактные животные.
В первой опытной группе резких изменений со стороны общего состояния, морфологических и биохимических показателей крови животных не наблюдали. Процентное соотношение всех элементов фракций белка, на всем протяжении эксперимента резко не отличались от исходных показателей и были в пределах физиологической нормы.
Вторая группа животных, которая получала полисахарид после применения иммунодепрессанта, имела отличительные результаты по сравнению с первой опытной группой. Так, на 7 день эксперимента, уровень -глобулинов был на 5,8 % выше и уровень -глобулинов на 2,2 % ниже по сравнению с исходными данными.
В группах, в которых применяли препарат циклоферон и полисахаридный препарат «Гемив», показатели крови незначительно снизились по сравнению с исходными цифрами, но к концу опыта восстановились и были в пределах физиологической нормы. Тогда как в контрольной группе животных показатели крови были ниже нормы до конца эксперимента.
После введения циклоферона и полисахаридного препарата «Гемив» наблюдали так же достоверное увеличение показателей Т и В-лимфоцитов в первой и во второй опытной группе. Полученные результаты свидетельствуют о том, что полисахаридный препарат «Гемив» и препарат циклоферон обладают иммуностимулирующими свойствами.
Производственные опыты были проведены в условиях КФХ «МИАКРО-КАРАТАУ Фермерское хозяйство» Республики Татарстан. Исследовали влияние полисахаридного препарата «Гемив» на иммунокомпетентные клетки периферической крови и титр антител при вакцинации кроликов против сальмонеллёза. Для этого были сформированы три группы животных: первой группе вводили полисахаридный препарат «Гемив» и вакцинировали против сальмонеллёза. Вторую группу животных вакцинировали без применения полисахаридного препарата «Гемив». Третья группа животных оставалась интактной. К концу эксперимента титр антител в первой группе, где вакцинацию проводили на фоне применения полисахаридного препарата «Гемив», был достоверно выше показателей контрольной группы на 0,59log2. После проведённых исследований относительного количества Т- и В – лимфоцитов установлено, что через 2 недели после сочетанной вакцинации с применением полисахаридного препарата «Гемив» уровень Т - лимфоцитов на 14 % был выше по сравнению с контрольной группой.
При оценке прироста кроликов во время вакцинации выявили достоверное увеличение живой массы в группе, в которой применяли полисахаридный препарат.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение полисахаридного препарата «Гемив» способствуют улучшению состояния обмена веществ и повышению показателей резистентности организма.
По завершению опыта провели ветеринарно-санитарную экспертизу мяса кроликов. Результаты проведённых исследований свидетельствуют о том, что органолептические, физико-химические и бактериоскопические показатели мяса кроликов, соответствуют стандартам ГОСТ 20235.0-74, предусмотренным для доброкачественного мяса кроликов.
Таким образом, иммунокоррекция с помощью полисахаридного препарата «Гемив» в современных условиях практического кролиководства представляется перспективной и позволит повысить эффективность профилактических мероприятий, снизить ущерб от заболеваемости сельскохозяйственных животных, обеспечить стойкое ветеринарное благополучие и значительно повысить неспецифическую резистентность кроликов.