Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Аналитический обзор литературы 10
1.1. Характер взаимодействия повреждений при комбинированных воздействиях 10
1.2. Закономерности проявления биологических эффектов после комбинированных воздействий 15
1.3. Математическая модель восстановления клеток 23
1.4. Математическая модель синергических взаимодействий 27
Глава 2. Материалы и методы исследования 33
2.1. Объект исследования 33
2.2. Используемые химические препараты 34
2.3. Источники ионизирующего излучения 36
2.4. Методика проведения экспериментов 37
2.5. Методы обработки результатов 38
Глава 3. Восстановление дрожжевых клеток после воздействия факторов различной природы и их комбинаций 42
3.1. Влияние химических сенсибилизаторов на радиочувствительность и восстановление дрожжевых клеток после действия ионизирующего излучения 42
3.2. Восстановление клеток после комбинированного действия химических препаратов с ионизирующим излучением и гипертермией 53
3.3. Восстановление клеток от повреждений после повторных воздействий ионизирующего излучения разного качества 56
Глава 4. Особенности взаимодействия химических препаратов и гипертермии 61
4.1. Проявление эффектов синергизма при одновременном действии гипертермии с цисплатином или циклофосфамидом на дрожжевые клетки 61
4.2. Влияние концентрации химических агентов на их синергическое взаимодействие с гипертермией 69
Глава 5. Восстановление клеток млекопитающих после комбинированных воздействий ионизирующих излучений и химических агентов 72
5.1. Влияние комбинированных воздействий на формирование необратимых повреждений,
но не на константу восстановления 73
5.2. Анализ комбинированных воздействий, влияющих на оба параметра, описывающие процесс пострадиационного восстановления клеток 79
5.3. Роль комбинированных воздействий в формировании первичных радиационных повреждений 83
Обсуждение 89
Заключение 98
Выводы 100
Список литературы
- Математическая модель восстановления клеток
- Источники ионизирующего излучения
- Восстановление клеток после комбинированного действия химических препаратов с ионизирующим излучением и гипертермией
- Влияние концентрации химических агентов на их синергическое взаимодействие с гипертермией
Математическая модель восстановления клеток
Тепловое воздействие является одним из важнейших факторов, определяющих жизнеспособность биологических объектов на всех стадиях их развития, поскольку скорости процессов метаболизма зависят от температуры среды. Повышенные температуры могут усиливать летальное действие ионизирующего излучения (Александров и др., 1980; Ярмоненко и др., 1992; Hornback, 1987; Vernon et al., 1996; Bicher and Al-Bussam, 2006; McCormick, 2007; Bath, 2014), УФ света (Tyrrell, 1976; Joshi et al., 1984), различных химических токсических соединений (Лисовский и др., 1994; Johnson, Pavelec, 1973; Wondergem et al., 1991; Engin et al., 1993; Issels et al., 2010) и ультразвука (ter Haar et al., 1980). Гипертермия, повышая радиочувствительность клеток, играет важную роль в лечении онкологических заболеваний, например, глиомы человека и других злокачественных опухолей (Александров и др., 1980; Fowler, 1979; Карр et al., 1990; Perez et al., 1991; Emami et al., 1992; van der Zee et al., 2000; Vasanthan et al., 2005; Mitsumori et al., 2007).
Существуют две области температур различного действия: температура размножения и роста клеток и температура, вызывающая летальные изменения в них. Известно, что дрожжевые клетки не чувствительны к температурам вплоть до 37 С и даже несколько выше (Мунблит и др., 1985; Forsburg, 2001). Было показано, что термочувствительные дрожжевые клетки инактивируются при температурах 40-45 С, а термоустойчивые - при температурах выше 45С (Петин, 1977). Была изучена кинетика восстановления дрожжевых клеток дикого типа после действия одного ионизирующего излучения и в комбинации с гипертермией (Petin and Berdnikova, 1979; Petin and Kim, 2004). В этих работах было показано, что объем и скорость восстановления клеток уменьшались с увеличением температуры, при которой происходило облучение. Наибольший коэффициент синергического взаимодействия (k = 2,7) был получен для клеток, способных к восстановлению двунитевых разрывов ДНК. Для гаплоидных штаммов дрожжей, не обладающих такой способностью при выдерживании облученных клеток в непитательной среде, коэффициент синергического взаимодействия был равен 1,3. Синергическое взаимодействие полностью отсутствовало для мутантных клеток (rad52/rad52), неспособных к восстановлению двойных разрывов ДНК (Петин, 1977). Совокупность этих данных указывает на то, что механизмы синергического взаимодействия тепла и ионизирующего излучения могут быть связаны с подавлением способности клеток восстанавливаться от повреждений, формируемых при комбинированном действии этих двух факторов.
Хотя первые попытки использования нагревания для лечения опухолей относятся к концу XIX - началу XX века (Dietzel, 1975; Hornback, 1987; Карр et al., 1988; Scott et al., 1988), систематическое изучение и значительное внимание к этому фактору возникало сравнительно недавно, благодаря, с одной стороны, обнаружению синергического взаимодействия повреждений, индуцированных гипертермией и ионизирующим излучением в культивируемых клетках млекопитающих и злокачественных новообразованиях, а с другой разработке способов формирования контролируемого локального нагревания опухолей (Морозов и др., 1984; Лысцов и Самойленко, 1985; Петин и др., 1996; Курпешев и др., 2012; Brannen, 1975; Vasanthan et al., 2005; Mitsumori et al., 2007; Hulshof et al., 2009; Issels et al., 2010).
Повышенное внимание и интерес к исследованию гипертермии на различных уровнях организации, начиная от молекулярного и кончая организменным, обусловлен большим числом наблюдений (Hornback, 1987; Scott et al., 1988; Vernon et al., 1996; Roussakow, 2013; Bath, 2014; Русаков, 2014), наиболее важные из которых можно суммировать следующим образом:
1. Тепловая обработка может приводить к инактивации клеток, причем опухолевые клетки более чувствительны к теплу, чем нормальные. Отметим, что результаты недавних исследований (Русаков, 2014; Bath, 2014) показывают, что это свойство не является универсальным для всех опухолей.
2. Известно сенсибилизирующее действие тепла на инактивацию клеток при воздействии на них ионизирующего излучения, которое выражено в большей степени для опухолевых клеток. Благодаря этому фактор терапевтического выигрыша (ФТВ) при комбинированном действии ионизирующего излучения и гипертермии составляет около 1,5-2,0, что значительно превышает значения этого фактора при использовании в лучевой терапии электроноакцепторных соединений и плотноионизирующих излучений (ФТВ равен 1,3-1,6).
3. Наиболее резистентные гипоксические клетки являются более чувствительными к теплу, чем оксигенированные, поэтому радиосенсибилизация гипертермией более выражена для гипоксических клеток.
4. Радиорезистентная S-фаза клеток является наиболее чувствительной к температуре, и поэтому радиосенсибилизация гипертермией более выражена для клеток, находящихся в этой стадии роста; наоборот, наиболее радиочувствительный G2 -период и митоз являются наиболее устойчивыми к воздействию нагревания. Таким образом, при комбинированном действии гипертермии и ионизирующего излучения сглаживаются различия в зависимости чувствительности клеток от фазы клеточного цикла. 5. Гипертермия подавляет восстановление от сублетальных и потенциально летальных повреждений, индуцированных ионизирующим излучением. Поскольку пострадиационная репарация выражена в меньшей степени при действии плотноионизирующих излучений, синергический эффект гипертермии и ионизирующих излучений отсутствовал или был менее выражен при использовании плотноионизирующих частиц.
Наиболее детально количественные закономерности проявления одновременного или последовательного действия гипертермии с ионизирующим излучением, УФ светом и ультразвуком описаны в работе (Петин и др., 2012). В этой работе описан большой комплекс ранее неизвестных универсальных закономерностей синергического взаимодействия различных факторов окружающей среды, проявление которых не зависит от применяемых в комбинации агентов, анализируемого эффекта и используемых объектов. Кратко эти закономерности и вытекающие из них следствия могут быть резюмированы следующим образом.
1. Для любой постоянной мощности дозы ионизирующего излучения или интенсивности другого физического фактора синергизм при их одновременном применении с гипертермией может наблюдаться только в пределах некоторого температурного диапазона.
2. Внутри этого диапазона температур, имеется специфическая температура, которая обеспечивает максимальное синергическое взаимодействие.
3. Диапазон температур, синергически взаимодействующих с физическими и химическими агентами, смещается в область более низких температур при снижении интенсивности используемых агентов.
4. Повышение температуры, при которой происходит одновременное действие гипертермии с физическими и химическими факторами, выше оптимального значения, приводит к снижению эффективности синергического взаимодействия. При этом регистрируемый эффект в большей степени индуцируется самой повышенной температурой.
5. Понижение температуры ниже оптимальной также приводят к снижению эффективности синергического взаимодействия, при этом наблюдаемый эффект обусловлен главным образом действием физического или химического агента, а не температуры.
6. Скорость и объем восстановления клеток после комбинированных воздействий, когда наблюдается синергическое взаимодействие, существенно уменьшаются, при этом доля необратимых повреждений (необратимый компонент) при терморадиационных воздействиях увеличивается при повышении термической нагрузки.
7. Константа восстановления, характеризующая вероятность восстановления клеток от радиационных повреждений в единицу времени, не зависит от температуры, при которой происходит облучение клеток ионизирующим излучением или УФ светом.
Источники ионизирующего излучения
Использованные в экспериментах диплоидные дрожжевых клетки являются простейшей моделью эукариотических клеток, которые характеризуются наличием ядра и хромосом, способностью клеток восстанавливаться от повреждений, индуцированных ионизирующим излучением или УФ светом. Благодаря меньшему объему хромосом (мишени) дрожжевых клеток, по сравнению с клетками млекопитающих, они являются более резистентными к действию ионизирующей радиации. Важно отметить, что большинство радиобиологических реакций дрожжевых клеток (форма кривой выживаемости, зависимость ОБЭ от ЛПЭ, кислородный эффект, действие радиопротекторов и радиосенсибилизаторов) качественно являются похожими на реакции культивируемых клеток млекопитающих (Van der Kogel and Joiner, 2009; Petin and Kim, 2014; Petin and Kapultsevich, 2014). Именно поэтому совокупность результатов, представленных в данной работе, указывает на перспективность одновременного использования в клинике препаратов с различными механизмами повышения радиочувствительности - через влияние на необратимый компонент радиационного поражения, через влияние на константу восстановления или через повышенную вероятность формирования первичных радиационных повреждений.
В опытах использовали диплоидные дрожжевые клетки Saccharomyces cerevisiae, штамм XS800. Радиобиологические характеристики этого штамма хорошо изучены. По современным представлениям дрожжи - сборная группа одноклеточных микроорганизмов, относящихся к разным классам грибов. В основном дрожжи входят в класс аскомицетов. Они имеют разнообразную форму, размножаются как вегетативным, так и половым путем. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae (сахаромицеты) относятся к почкующимся, а виды рода Schizosaccharomyces и рода Endomyces - к делящимся.
В качестве объекта дрожжи сахаромицеты обладают рядом преимуществ и уникальных свойств, к которым относятся простота культивирования, высокая скорость размножения, наличие стадий в цикле развития, характерных для клеток млекопитающих и смена которых легко контролируется в эксперименте. Дрожжи могут быть использованы как тест - объект для выявления и испытания мутагенов - химических веществ, накопление которых в окружающей среде угрожает здоровью людей. Дрожжевые клетки являются простейшими из эукариотов, строение которых сходно с клетками высших организмов. Дрожжи представлены одноядерными клетками, которые в норме могут быть гаплоидными и диплоидными. У сахаромицетов генетически показано не менее 17 хромосом. Их плоидность можно надежно определить по содержанию ДНК на клетку. Дрожжи являются уникальным объектом, у которого возможно получение полиплоидных штаммов вплоть до октоплоида, что позволяет проводить эксперименты с клетками разной плоидности. Вегетативные клетки штаммов, выделяемые из природных популяций или используемые в производстве, как правило, диплоиды. При микроскопировании гаплоидных и диплоидых клеток можно выявить некоторые различия - гаплоидиные клетки обычно мельче диплоидных и имеют сферическую форму и при почковании часто образуют характерные комки: диплоидные клетки несколько крупнее, овальной формы и меньше комкуются при почковании. Однако размер клеток и степень комковатости почкующейся культуры зависит не только от плоидности штаммов, но и от генотипа, поэтому цитологические наблюдения не могут служить методом определения плоидности культуры.
Диплоидные дрожжевые клетки использованы в качестве тест объекта по нескольким причинам. Во-первых, закономерности пострадиационного восстановления хорошо изучены для дрожжевых клеток как на клеточном (Корогодин, 1966; Korogodin, 1993), так и на молекулярном уровнях (Brendel and Haynes, 1973; Luchnik et al., 1977). Во-вторых, первые доказательства способности эукариотических клеток к восстановлению от радиационных повреждений были впервые получены именно для этих клеток (Корогодин, 1958, Patrick and Haynes, 1964). В-третьих, известна математическая модель, количественно описывающая процесс пострадиационного восстановления дрожжевых клеток, выдерживаемых после облучения в непитательной среде (Капульцевич, 1978; Korogodin, 1993). Эта модель позволяет оценивать константу восстановления, характеризующую вероятность восстановления в единицу времени, а также долю необратимо пораженных клеток.
В качестве химических агентов использовали следующие препараты по отдельности и в комбинации с ионизирующим излучением и/или гипертермией. Препарат присутствовал во время облучения и после него весь период пострадиационного восстановления клеток в различных концентрациях. Данные препараты выбраны нами не случайно: их свойства довольно хорошо описаны в литературе, они имеют широкое применение в клинике (ссылки). В этих работах отмечается, что препараты в некоторых случаях присутствуют в момент облучения, однако в большинстве исследований препараты использовали однократно или многократно (в случае фракционированного облучения) после радиационного воздействия для подавления способности клеток к пострадиационному восстановлению. Цисплатин (другое название цис-ДДП, производство ООО «ЛЭНС-ФАРМ», Россия) -комплекс платины, который в настоящее время широко применяется в медицине как противораковое средство. Данный препарат обладает выраженными цитотоксическими, бактерицидными и мутагенными свойствами. В основе его биологических свойств лежит способность соединения образовывать прочные специфические связи с ДНК. Этот комплекс платины в настоящее время широко применяется в медицине как противораковое средство. Фармакологическое действие - противоопухолевое, алкилирующее, цитостатическое, иммунодепрессивное. Механизм действия подобен действию других алкилирующих препаратов и заключается в нарушении функций ДНК, вызванном химическим повреждением оснований ДНК. Химическое повреждение ДНК образуется путем образования координационных связей между атомом платины и двумя основаниями ДНК (преимущественно гуаниновыми), в результате чего в ДНК образуются внутри- и межнитевые сшивки. На клеточном уровне цисплатин вызывает нарушение репликации и транскрипции, что ведёт к задержке клеточного цикла и апоптозу. Для проведения опытов использовали цисплатин в концентрации 0,25 и 0,5 мг/мл, а также 0,002; 0,01 и 0,02 мг/мл.
Циклофосфамид (другие названия циклофосфан, эндоксан, производство Бакстер Онкология ГмбХ, Германия) является алкилирующим цитостатическим препаратом, по химическому строению близкий к азотным аналогам иприта. Механизм действия заключается в образовании ковалентных связей с нуклеофильными соединениями и алкилировании структурных элементов ДНК (пурины, пиримидины). А также образует поперечные сшивки между нитями ДНК и РНК, и ингибирует синтез белка.
Блеоцин (другое название блеомицин, производство «Ниппон Кайяку Ко., Лтд.», Япония) цитостатический препарат, гликопептидный антибиотик, синтезируемый бактериями Streptomyces verticillus. и представляет собой смесь структурно связанных водорастворимых солей гликопептидных антибиотиков. В основе механизма действия Блеоцина лежит фрагментация ДНК, разрушение ее спиралевидной структуры, что ведет к торможению деления клетки. В меньшей степени Блеоцин влияет на РНК и синтез белка. Блеоцин обычно применяют в сочетании с другими цитостатиками и/или лучевой терапией для лечения различных форм рака.
Доксорубицин (другое название доксорубицин-Тева, производство ТЕВА Фармацевтические Предприятия Лтд., Израиль) является противоопухолевым антибиотиком антрациклинового ряда, выделенный из культуры Streptomyces peucetius var. caesius. Оказывает антимитотическое и антипролиферативное действие. Механизм действия заключается во взаимодействии с ДНК, образовании свободных радикалов и прямом воздействии на мембраны клеток с подавлением синтеза нуклеиновых кислот. Доксорубицин может применяться как в качестве монотерапии, так и в комбинации с другими цитостатиками в различных дозах.
В работах других авторов, данные которых мы использовали для расчетов, использовались такие препараты как камптотецин (КПТ), дифтормитилорнитин (ДФМО), метилглиоксаль-бис-гуанилгидразон (МГБГ), цис-ДДП, 5 -йоддеоксиуридин, пируват натрия, новобиоцин, лактат натрия, налидиксовая кислота, 3-аминобензамид, ара-А, гидроксимочевина и соли тяжелых металлов (ZnCb, NiCb и C11SO4). Методики данных экспериментов описаны в соответствующих главах.
Восстановление клеток после комбинированного действия химических препаратов с ионизирующим излучением и гипертермией
Известно, что помимо восстановления от сублетальных повреждений, клетки способны восстанавливаться от потенциально летальных повреждений, которые могут вносить вклад в изменение радиочувствительности клеток опухоли. В большинстве исследований, посвященных этой проблеме, под восстановлением от потенциально летальных повреждений понимают восстановление клеток, происходящее после облучения в непитательной среде (Корогодин, 1966; Li et al., 1976; Leith et al., 1977; Jorritsma and Konings, 1983; Kumar et al., 1985a, 1985b; Hall, 1988; Raaphorst et al., 1988; Little et al., 1989; Raaphorst et al., 1991). Было показано, что такое восстановление может происходить и на питательной среде до завершения первого пострадиационного восстановления (Корогодин, 1966; Капульцевичи др., 1974), после которого происходит реализация потенциально летальных повреждений. В этих работах показано, что для дрожжевых клеток это время составляет 2-4 часа. Первое пострадиационное деление клеток млекопитающих завершается через 6-8 часов (Ярмоненко и др., 1992). Следовательно, в течение этого времени инактивируемые опухолевые клетки могут восстанавливаться от потенциально летальных повреждений. Однако в литературе имеется недостаточно информации по изменению радиочувствительности и способности клеток к восстановлению от потенциально летальных повреждений после повторных облучений (Hall and Giaccia, 2006).
Ранее было показано, что при повторных у-облучениях клеток дрожжей, их способность к восстановлению от радиационных повреждений снижалась с ростом количества последовательных облучений (Корогодин, 1966). Однако в той работе параметры пострадиационного восстановления количественно не оценивались, более того в литературе отсутствуют данные о восстановлении клеток от потенциально летальных облучений после повторных облучений плотноионизирующим излучением. Поэтому данный раздел работы посвящен изучению способности дрожжевых клеток к восстановлению от потенциально летальных радиационных повреждений после повторных воздействий ионизирующими излучениями различного качества.
Математическую модель пострадиационного восстановления (Блэр, 1955; Дэвидсон, 1960) ранее применяли для оценки параметров восстановления облученных животных, а также бактерий, дрожжевых клеток и культивируемых клеток млекопитающих после действия ионизирующих излучений (Корогодин, 1966; Капульцевич, 1978), ультрафиолетового света (Кабаков и Корогодин, 1966). Также опубликованы данные об использовании этой методологии для описания процессов восстановления дрожжевых клеток и культивируемых клеток млекопитающих после комбинированных воздействий различных физических и химических факторов (Комарова и др., 2002; Солодкова и др., 2012; Kim et al., 2004; Petin and Kim, 2004; Kim et al., 2005). В данном разделе работы эта модель была использована для количественной оценки параметров восстановления дрожжевых клеток от потенциально летальных повреждений после повторных воздействий ионизирующих излучений различного качества.
На рис. 16 представлены зависимости выживаемости клеток от дозы у-облучения и кривые зависимости выживаемости от продолжительности восстановления в непитательной среде диплоидных дрожжей штамма XS800. Далее для простоты эти кривые будем называть кривыми выживаемости и кривыми восстановления соответственно. На этом рисунке представлены данные после первого облучения у-квантами ( Со) и восстановления (А), а так же данные после повторного (Б) и третьего облучения (В).
Аналогичные данные после а-облучения приведены на рис. 16. В таблице 3 приведены результаты количественной оценки широко распространенных в количественной радиобиологии среднелетальных доз .Do(Y) и D0(a) кривых выживаемости до и после полного восстановления клеток после различного числа повторных облучений. Среднелетальная доза - доза, снижающая выживаемость в Є = 2,72 раза на прямолинейном участке кривых выживаемости, представленных в полулогарифмическом масштабе.
Кривые выживаемости, полученные сразу после облучения (темные кружки) и после полного восстановления в непитательной среде (светлые кружки) и кривая восстановления в динамике (светлые квадраты) диплоидных дрожжевых клеток штамма XS800 после у-облучения (1200 Гр). А - первое облучение, Б - второе облучение, В - третье облучение
В этой же таблице суммированы данные количественной оценки константы восстановления Р формула (10) и необратимого компонента К формула (7) после различного числа повторных воздействий редко- и плотноионизирующим излучением. Видно, что повторные воздействия обоими видами излучений не вносили изменений в радиочувствительность (\/D0) клеток.
Из данных, приведенных на рис. 16 и 17, видно замедление процессов восстановления и снижение уровня, до которого восстанавливаются клетки при повторных облучениях. Этот эффект был особенно ярко выражен после действия излучения с высокой ЛПЭ: после повторного облучения восстановление резко замедлилось, а после третьего - полностью прекратилось. Оба эти эффекта могли быть обусловлены либо увеличением доли необратимо пораженных клеток, либо поражением самого процесса восстановления (снижение вероятности восстановления р ), либо оба эти процесса происходили одновременно.
Кривые выживаемости, полученные сразу после облучения (темные кружки) и после полного восстановления (светлые кружки) и кривая восстановления в динамике (светлые квадраты) диплоидных дрожжевых клеток штамма XS800 после а-облучения (400 Гр). А -первое облучение, Б - второе облучение, В - третье облучение Чтобы дифференцировать эти возможности, мы на основании данных, приведенных на этих рисунках, количественно оценили зависимость доли необратимо пораженных клеток K{t) (уравнение 6), а также относительную часть A(t) репарируемых повреждений, которые не были восстановлены после t часов восстановления (9), от продолжительности восстановления. Эти данные позволили нам рассчитать значения необратимого компонента К и константы восстановления р. Эти результаты также представлены в таблице 3. Видно, что значение Р не зависит от числа повторных облучений и несколько уменьшается после воздействий излучения с высокой ЛПЭ по сравнению с редкоионизирующим излучением. Необратимый компонент радиационного поражения К несколько возрастает после третьего воздействия излучения с низкими ЛПЭ и значительно возрастает после действия плотноионизирующего излучения, вплоть до полного прекращения пострадиационного восстановления после третьего воздействия.
Увеличение доли необратимо пораженных клеток после повторных облучений может происходить по двум причинам: либо вследствие образования радиационных повреждений, от которых клетки не могут восстанавливаться, либо вследствие угнетения самого процесса восстановления. Как видно из таблицы 3, для обоих видов излучения, вне зависимости от количества повторных воздействий, Р изменяется в незначительной степени. Это означает, что сам процесс пострадиационного восстановления не нарушается после действия как редко-, так и плотноионизирущих излучений. Это соответствует ранее опубликованным результатам (Petin and Kabakova, 1981), полученным на большом количестве штаммов дрожжевых клеток.
Таким образом, приведенные данные показывают, что возрастание доли необратимо поврежденных клеток с ростом ЛПЭ излучения в меньшей степени связано с нарушением систем репарации, а в большей степени - с необратимым компонентом радиационного повреждения, т.е. формированием более «тяжелых» повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться.
Влияние концентрации химических агентов на их синергическое взаимодействие с гипертермией
В настоящее время невозможно однозначно ответить, какие из известных молекулярных путей репарации ответственны за тот или иной тип восстановления, проявляющийся феноменологически на клеточном уровне. Более того, до тех пор, пока не расшифрованы молекулярные механизмы этих явлений, вопрос об их различии или идентичности не может быть решен (Петин, 1987). Однако известно, что процессы ферментативного восстановления эффективно работают у дрожжей лишь при наличии в клетках гомологичных хромосом. Это может означать, что процесс восстановления сходен с процессом рекомбинации и нуждается в коньюгации хромосом-гомологов. Не исключено, что другие формы восстановления, например восстановление ДНК от одиночных разрывов, могут в равной мере осуществляться у гаплоидных и диплоидных дрожжевых клеток. Форма восстановления, связанного с наличием двух наборов хромосом, может проявляться в ликвидации повреждений, например двойных разрывов ДНК, приводящих к хромосомным аберрациям. Как уже отмечалось, лишь диплоидные клетки способны восстанавливаться от двойных разрывов ДНК, а гаплоидные клетки и диплоидные, гомозиготные в отношении некоторых гай?-локусов, не обладают такой способностью.
Ранее была предложена модель репарации двутяжевых разрывов ДНК, включающая рекомбинацию (Resnik, 1976). Суть этой модели следующая. В месте образования двутяжевого разрыва тяжи частично деградируют в противоположных направлениях под влиянием эндонуклеаз. Остатки поврежденных молекул, образуя гетеродуплекс, связываются комплементарно с тяжами неповрежденной ДНК, в которой образуются эндонуклеазные разрывы, и синтезируют часть собственных тяжей на их матрице. Затем происходит реконструкция поврежденной и неповрежденной молекул, репаративный синтез недостающих ферментов поврежденной ДНК и окончательное восстановление исходной структуры. В другом варианте этой же модели после образования гетеродуплекса между тяжами интактной и поврежденной молекул происходит эндонуклеазный разрыв тяжей, удерживающих гетеродуплекс, и репаративный синтез недостающих фрагментов в рекомбинантных молекулах. Возможно, что именно этот тип ферментативной репарации является ответственным за наблюдавшуюся в данной работе модификацию радиочувствительности дрожжевых клеток через формирование дополнительных необратимых повреждений и/или снижение константы восстановления.
Для подтверждения общности выявленных закономерностей комбинированного действия ионизирующего излучения с радиосенсибилизаторами были привлечены обширные данные, опубликованные в литературе другими авторами для культивируемых клеток млекопитающих различного происхождения, подвергавшихся комбинированному воздействию ионизирующего излучения с химическими агентами. Показано, что механизм повышения радиочувствительности культивируемых клеток млекопитающих рядом химических радиосенсибилизаторов, повышающих радиочувствительность клеток различного происхождения в 2-5 раз, не связан с нарушением самого процесса восстановления, а обусловлен, главным образом, формированием необратимых радиационных повреждений, от которых клетки не способны восстанавливаться. Именно такие закономерности были получены в наших экспериментах с дрожжевыми клетками, подвергавшихся воздействию ионизирующего излучения с химическими препаратами.
Представляло интерес провести поиск химических агентов, которые влияли бы на константу восстановления. Методологической основой такого поиска являлось предположение, что использование радиосенсибилизаторов с различными механизмами действия могло быть более эффективным по сравнению с действием каждого из них в отдельности или для достижения того же самого биологического эффекта можно использовать меньшие концентрации этих веществ. В результате проведенных исследований было показано, что для клеток HeLa некоторые химические соединения (хлорид цинка, дифторметилорнитин, метилглиоксаль-бис-гуанилгидразон) оказывали влияние не только на формирование необратимых повреждений, но и на сам процесс восстановления, выразившийся в уменьшении константы восстановления. В случае использования цисплатина, дифторметилорнитина, солей никеля и камптотецина радиочувствительность культивируемых клеток млекопитающих различного происхождения повышалась, однако при этом константа восстановления и необратимый компонент не отличались от контроля. Это означает, что повышение радиочувствительности в этих случаях было обусловлено большей вероятностью формирования первичных радиационных повреждений, в то время как константа восстановления и доля необратимых повреждений не отличались от этих параметров при действии одного ионизирующего излучения.
Ранее выявленные универсальные закономерности проявления синергизма после терморадиационных воздействий (Петин и др., 2012; Petin and Kim, 2014) в данной работе подтверждены для комбинированных действий химических агентов с гипертермией - наличие оптимальной температуры для проявления максимального синергизма, а также его зависимость от концентрации препаратов - чем меньше их концентрация, тем при меньшей температуре регистрируется максимальный синергический эффект. Эти закономерности можно легко интерпретировать с использованием математической модели синергизма, описанной в обзоре литературы данной работы. В соответствии с концепцией синергизма и ее математической формулировкой (Петин и др., 2012; Petin and Komarov, 1996; Petin and Kim, 2004; Petin and Kim 2014), механизм синергического взаимодействия обусловлен формированием дополнительных эффективных повреждений за счет взаимодействия некоторых субповреждений, неэффективных при раздельном применении агентов, использованных при комбинированных действиях. Тогда, повышение коэффициента синергического усиления с ростом температуры будет обусловлен возрастанием числа термических повреждений и соответственно субповреждений, ответственных за синергическое взаимодействие. Максимум синергического взаимодействия достигается при равенстве числа субповреждений, сформированных за счет гипертермии и химических факторов (19). Дальнейшее повышение температуры приводит к значительному повышению числа термических субповреждений и уменьшению числа субповреждений, индуцированных химическими соединениями. В результате такого характера изменения числа субповреждений коэффициент синергического усиления проходит через максимум (рис. 38 и 39).
Модель синергизма не рассматривает молекулярную природу субповреждений и механизм их взаимодействий не конкретизировался. Фактически, в соответствии с моделью, наличие в клетке двух субповреждений, индуцированных разными агентами, приводило к образованию одного дополнительного эффективного повреждения. В модели указывается эмпирический способ оценки числа субповреждений на одно эффективное повреждение от каждого агента, исходя из реальных экспериментальных значений (15) и (17). Это означает, что модель учитывает реально существующие взаимодействия, определяющее синергический эффект. Ясно, что для разных воздействующих агентов, используемых в биологических объектах и регистрируемых тестах, молекулярная природа субповреждений должна быть разной. Хотя в настоящее время известны многие молекулярные повреждения, которые могли бы претендовать на роль субповреждений при действии различных вредных факторов окружающей среды, на современном этапе возможны только гипотетические высказывания о молекулярной природе субповреждений (Chadwick and Leenhouts, 1981).
С позиции изложенной математической модели можно объяснить, чем обусловлено смещение температурного диапазона, в пределах которого наблюдается синергическое взаимодействие, в область более высоких температур с повышением концентрации используемых препаратов. Поскольку в обсуждаемых результатах происходило одновременное действие гипертермии и химических агентов, то повышение концентрации препаратов означает увеличение числа субповреждений от этих факторов и соответствующее нарушение условия достижений максимального синергизма (формула 19). Чтобы это условие выполнялось, необходимо повысить число термических субповреждений, что может быть обеспечено только повышением действующей температуры.