Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 14
1.1 Актуальные проблемы профилактики острых лучевых поражений 14
1.2 Особенности применения противолучевых средств в лучевой терапии новообразований 22 1.3 Вазоактивные средства в качестве радиомодификаторов 27
1.4 Перспективность применения регуляторов синтеза оксида азота для модификации радиобиологических эффектов 28
1.4.1 Роль оксида азота в физиологических процессах, участвующих в развитии лучевых эффектов 28
1.4.2 Фармакологические модификаторы синтеза оксида азота 33
ГЛАВА 2 Материалы и методы исследования 37
2.1 Лабораторные животные 37
2.2 Использованные соединения 38
2.3 Методы исследований 40
2.4 Статистическая обработка результатов 44
ГЛАВА 3 Результаты исследований 45
3.1 Исследование острой токсичности изучаемых М-ацил-Б-алкил-замещённых изотиомочевин 46
3.2 Исследования влияния изучаемых ТчГ -замещённых изотиомочевин и фармакологических доноров NO на гемодинамику нормотензивных животных 50
3.3 Противолучевые свойства изучаемых N,S-замещённых изотиомочевин 57
3.3.1 Сравнительная оценка противолучевой активности по тесту 30-суточной выживаемости животных 57
3.3.2 Экспериментальная оценка показателей противолучевой активности соединения Т1023 64
3.3.3 Изучение фармако динамического взаимодействия соединения Т1023 с радиопротекторами различных классов 70
3.3.4 Изучение фармако динамического взаимодействия соединения Т1023 с донорами оксида азота 76
3.4 Исследование способности изучаемых N,S-замещённых изотиомочевин к селективной защите нормальных тканей при лучевой терапии опухолей... 78
ГЛАВА 4 Обсуждение полученных результатов 89
Выводы 99
Список литературы
- Перспективность применения регуляторов синтеза оксида азота для модификации радиобиологических эффектов
- Использованные соединения
- Сравнительная оценка противолучевой активности по тесту 30-суточной выживаемости животных
- Исследование способности изучаемых N,S-замещённых изотиомочевин к селективной защите нормальных тканей при лучевой терапии опухолей...
Перспективность применения регуляторов синтеза оксида азота для модификации радиобиологических эффектов
Феномен противолучевой защиты с помощью химических соединений впервые был обнаружен в 1942 г. Вальтер Дейл (Англия) показал, что такие вещества как формиат, метил-а-О-глюкопиранозид, глюкоза и др. снижают инактивацию карбоксипептидазы и оксидазы D-аминокислот рентгеновскими лучами [Dale W.M., 1942]. В то же время французские исследователи выявили, что гипоксия является фактором повышения радиорезистентности [Lacassagne А., 1942]. В 1949 г. 3. Бак и А. Эрв сообщили, что цианистый натрий при введении мышам в количестве 5 мг/кг непосредственно перед облучением в летальных дозах повышал выживаемость мышей по сравнению с контролем. По данным Г. Патта повышение выживаемости мышей наблюдалось после инъекций цистеина в дозе 1000 мг/кг [Ярмоненко СП., Вайнсон А.А., 2004]. Бак увеличил эффективность этой аминокислоты, активировав функцию NH2 путём удаления карбоксильной группы [Бак 3., 1968]. Продукт декарбоксилирования цистеина -цистеинамин или цистеамин (МЭА) оказался более активным, чем сам цистеин. В 1950 г. также были выявлены противолучевые свойства у глутатиона (GSH) [Chapman W.A., 1950]. Разработка эффективных радиопротекторов стала одной из приоритетных задач радиобиологии. Были изучены противолучевые свойства десятков тысяч соединений [Бак 3., 1968] и к настоящему времени нет химического класса, в котором не был бы произведён поиск радиозащитных средств. Наиболее интенсивно подобные исследования проводились в годы холодной войны в США и СССР. В той или иной степени противолучевые свойства были выявлены у 50 тысяч соединений, однако, лишь немногие из них оказались применимы у человека [Гугушвили Б.С, 1987].
Одним из наиболее эффективных радиопротекторов оказался дисульфид цистеамина - цистамин, в то время как цистин (дисульфид цистеина) оказался полностью неактивным. Также были выделены: меркаптопропиламин (Е.Ф. Романцев), серотонин (Г. Лангендорф), мексамин (П.Г. Жеребченко, Н.Н. Суворов), аминоэтилизотиуроний (Г. Доэрти), аминоалкилтиофосфаты (П.Г. Жеребченко, СП. Ярмоненко, И.Л. Кнунянц), индралин (М.В. Васин) и др. [Ярмоненко СП., Вайнсон А.А., 2004]. Такие вещества являются незаменимыми средствами для защиты работников и населения от действия ионизирующего излучения при техногенных авариях, для защиты здоровых тканей при радиотерапии опухолей, для защиты военного персонала от воздействия радиации при применении ядерного оружия, для защиты космонавтов от облучения при космических полётах, и, наконец, радиопротекторы могут быть использованы в качестве инструмента для исследования механизмов биологического действия ионизирующих излучений. Однако нежелательные эффекты радиопротекторов являются серьёзным ограничением для их практического применения [Кудряшов Ю.Б., 1999; 2000; Гребенюк А.Н., 2011; Ильин Л.А., 2012; Васин М.В., 2013; Рождественский Л.М., 2013].
В 1950-е годы сразу после открытия первых радиозащитных средств был проведён интенсивный поиск эффективных радиопротекторов. Подобные средства, в первую очередь, должны в короткий срок выраженно повышать радиорезистентность биологических объектов при введении в дозах, не оказывающих токсических эффектов. Не менее важными требованиями, предъявляемыми к потенциальным радиопротекторам, являются: химическая стабильность и удобство применения, эффективность защиты не только при остром, но и при хроническом облучении, а также при воздействии различных видов ионизирующих излучений. Однако после многолетних исследований десятков тысяч соединений стала казаться иллюзорной возможность создания такого средства для применения, например, в военных целях и в 1980-е годы количество подобных исследовательских проектов резко сократилось [Кудряшов Ю.Б., 1999].
В то же время, предметом интереса для радиобиологов стали различные биологически активные препараты как природного, так и синтетического происхождения, противолучевая активность которых при этом не является основной среди прочих проявлений фармакологической активности, в отличие от радиопротекторов. Такие средства разделяют на препараты длительного действия, реализующие свой эффект путём изменений функционального состояния ряда систем организма, способствующих ускорению пострадиационного восстановления миелопоэза, и препараты, повышающие резистентность организма к облучению и к другим неблагоприятным факторам среды за счёт усиления антиоксидантной системы организма [Васин М.В., 2010]. К первым относятся стероидные гормоны и их синтетические аналоги, цитокины (интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухолей, гранулоцитарномакрофагальный колониестимулирующий фактор), адъюванты иммунологических реакций (вакцины, эндотоксины, полисахариды и пептидогликаны), полинуклеотиды (дезоксинат), иммунорегуляторные пептиды (тималин, тимоген, миелопид, тактивин, тимоптин), ацилгидразоны и цитостатические соединения. Ко второй группе препаратов относятся антиоксиданты (витамины А, С, Е, биофлавоноиды, эссенциальные фосфолипиды и микроэлементы, супероксиддисмутаза и др.), природные субстратные стимуляторы синтеза белка и нуклеиновых кислот (нуклеотиды, нуклеинат натрия, оротовая кислота и её производные, рибоксин и др.), аминокислоты и аминокислотно-витаминные препараты (аминотетравит, амевис, глутамевит), природные адаптогены (препараты женьшеня, элеутерококка, китайского лимонника, препараты прополиса и др.), пищевые добавки. Основными преимуществами таких средств являются низкая токсичность и длительность проявления противолучевой активности. Основной недостаток - низкая противолучевая эффективность [Васин М.В., 2010; 2013; Гребенюк А.Н. 2011; 2012].
Использованные соединения
Оценку острой токсичности новых веществ проводили в соответствии с Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств [Миронов А.Н., 2012] экспресс-методом Прозоровского [Прозоровский В. Б., 1978] и пробит-логарифмическим методом Литчфильда-Уилкоксона. [Беленький М.Л., 1961]. Эксперименты поведены на самцах мышей-гибридов Fi (CBAxC57Bl/6j).
В ходе исследований фиксировали общее состояние животных, обращали внимание на состояние слизистых оболочек носа, кожи и шерсти, характер дыхания, особенности поведения и уровень двигательной активности, наличие состояния беспокойства, возбудимости, переход в боковое положение или развитие судорог, регистрировали сроки развития интоксикации и время наступления летального исхода. Наблюдение за экспериментальными животными длилось не менее 14 суток. На основании данных по выживаемости мышей оценивали острую токсичность соединений по параметрам ЛДі6, ЛД5о, ЛД84.
Исследования вазотропной активности веществ проводили на крысах-самцах Wistar по 7-8 животных в каждой группе. Наркотизированным животным устанавливали трахеостому, катетеризировали ярёмную вену и левую сонную артерию, подключали инвазивные датчики давления и электроды ЭКГ. С помощью полиграфа RM-6000 (Nihon Kohden, Япония) и кардиографа (Nihon Kohden, Япония), регистрировали значения частоты сердечных сокращений (ЧСС), дыхательных движений (ЧДД), систолического и диастолического артериального давления (АДс и АДд) в левой сонной артерии. Измеряли минутный объём крови (МОК) методом термодилюции по [Филимонова М.В., 1999]
После регистрации исходных показателей животным в/б вводили растворы исследуемых соединений и продолжали мониторинг физиологических показателей в течение 60-120 минут. В дальнейшем, при анализе гемодинамики проводили расчёт стандартных показателей - сердечного индекса (СИ), ударного объёма (УО) и удельного периферического сопротивления сосудов (УПСС) по следующим формулам [Антонов А.А., 2004]: СИ = МОК/ППТ; УО = МОК/ЧСС-1000; УПСС = 80-(АДср-ЦВД)/СИ, где, ПИТ - площадь поверхности тела, которую рассчитывали по [Уланова И.П., 1968]; АДср = АДд + (АДс - АДд)/3 - среднее артериальное давление, ЦВД -центральное венозное давление.
Условия радиационного воздействия. Общее однократное облучение мышей проводили на у-установке 60Со «Луч-1» (Россия) при мощности дозы 0,4 -0,8 Гр/мин в группах до 12 особей. Для этого животных помещали в пластиковые контейнеры, состоящие из 12 индивидуальных отсеков. Облучение осуществлялось в первой половине дня. В дальнейшем облучённые животные содержались в тех же условиях, что и необлучённый биологический контроль.
Локальное облучение опухолевого узла у крыс с привитой саркомой М-1 осуществлялось также на у -установке 60Со «Луч-1» при мощности дозы 0,5 Гр/мин. Для этого крыс по 4 особи фиксировали на деревянной подложке так, чтобы пучок был сфокусирован на задней конечности, куда была привита саркома и не затрагивал остальные части тела.
Выживаемость облучённых животных изучали при остром лучевом воздействии в дозах от 6 до 11 Гр. Гибель животных регистрировали ежедневно в течение 30 суток после радиационного воздействия. По окончанию периода наблюдений рассчитывали в каждой группе долю выживших животных (%) и среднюю продолжительность жизни (СПЖ) павших животных, на основании которых судили о противолучевом действии изучаемых соединений.
Определение выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток (ГКК) методом селезёночных экзоколоний. Количество сохранивших жизнеспособность ГКК оценивали по числу колоний, сформировавшихся на поверхности селезёнки через 8 суток после трансплантации облучённым реципиентам клеток костного мозга бедренной кости. Эксперименты проведены на мышах-гибридах Fi (СВА х C57BI/6J). Реципиентов (10-12 животных в группе) облучали в дозе 8 Гр за 1 сутки до пересадки костного мозга, доноров (5 животных в группе) - в дозе 5 Гр. Доноры из опытных групп получали исследуемое вещество в дозах 1/8-2/3 ЛД16, за 15 минут до облучения. Доноры группы негативного контроля не подвергались лучевому воздействию. Через двое суток после облучения доноров подвергали эвтаназии, у них извлекали обе бедренные кости. Одну из бедренных костей использовали для приготовления суспензии клеток костного мозга для последующей пересадки реципиентам. Для этого содержимое бедренных костей от 5 доноров помещали в 3,3 мл среды 199, каждую кость неоднократно промывали, получая, таким образом, однородную суспензию клеток. На основе полученных после подобных манипуляций исходных суспензий были приготовлены суспензии непосредственно для внутривенного введения реципиентам из расчёта 1 105 клеток костного мозга в 0,5 мл среды на одно животное. Вторую бедренную кость использовали для приготовления суспензии для подсчёта общей клеточности костного мозга. Для этого содержимое каждой кости вымывали 1 мл среды 199 и фиксировали добавлением 7 мл 5% раствора уксусной кислоты с содержанием азура II, затем подсчитывали количество клеток в полученном объёме суспензии. Во всех случаях подсчёт количества клеток костного мозга осуществляли с помощью камеры Горяева.
Определения ФИД исследуемого соединения методом экзогенного колониеобразования проводили в двух опытах. Мышей-реципиентов (10-12 животных в группе) облучали в дозе 8 Гр за 1 сутки до пересадки костного мозга. Мышей-доноров из контрольных групп (по 5 животных) облучали в дозах 0,25-2 Гр, доноров из опытных групп (по 5 животных) облучали в дозах 0,5-2,5 Гр. Через двое суток после облучения доноров подвергали эвтаназии, у них извлекали обе бедренные кости и повторяли все вышеописанные манипуляции с костным мозгом.
Через 8 суток после трансплантации клеток костного мозга мышей подвергали эвтаназии под эфирным наркозом, извлекали у них селезёнки, взвешивали и фиксировали в жидкости Буэна, проводили подсчёт количества селезёночных колоний и рассчитывали в опытных группах выживаемость ГКК, по которой судили о противолучевом действии изучаемых соединений.
Определение выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток (ГКК) методом селезёночных эндоколоний. Количество сохранивших жизнеспособность ГКК оценивали по числу колоний, сформировавшихся на поверхности селезёнки за счёт собственных выживших колониеобразующих единиц через 8 суток после острого у-облучения в дозе 6 Гр. Эксперименты проведены на мышах-гибридах Fi (СВА х C57BI/6J), которых распределяли в группы по 15 особей. За 15-20 минут до облучения животным вводили один из радиопротекторов. В случае использования комбинации радиопротекторов вещества вводили изолированно с интервалом 3-5 минут.
Через 8 суток после облучения мышей подвергали эвтаназии под эфирным наркозом, извлекали у них селезёнки, взвешивали и фиксировали их в жидкости Буэна, проводили подсчёт количества селезёночных колоний, по которому судили о противолучевом действии изучаемых соединений [Конопляников А.Г., 1975].
Сравнительная оценка противолучевой активности по тесту 30-суточной выживаемости животных
По действующему руководству для доклинического изучения радиозащитных свойств фармакологических средств [Хабриев Р.У., 2005], в качестве показателя терапевтической широты радиопротектора для мелких лабораторных животных используется отношение максимально переносимой дозы (ЛДю острой токсичности) к минимальной радиозащитной дозе. Минимальная доза соединения ТІ023, при которой наблюдался статистически значимый радиозащитный эффект, в данных исследованиях по обоим тестам составляла 40 мг/кг. Максимально переносимая доза ТІ023 равна 224 мг/кг. По этим данным терапевтическая широта соединения ТІ023, как радиопротектора, для данного вида животных при введении в/б равна 5,5.
Другим часто используемым показателем, отражающим безопасность радиозащитного средства, является терапевтический индекс (ТИ), определяемый как отношение ЛД5о/ЕД5о, где ЛД5о - средняя летальная токсическая доза радиопротектора, ЕД5о - средняя эффективная доза радиопротектора при облучении в дозе, близкой к ЛД9о-юо [Владимиров В.Г., 1989]. По показателям 30-суточной выживаемости мышей, облучённых в дозе 10 Гр (таблица 3.14), величина ЕД5о для ТІ023, рассчитанная по Литчфилду-Уилкоксону [Беленький М.Л., 1963], составляет 68,1 (53,5 -87,1) мг/кг. Средняя летальная доза Т1023 равна 410 (355 -473) мг/кг. Согласно этим данным ТИ соединения Т1023 для данного вида животных равен 6,0 (4,1 -8,8).
Хотя противолучевой эффект ингибиторов NOS, как и у аминотиолов, реализуется без участия клеточных рецепторов [Филимонова М.В., 2012; 2014], они, судя по всему, обладают большей радиозащитной широтой, чем серосодержащие радиопротекторы. Полученные в этих исследованиях оценки показателей радиозащитной широты для соединения ТІ023 в 2-3 раза превышают соответствующие показатели аминотиолов - для мышей ТИ цистамина равен 3,3 (2,8-3,7) [Васин М.В., 1997].
Для количественной оценки противолучевой эффективности ТІ023 в этих исследованиях использован фактор изменения дозы (ФИД), который определяли для оптимальной радиозащитной дозы ТІ023 (75 мг/кг) по 30-суточной выживаемости самцов мышей-гибридов Fi (CBAxC57BL6j) и выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток по методу экзоколоний при воздействии у-излучения в области среднелетальных доз.
В таблице 3.15 приведены данные 30-суточной выживаемости контрольных мышей и мышей, получавших перед облучением ТІ023. Как показано, в контрольной группе облучение в дозе 6 Гр не вызывало гибели животных в течение 30 суток, но при дозе 9 Гр уже наблюдалась 100%-я летальность. В подопытных группах, получавших ТІ023, даже при облучении в дозе 11 Гр наблюдалась 20%-я выживаемость животных. Расчёт средних летальных доз у-излучения по этим данным, проведённый методом пробит-анализа по Литчфилду-Уилкоксону, дал следующие оценки: для контрольных животных -7,13 (6,62-7,64) Гр; для подопытных животных - 10,22 (9,61-10,93) Гр. Величина ФИД, рассчитанная по отношению этих ЛД5о, составила 1,44 (1,26-1,65).
Несколько большие, но менее точные оценки ФИД для ТІ023 в дозе 75 мг/кг получены в двух независимых опытах по выживаемости гемопоэтических клоногенных клеток (рисунок 3.3). Расчёт ЛД5о у-излучения для этих клеток по данным первого опыта, проведённый путём регрессионного анализа, дал следующие оценки: для контрольных мышей - 0,63 (0,55-0,72) Гр; для подопытных - 1,14 (0,93-1,31) Гр, и показатель ФИД составил 1,81 (1,29-2,38). По данным второго опыта аналогичные значения ЛД5о составили: для контрольных животных - 1,07 (0,88-1,34) Гр; для подопытных животных - 1,67 (1,62-1,71) Гр, и показатель ФИД составил 1,56 (1,21-1,94).
Отличия механизмов действия различных радиопротекторов создают потенциальную возможность для повышения противолучевой эффективности при их сочетанном применении. И хотя противолучевая активность ингибиторов NOS была показана более 20 лет назад [Liebmann J., 1994], их способность к фармакодинамическому взаимодействию с другими радиопротекторами, по существу, не исследовалось. С целью изучения этого вопроса, а также для более детальной оценки противолучевого «потенциала» соединения ТІ023 было проведено сравнительное изучение влияния этого производного ИТМ в сочетании с цистамином, серотонином, мексамином и индралином на выживаемость эндогенных клоногенных клеток костного мозга мышей Fi (CBAxC57BL6j) при воздействии у-излучения в дозе 6 Гр. В этих опытах изучаемые соединения вводили за 15-20 минут до облучения. При сочетанном применении радиопротекторы вводили раздельно с 3-5 минутным интервалом.
Результаты сравнительного изучения противолучевой активности цистамина и соединения ТІ023 при их раздельном и сочетанном применении показали наличие выраженного, статистически значимого фармакодинамического взаимодействия между ними, которое носило отчётливый антагонистичный характер. Как показано в таблице 3.16, в двух независимых экспериментах при последовательном применении цистамина и ТІ023 радиозащитный эффект был статистически значимо ниже противолучевых эффектов таких же доз этих соединений при их раздельном применении. Особенно выраженный антагонизм наблюдался при введении цистамина после инъекции ТІ023 - в этом случае радиозащитное действие комбинации соединений полностью отсутствовало. При этом признаков модификации токсических свойств и переносимости цистамина и ТІ023 при их сочетанном применении в этих опытах не отмечено.
Исследование способности изучаемых N,S-замещённых изотиомочевин к селективной защите нормальных тканей при лучевой терапии опухолей...
В настоящее время проблема разработки новых эффективных противолучевых средств актуальна не только в связи с развитием атомной энергетики и возрастающими рисками ядерных конфликтов и техногенных катастроф [Цыб А.Ф., 2011]. Рост клинической потребности в таких фармакологических средствах в значительной мере обусловлен неуклонным расширением применения методов радиационной медицины в лечении онкологических заболеваний [Иванов В.К., 2011].
На сегодняшний день известно значительное число различных соединений, обладающих противолучевым действием [Владимиров В.Г., 1989; Hosseinimehr S.J., 2007; Васин М.В., 2010; Ильин Л.А., 2012]. Некоторые из них входят в обеспечение медицинских служб МО и служб спасения в качестве радиопротекторов экстренного действия: цистамин и индралин (Б-190) - в Российской Федерации; амифостин - в странах НАТО [Гребенюк А.Н., 2011; Рождественский Л.М., 2013]. Однако низкая переносимость и токсичность эффективных доз таких радиопротекторов затрудняют их применение в онкологической практике для профилактики осложнений радиотерапии. В настоящее время, по существу, единственным в полной мере допущенным к клиническому применению в качестве средства профилактики осложнений радио-и химиотерапии опухолей остаётся разработанный в США амифостин [Kouvaris J.R., 2007; Hensley M.L., 2009].
Возможные новые подходы к модификации радиобиологических эффектов сформировались в последние десятилетия по мере накопления данных о биологической роли оксида азота. Участие NO в исключительно широком спектре биологических процессов, в том числе, имеющих отношение к развитию радиобиологических эффектов, обусловливает интерес к изучению фармакологических модификаторов эндогенного синтеза оксида азота в качестве средств, влияющих на радиочувствительность биологических объектов [Mitchell J.B., 1996; Гильяно Н.А., 2004; Ohta S., 2007]. В частности, активная роль NO в регуляции сосудистого гомеостаза и периферической гемодинамики [Dudzinski D., 2007; Ramadoss J., 2013; Qian J., 2013] может представлять значительные возможности для влияния на радиочувствительность.
В пользу перспективности такого подхода свидетельствуют экспериментальные данные о способности некоторых химических ингибиторов NOS, подавляющих эндогенный синтез оксида азота, к противолучевому действию [Liebmann J., 1994; Гильяно Н.А., 2004; Проскуряков С.Я., 2003; 2005 б; Коноплянников А.Г., 2007; Филимонова М.В., 2012].
В лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им. А.Ф. Цыба за последние 15 лет накоплен значительный, во многом уникальный опыт в области поиска и дизайна химических ингибиторов NOS и изучения их фармакологических свойств. Здесь, в частности, показана перспективность поиска эффективных субстрат-подобных, конкурентных ингибиторов NOS в ряду N,S-замещённых изотиомочевин, потенциально обладающих высокой вазотропной активностью [Проскуряков С.Я., 2002, 2003, 2009; Верховский Ю.Г., 2008, 2009; Филимонова М.В., 2011, 2012]. Способность изотиомочевин к ингибированию каталитической активности NOS обусловлена наличием в их структуре тиоамидинового фрагмента, подобного гуанидиновой группе L-аргинина, который, выполняя роль псевдосубстрата, позволяет таким соединениям конкурировать за активный центр этих ферментов [Garvey Е.Р., 1994; Wolff D.J., 1997 а, б; Проскуряков С.Я., 2005 а, в; 2009; Giroud С., 2010].
Предметом исследований данной диссертационной работы являлись синтезированные в лаборатории радиационной фармакологии МРНЦ им А.Ф. Цыба филиала ФГБУ «ФМИЦ им. П.А. Герцена» Минздрава России новые N-ацил-Б-алкил-замещённые изотиомочевины, не описанные ранее в мировой научной и патентной литературе. Экспериментальное подтверждение NOS-ингибирующей активности этих соединений явилось основанием для планирования исследований их токсических, вазоактивных и противолучевых свойств, что в значительной степени определило цели и задачи данной работы. Хотя способность некоторых ингибиторов NOS индуцировать тканевую гипоксию и проявлять радиозащитное действие была показана более 20 лет назад [Liebmann J., 1994], тем не менее, многие вопросы в этой области остаются открытыми. В этой связи работа предполагала не только проведение «рутинного» фармакологического скрининга, но и касалась вопросов, связанных с механизмами радиозащитного действия таких соединений, их способностью к взаимодействию с другими фармакологическими средствами и, в целом, общей перспективности применения ингибиторов NOS в качестве противолучевых и радиомодифицирующих средств.
На начальном этапе важным элементом экспериментальных исследований новых соединений является оценка их токсических свойств. Исследования острой токсичности изучаемых N,S-замещённых ИТМ были выполнены по общепринятым методам - предварительная оценка экспресс-методом по Прозоровскому [Прозоровский В. Б., 1978] и детальная оценка по методу пробит-анализа Литчфилда-Уилкоксона [Беленький М.Л., 1961]. Результаты этих исследований показали, что все изучаемые соединения согласно ГОСТ 12.1.007-76 относятся к классу умеренно токсичных веществ.
Вместе с тем, количественные показатели острой токсичности исследованных производных ИТМ варьировали в достаточно широких пределах. Причём, в ряду исследованных соединений отмечалась тенденция к снижению токсичности с ростом объёма N-замещающего ацильного радикала. Так, у соединений ТІ023 и ТІ032, содержащих в своей структуре N-изобутаноил, показатели ЛД5о составляли 350-450 мг/кг, у соединений ТІ020 и ТІ049, содержащих в структуре N-циклобутанкарбонил, ЛД5о составляли 750-850 мг/кг, а у соединения ТІ046, содержащего в структуре N-пальмитинатоил, ЛД5о составляет 800-1000 мг/кг. Возможно, эта тенденция обусловлена ростом молекулярной массы в такой последовательности соединений.
В целом же, проявления токсических эффектов исследованных производных ИТМ наблюдались при их введении в больших дозах, и они являлись краткосрочными - картина интоксикации и летальные эффекты развивались в первые 3-5 часов после введения. В дальнейшем у выживших животных каких-либо изменений не наблюдалось.
В пользу относительной безопасности этих соединений свидетельствовало также сравнение средних летальных доз и средних эффективных концентраций (таблицы 3.2 и 3.4). Сопоставление этих величин показывало, что большая часть изучаемых производных ИТМ способна подавлять активность изоформ NOS более чем на 50% при дозах, на 1-2 порядка ниже токсических, что позволяло ожидать у них проявление физиологической активности при нетоксических дозах.
Скрининговая оценка противолучевой активности изучаемых N,S-замещённых изотиомочевин проведена в соответствии с действующими рекомендациями [Хабриев Р.У., 2005]. Радиозащитное действие оценивали по выживаемости мышей при воздействии у-излучения в дозе 10 Гр. Соединения вводились подопытным животным однократно в дозах 1/8-1/2 ЛД16 за 15-20 минут до облучения. Результаты этих исследований показали, что противолучевая активность этих производных ИТМ в значительной степени зависит от их NOS-ингибирующих свойств. Наиболее выраженное и стабильное радиозащитное действие оказывало соединение ТІ023, являющееся не только наиболее активным ингибитором NOS в данном ряду, но и обладающее значительной селективностью (примерно в 15 раз) к ингибированию eNOS и iNOS. Такая закономерность, на наш взгляд, согласуется с предположением о вазоактивном, гипоксическом механизме противолучевого действия ингибиторов NOS. Так, ранее было экспериментально показано, что радиозащитное действие ингибитора NOS L-NAME сопровождается развитием гипоксии в области костного мозга [Liebmann J., 1994], а позднее было уточнено, что снижение оксигенации при этом развивается за счёт подавления именно эндотелиальной изоформы NOS [Jordan B.F., 2004].