Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Критерии радиочувствительности 14
1.2. Связь ОНП и индивидуальной радиочувствительности 19
1.3. Роль ОНП генов, вовлеченных в регуляцию окислительного стресса, в радиационном ответе и индивидуальной радиочувствительности 25
1.4. Роль ОНП генов иммунной системы в радиационном ответе и индивидуальной радиочувствительности 38
1.5. Резюме 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы 51
2.1 Характеристика обследуемой группы облученных лиц 51
2.2 Лабораторные методы
2.2.1 Генотипирование по локусам ОНП 55
2.2.2 Цитогенетический анализ 60
2.2.3 Анализ мутаций Т-клеточного рецептора 60
2.2.4 Параметры окислительно-восстановительного гомеостаза 61
2.2.5 Параметры иммунитета
2.3 Оценка бытовых факторов риска 63
2.4 Методы статистического анализа данных 64
ГЛАВА 3. Результаты исследования 66
3.1 Частоты аллелей и генотипов в группе лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию 66
3.2 Связь генетического полиморфизма с частотой нестабильных хромосомных аберраций в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия 74
3.3 Связь генетического полиморфизма с частотой мутаций Т-клеточного рецептора в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия 78
3.4 Параметры иммунной и антиоксидантной систем у носителей генотипов, ассоциированных с частотой ХА и TCR-мутаций 82
ГЛАВА 4. Обсуждение и выводы 93
Выводы 100
Список литературы 102
- Связь ОНП и индивидуальной радиочувствительности
- Роль ОНП генов иммунной системы в радиационном ответе и индивидуальной радиочувствительности
- Параметры окислительно-восстановительного гомеостаза
- Связь генетического полиморфизма с частотой мутаций Т-клеточного рецептора в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия
Связь ОНП и индивидуальной радиочувствительности
Несмотря на то, что анализ нестабильных ХА наиболее информативен в плане биодозиметрии в течение нескольких недель после облучения (в дальнейшем из-за обновления пула лимфоцитов информативность анализа падает), в отдаленном периоде также наблюдается повышение их частоты относительно контроля. Так, по данным Возиловой А.В. [362], у лиц, подвергшихся хроническому воздействию ИИ на реке Теча, через 50-60 лет после воздействия наблюдается повышенный уровень нестабильных ХА обменного типа: дицентриков, колец, ацентрических фрагментов. Показано, что частота обнаружения данных ХА значимо выше в дозовой группе 1,5 Гр, чем в дозовой группе 0,01-1,5 Гр и значимо выше, чем в контрольной группе. Как полагают авторы, увеличение доли лимфоцитов с ХА у облученных лиц может быть объяснено: 1) существованием популяции долгоживущих лимфоцитов, сохраняющих радиационно-индуцированные ХА, 2) образованием ХА de novo вследствие воздействия от 90Sr, накопленного в костях, 3) образованием ХА de novo вследствие РИНГ. Авторы также предполагают, что интенсивность процесса элиминации лимфоцитов с ХА может быть связана с индивидуальными особенностями организма [362].
Помимо структурных перестроек хромосом, ИИ индуцирует генные мутации, частоту которых удобно оценивать по локусам TCR. Метод определения частоты TCR-мутаций был предложен Kyoizumi [209]. TCR – гетеродимер, состоящий из - и - цепей, входящий в состав молекулярного комплекса, экспрессирующегося на поверхности лимфоцитов, называемого CD3-антигеном. Так как TCR-гены функционально гемизиготны, на поверхности лимфоцитов представлены продукты только одного аллеля. Мутации в функционирующем аллеле приводят к тому, что CD3 комплекс не экспрессируется на поверхности Т-лимфоцита. Лимфоциты, негативные по экспрессии CD3-комплекса на плазмалемме, характеризуются CD3–CD4+ фенотипом из-за соматической мутации в - или - цепях гена TCR. Оценка экспрессии CD3-антигена на поверхности Т-лимфоцитов с помощью иммунофлюоресцентного окрашивания клеток антителами к CD3 и CD4 с последующей проточной цитофлуориметрией используется для определения частоты радиационно-индуцированных TCR-мутаций [205]. Время полувыведения клеток, несущих TCR-мутации, после облучения оценивается приблизительно в 2-3 года [350].
По результатам Саенко и соавт. [288], у лиц, подвергшихся пролонгированному облучению в отдаленный период (8-32 лет до анализа) была повышена относительно контроля частота TCR-мутантных клеток, однако достоверная дозовая зависимость была обнаружена для лиц, подвергшихся воздействию относительно недавно (не более 8 лет до анализа) или подвергающихся воздействию вплоть до времени проведения анализа. Тенденция к дозозависимому увеличению уровня TCR мутаций (р=0,051) наблюдается у выживших после атомной бомбардировки в Японии [350]. У лиц, подвергшихся хроническому воздействию ИИ на р. Теча, была обнаружена повышенная частота TCR-мутантных клеток по сравнению с необлученными [54]. Китайские коллеги [232] сообщают о найденной ими квадратичной зависимости частоты TCR-мутантных лимфоцитов от дозы облучения in vitro и о согласуемости полученной кривой «доза-эффект» с таковой, полученной на нестабильных ХА. Известно, что частота TCR-мутантных клеток увеличивается с возрастом, а также в случае аутосомно-рецессивных врожденных заболеваний [205]. Частота TCR-мутаций может быть генетически обусловлена. Так, у р53-/- мышей после облучения со временем не наблюдается снижения доли TCR-мутантных клеток [350]. Какой бы маркер радиационной чувствительности не оценивался, нельзя забывать о комплексном характере ответа организма на воздействие ИИ. Реакция на облучение всегда представляет совокупность процессов, происходящих в различных системах. Проявление эффектов на более высоких уровнях зависит от характера первичных нарушений на молекулярном уровне и от радиорезистентности компонентов, контролирующих гомеостаз (системы репарации, антиоксидантной системы, иммунитета) [1]. Поэтому РЧ является комплексным признаком, который, как полагается, обусловлен взаимодействием большого числа генов и низкопенетрантных генетических вариантов [64, 268, 345, 373].
Известным фактом является различная чувствительность людей к воздействию ИИ. Радиочувствительный фенотип характерен не только для больных редкими тяжелыми генетическими заболеваниями с повышенной радиочувствительностью хромосомного аппарата (анемия Фанкони, синдром Ниймеген, атаксия-телеангиоэктазия и др.). Существует довольно большая часть онкобольных (около 10%), демонстрирующих повышенную чувствительность к радиотерапии и более тяжелые эффекты в нормальных тканях, что связывают с генетическими особенностями пациентов [79, 272, 290]. Однако, причины вариабельности индивидуальных радиационных ответов и механизмы, участвующие в формировании РЧ, в настоящее время слабо изучены. Повышенный интерес к этим вопросам привел к возникновению нового направления в радиобиологии – радиогеномики, целью которого является глубокое изучение генетической детерминированности РЧ, а главным орудием – «полногеномные» ассоциативные исследования (genome-wide association study – GWAS) [182, 372]. Одним из основных направлений радиогеномики на сегодняшний день является анализ ассоциации РЧ с ОНП.
Роль ОНП генов иммунной системы в радиационном ответе и индивидуальной радиочувствительности
Объектом цитогенетического исследования являлись лимфоциты. Препараты из Т-лимфоцитов периферической крови доноров получали согласно протоколу, описанному в [19], который включает четыре последовательных этапа: культивирование клеток до стадии метафазы, гипотоническую обработку метафазных клеток, фиксацию метафазных пластинок, приготовление препаратов хромосом и окрашивание препаратов красителем Гимза 2%. Анализ проводили при световой микроскопии, при 1000-кратном увеличении на микроскопе Axio Imager Z2 (Сarl Zeiss, Германия). В настоящем исследовании использовали данные по частоте обменных нестабильных ХА, которые суммировали частоту дицентрических и кольцевых хромосом, ацентрических фрагментов на 100 клеток.
Используемый метод определения частоты TCR-мутаций принципиально аналогичен описанному в работах [205, 209]. Метод основан на цитофлуориметрической детекции и подсчете числа лимфоцитов периферической крови, негативных по экспрессии CD3-комплекса на плазмалемме, из-за соматической мутации в генах - или - цепей TCR. Для оценки параметров окислительно-восстановительного гомеостаза анализировались уровни внеклеточной СОД, МДА, монооксида азота (NO) в сыворотке крови. Уровень фермента CuZn – содержащей СОД определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) на планшетах Bender MedSystems (Австрия). Все этапы работы были полностью автоматизированы, использовали автоматический ИФА-анализатор LAZURITE (Dynex Technologies, США). Интенсивность перекисного окисления липидов мембран эритроцитов оценивали по содержанию вторичного продукта ПОЛ – МДА в реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [10]. Метод определения содержания МДА в эритроцитах крови основан на образовании окрашенного комплекса при взаимодействии ТБК-активных веществ (МДА) с тиобарбитуровой кислотой. Оптическую плотность раствора измеряли на биохимическом анализаторе ФП 901-М (Labsystems, Финляндия).
Измерение уровня NO в сыворотке крови, проводили с использованием тест-систем R&D Systems (США) согласно методике, описанной в работе [261].
Параметры иммунитета у пациентов оценивали с использованием стандартных иммунологических методик. Рассматривали следующие параметры: 1) Абсолютное и относительное количество лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов; 2) Абсолютное и относительное количество клеток: CD3+ (Т-клетки), CD4+ (Т-хелперы), CD8+ (Т-цитотоксические), CD3-CD16+56+ (натуральные киллеры), CD3+CD16+56+ (натуральные киллеры – Т-клетки (NKT-клетки), CD19+ (В-клетки) (с помощью моноклональных антител) [12], соотношение количества CD4+/CD8+ клеток; 3) Определение концентрации: ИЛ-1, ИЛ-і-РА (рецепторный антагонист), ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-17, гранулоцитарно-моноцитарный фактор роста (ГМФР), гранулоцитарный фактор роста (ГФР), фактор некроза опухоли-альфа (TNF), интерферона-альфа (IFN) и -гамма (IFN), иммуноглобулинов А, G и М (IgA, IgG, IgM), методом иммуноферментного анализа (ИФА) в твердофазном «сэндвич» - варианте. 4) Функциональную активность моноцитов и нейтрофилов: поглотительная способность (в тесте с микросферами инертного полистирольного латекса [41, 44, 46], оцениваемые показатели: АФМ (Н) - активность фагоцитоза моноцитов (нейтрофилов) - по числу клеток с латексом (измеряется в процентах), ИФМ (Н) - интенсивность фагоцитоза - общее число поглощенных частиц латекса (измеряется в условных единицах), Инд. М (Н) - индекс фагоцитоза - частное интенсивности и активности (измеряется в условных единицах), АКАМ (Н) - абсолютное количество активных моноцитов (нейтрофилов) - процент от произведения абсолютного количества активных клеток и АФМ (рассчитывается на литр крови), ФАМ (Н) - фагоцитарная активность моноцитов (нейтрофилов) произведение АКАМ(Н) и Инд.М(Н) (рассчитывается на литр крови); ферментативная (лизосомальная) активность - по включению в лизосомы акридинового оранжевого [44], оцениваемые показатели: ЛАМ (Н) - лизосомальная активность моноцитов (нейтрофилов) -суммарное количество клеток умноженное на степень интенсивности окраски (выражается в условных единицах), СЛАМ(Н) - суммарная лизосомальная активность в литре крови процент от произведения абсолютного количества клеток и лизосомальной активности; окислительно-восстановительный потенциал - в спонтанном и индуцированном (частицами латекса) варианте теста с нитрасиним тетразолием (НСТ) [4, 267, 301], анализируемые показатели: НСТМ (Н) сп/инд, % - количество всех НСТ-позитивных моноцитов (нейтрофилов) в спонтанном/индуцированном варианте теста (без учета размера гранул диформазана), НСТМ (Н) сп/инд, у.е. - суммарный НСТ - процент НСТ-позитивных клеток с учетом размера гранул диформазана.
Сотрудниками регистратуры клинического отделения ЦНПЦ РМ проводилось анкетирование лиц исследуемой группы на предмет курения табака и употребления алкоголя. Ответы ранжировались по категориям согласно критериям, предложенным в публикации [9], следующим образом. Курение: «1» - никогда не курил, «2» - курил 1 и более сигарет в день, бросил более 12 месяцев до момента опроса, «3» - курит 1 и более сигарет в день на момент опроса, или курил 1 и более сигарет в день, но бросил менее 12 месяцев до момента опроса. Употребление алкоголя: «1» - не употребляет, «2» - употребляет умеренно (7-14 стандартных алкогольных доз в неделю), «3» - употребляет в больших количествах (15-34 доз в неделю), «4» -злоупотребляет (35 и более доз в неделю). Группы 3 и 4 ввиду низкой численности (8 и 2 чел. соответственно) для анализа были объединены в группу 3. Одна стандартная алкогольная доза равна 30 г чистого спирта, что соответствует 50 мл водки, 150 мл вина, 350 мл пива или других аналогичных по крепости спиртных напитков.
Параметры окислительно-восстановительного гомеостаза
Иммунная система структурно и функционально связана с кроветворной, поэтому в условиях хронического радиационного воздействия она может рассматриваться как критическая. Иммунная система участвует в поддержании генетического гомеостаза организма, радиационно индуцированные изменения в иммунной системе могут иметь значение в развитии отдаленных канцерогенных и неканцерогенных эффектов [1]. Одним из последствий радиационного воздействия является окислительный стресс, который может сохраняться длительное время посредством провоспалительных иммунных реакций, индуцировать развитие отдаленных эффектов, в том числе ЗНО [280, 294].
Допустимо предположить, что связь полиморфизмов с частотой нестабильных обменных ХА и частотой TCR-мутаций у облученных лиц может быть опосредована влиянием различных аллелей полиморфных локусов на процессы транскрипции и/или трансляции генов иммунной и антиоксидантной систем, что в условиях хронического радиационного воздействия могло способствовать сдвигам гомеостаза. Исходя из этого предположения, согласно задаче №4 данной работы, были оценены показатели, характеризующие состояние клеточного, гуморального, цитокинового и фагоцитарного звеньев иммунитета, а также состояние системы окислительно – восстановительного гомеостаза у носителей ОНП, ассоциированных с частотой ХА и TCR мутаций в лимфоцитах периферической крови.
Были оценены иммунные показатели у носителей генотипов СС и СТ+ТТ по локусу IL4 rs2070874, ассоциированных с уровнем ХА, и у носителей генотипов АС и АА+СС по локусу IL12 rs3212227, ассоциированных с частотой TCR-мутаций лимфоцитов. В таблицах 11 – 15 представлен анализ различий показателей различных звеньев иммунитета у носителей генотипов СС и СТ+ТТ по локусу IL4 rs2070874. Следует указать, что значения всех иммунных показателей укладываются в диапазон нормальных значений согласно принятых норм для данного возрастного диапазона [48].
Из таблицы 11 видно, что носители аллеля Т характеризуются статистически значимо сниженными уровнями показателей клеточного иммунитета, в частности абсолютного количества Т-лимфоцитов (CD3+) (р=0,017), Т-хелперов (CD3+4+) (р=0,021), абсолютного (р=0,025) и относительного (р=0,0007) количества NKT-клеток (CD3+4+56+), причем наиболее значимым является снижение абсолютного количества NKT-клеток в литре крови (в среднем 150 млн клеток у гомозигот СС, 110 млн клеток у носителей аллеля Т). Последнее может указывать на сниженный противоопухолевый иммунитет у носителей аллеля Т локуса IL4 rs2070874 по сравнению с гомозиготами СС. Можно заметить, что у носителей аллеля Т в целом отмечается тенденция к снижению абсолютного (р=0,05) и относительного (р=0,07) содержания лимфоцитов в периферической крови.
Как мы видим, носители аллеля Т характеризуются сниженным абсолютным количеством В-лимфоцитов на литр крови по сравнению с гомозиготами СС, в то же время данное снижение, похоже, функционально скомпенсировано, на что указывает отсутствие существенных изменений по уровню иммуноглобулинов в плазме крови.
Как мы видим из вышеприведенной таблицы, имеет место некоторое снижение суммарной лизосомальной активности моноцитов (СЛАМ) у носителей аллеля Т по сравнению с гомозиготами СС (р=0,047), что может указывать на роль аллеля Т локуса IL4 rs2070874 в осуществлении моноцитами фагоцитарной активности, подтверждений чему, однако, не было найдено в доступной литературе.
Показатели нейтрофильного звена, как показано в таблице 14, значимо не различаются между гомозиготами СС и носителями аллеля Т, в том числе и по суммарной лизосомальной активности. Имеет место лишь незначительная (р=0,09) тенденция к снижению индекса спонтанного НСТ-теста нейтрофилов у носителей аллеля Т.
Носители аллеля Т показывают сниженный уровень интерлейкина-17 в плазме крови по сравнению с гомозиготами СС. Учитывая то, что ИЛ-17 является одним из провоспалительных цитокинов, отмеченное различие может говорить о несколько сниженной активности воспалительных процессов у носителей аллеля Т.
Как видно из представленных выше таблиц 12 – 16, между группами носителей генотипов СС и СТ+ТТ по локусу IL4 rs2070874 наблюдается ряд различий в иммунологических параметрах на уровне р 0,05: по абсолютному количеству Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD3+4+), В-лимфоцитов (CD19+), по относительном и абсолютному содержанию NKT-клеток (CD3+16+56+), по суммарной лизосомальной активности моноцитов в литре крови (СЛАМ), по уровню ИЛ-17. Наиболее статистически значимым является различие между генотипами по абсолютному количеству NKT-клеток (абсолютное содержание в литре крови CD3+16+56+ клеток: у носителей генотипа СС в среднем 0,15±0,01, у носителей СТ+ТТ в среднем 0,11±0,01, р=0,0007). Иммунологические параметры были оценены также у носителей генотипов АС и АА+СС по локусу IL12 rs3212227. Результаты сравнения иммунологических параметров между генотипическими группами представлены в таблицах 16 – 20.
Связь генетического полиморфизма с частотой мутаций Т-клеточного рецептора в отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия
Известно, что ИЛ-12 активирует NK-клетки и цитотоксические Т-лимфоциты, стимулирует продукцию NK-клетками IFN [188, 386]. ИЛ-12-индуцированная секреция IFN ведет к возрастанию активности р53, что, в свою очередь, ведет к супрессии опухоли посредством индукции апоптоза в опухолевых клетках [336]. Полиморфизм rs3212227 находится в 3`-UTR гена IL12b (субъединица IL12p40), ассоциирован с усилением экспрессии полной молекулы ИЛ-12 in vitro в разных клеточных линиях [113, 250, 300, 386]. Известно, что белок IL12p40 является также субъединицей для ИЛ-23, который является ключевым провоспалительным цитокином [346].
Поскольку полиморфизм находится в 3`-некодирующем участке, можно предположить, что он влияет на пост-транскрипционную модификацию IL12p40, находится в сайте связывания с регуляторным белком или миРНК, или влияет на транспорт белкового продукта [75]. В результате проведенного анализа иммунологических показателей было установлено, что у носителей генотипа АС по сравнению с носителями АА+СС по локусу IL12 rs3212227 наблюдается значимое снижение относительного количества В-лимфоцитов, абсолютного количества активных моноцитов, а также повышение уровня ИЛ-2 и ИЛ-8. Таким образом, иммунологическая картина у носителей генотипа АС характеризуется слабо выраженным снижением гуморального иммунитета (процента В-клеток, р=0,047) и активности фагоцитоза моноцитов (р=0,037), а также повышением уровня хемокина ИЛ-8 (р=0,025). В то же время, наиболее значимым является повышение уровня ИЛ-2 (р=0,003).
ИЛ-2 оказывает эффекты на клетки различных типов, главным образом на Т-лимфоциты: ИЛ-2 усиливает пролиферацию CD4+ и CD8+ Т-клеток, а также ингибирует апоптоз и способствует долговременному выживанию Т-клеток [130]. Кроме того, ИЛ-2 важен для развития и гомеостаза регуляторных Т-клеток, обеспечивающих элиминацию аутореактивных Т лимфоцитов [234]. Кроме Т-лимфоцитов, ИЛ-2 активен в отношении НК: он усиливает продукцию NK-клетками TNFa, IFNg и GM-CSF. Кроме того, ИЛ-2 синергично с ИЛ-12 повышает цитотоксическую активность НК [185]. Показано, что ИЛ-2 усиливает активацию врожденного иммунитета при облучении, а именно – радиационно-индуцированную цитотоксичность NK-клеток [143, 324]. ИЛ-2 используется в качестве опухолевого супрессора при терапии ЗНО [390]. Известно, что уровень ИЛ-2 в плазме не сильно чувствителен к развитию патологического процесса в организме [43]. При этом, существенное уменьшение продукции ИЛ-2 является одним из проявлений иммунодефицитного состояния [43].
Таким образом, генотип АС демонстрирует «протективный эффект», который выражается снижением частоты TCR-мутаций и увеличением уровня ИЛ-2. Вероятно, последнее может говорить об усилении клеточного иммунитета у носителей генотипа АС.
Как был оупомянуто, у лиц, облученных в результате радиоактивного загрязнения реки Теча, спустя десятки лет после воздействия регистрируется повышенный уровень ХА нестабильного типа и мутаций генов TCR [54, 357, 362]. Вероятно, данные эффекты можно рассматривать как проявление РИНГ. Последние литературные данные дают основания полагать, что РИНГ может индуцироваться вследствие продолжительной выработки провоспалительных факторов тканевым микроокружением [256]. Потенциальный источник такого рода воздействия – тканевые макрофаги [229], активация которых может происходить даже через длительное время после облучения [104]. Исследования [105, 276] показали, что у животных с различным генотипом (разные линии мышей) после облучения наблюдается различный профиль экспрессии генов в клетках-макрофагах костного мозга: в одном случае (линия CBA/Ca) наблюдается провоспалительный профиль, в другом (C57BL6) – антивоспалительный. Сигнальные механизмы, запускаемые провоспалительными макрофагами, включают цитокины (TNF и Fas-L), оксид азота, супероксид, ERK-MAPK и JNK-SAPK; все эти факторы относятся к COX-2 – молекулярному пути и являются важными модуляторами воспаления [256]. Связь между воспалительными процессами и РИНГ была хорошо показана в работе [255]: клетки костного мозга мышей СВА/Са, демонстрирующие радиационно-индуцированную нестабильность хромосом, после облучения обрабатывали нестероидным антивоспалительным препаратом (ингибитором COX-2), что приводило к снижению показателя хромосомной нестабильности у потомства облученных клеток. Таким образом, состояние генома клеток может зависиеть от состояния окислительно – восстановительного гомеостаза и быть опосредовано активностью иммунной системы.
Таким образом, если рассматривать повышенную частоту нестабильных ХА и TCR-мутаций в изучаемой группе, как проявления РИНГ, то можно говорить о том, что генотипы по локусам генов иммунной системы IL4 rs2070874 и IL12 rs3212227, ассоциированные со снижением частоты ХА и TCR-мутаций, являются «протективными» относительно индукии РИНГ, возможный механизм которой описан выше.
На сегодняшний день роль генетических особенностей организма в формировании его радиочувствительности не подвергается сомнению. Проведенное исследование – это попытка оценить роль индивидуальных генетических особенностей облученных лиц в формировании радиационных эффектов в отдаленный период после хронического радиаионного воздействия (нестабильные ХА и частота соматических TCR-мутаций), а также оценить связь генотипа, ассоциированного с состоянием генома облученных лиц, с состоянием их иммунной системы и системы окислительно – восстановительного гомеостаза. Полученные нами данные говорят о наличии статистически значимой ассоциативной связи между генотипом и уровнем ХА и TCR-мутаций, а также между генотипом и параметрами иммунной системы.