Экспериментальное обоснование возможности применения 68Ga-цитрата для визуализации воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии Лунёв Александр Сергеевич

Содержание к диссертации

Введение

1. Аналитический обзор литературы 16

1.1. Воспалительные процессы 16

1.1.1. Основные теории воспаления 16

1.1.2. Этиологические основы возникновения воспалительного процесса 19

1.1.3. Патогенетические основы возникновения воспалительного процесса 20

1.2. Диагностика воспалительных процессов. Применение методов визуализации воспалительных процессов 27

1.2.1. Морфофизиологическая визуализация 28

1.2.2. Функциональная визуализация методами эмиссионной томографии. Радиофармацевтические препараты для визуализации воспалительных и инфекционных процессов 35

99mTc- и 111In-меченые иммуноглобулины 37

99mTc- и 111In-меченные липосомы 38

99mTc- и 111In-меченные ex vivo лейкоциты 39

99mTc-меченные антитела агранулоцитов 41

111In-DTPA-формил-Мет-Лей-Фен 42

111In-меченный антагонист лейкотриена B4 (DPC11870) 43

99mTc- и 131I-меченные интерлейкины 44

99mTc- и 18F-меченные фторхинолоны 45

18F-ФДГ 46

67Ga-цитрат 48

68Ga-цитрат и другие 68Ga-меченные радиофармацевтические препараты 51

1.3. Доклинические исследования и стандартизация радиофармацевтических препаратов 59

Выводы по главе 66

2. Материалы и методы исследований 68

2.1. Объекты исследования 68

2.1.1. Подбор оптимальной концентрации цитрата железа (III) 68

2.1.2. Расчет используемых активностей и доз для исследований 69

2.2. Экспериментальные животные 70

2.2.1. Моделирование асептического воспаления мягких тканей 70

2.2.2. Моделирование септического воспаления легкого 71

2.2.3. Моделирование септического остеомиелита 71

2.2.4. Моделирование заболевания воспаленного кишечника 71

2.3. Методы исследования функциональной пригодности 68Ga-цитрата на

биологических тест-системах 72

2.3.1. Доказательство биоэквивалентности 67/68Ga-цитрата 72

2.3.2. Математическое моделирование кинетики транспорта 68Ga-цитрата 74

2.3.3. Расчет биологических и эффективных периодов полувыведения 68Ga-цитрата 78

2.3.4. Визуализация смоделированных воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии 78

2.3.5. Реконструкция и анализ изображений 80

2.4. Методы исследования безопасности лиофилизатов для приготовления РФП 68Ga-цитрата и раствора цитрата стабильного железа (III) 82

2.4.1. Исследование острой токсичности лиофилизатов 83

2.4.2. Исследование хронической токсичности лиофилизатов 84

2.4.3. Исследование аллергизирующего действия лиофилизатов 85

2.4.4. Исследование специфической токсичности – расчет прогнозных значений лучевых нагрузок для 68Ga-цитрата в организме человека 86

2.5. Статистическая обработка результатов 92

3. Исследование функциональной пригодности 68Ga-цитрата 93

3.1. Исследование влияния раствора цитрата железа (III) in vitro (блокада) на связывание галлия-68 с трансферрином в реакционной смеси 93

3.2. Исследование биораспределения 67Ga- и 68Ga-цитрата in vivo и доказательство их биоэквивалентности с и без дополнительного введения раствора цитрата железа (III) 96

3.3. Исследование математической модели кинетики транспорта 68Ga 4

цитрата 102

4. Исследование и оценка возможности применения 68ga-цитрата для ранней визуализации смоделированных воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии 108

5. Исследование и оценка токсикологических свойств лиофилизатов для приготовления 68ga-цитрата с и без цитрата стабильного железа (III) на грызунах

5.1. Исследование острой токсичности 114

5.2. Исследование хронической токсичности 117

5.3. Аллергизирующие свойства 124

6. Исследование специфической токсичности и оценка радиационной безопасности применения 68Ga цитрата. расчет прогнозных значений поглощенных доз, создаваемых в органах и тканях, при введении 68ga цитрата 125

выводы 132

благодарность 134

список литературы 135

• Этиологические основы возникновения воспалительного процесса
• Расчет используемых активностей и доз для исследований
• Визуализация смоделированных воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии
• Исследование хронической токсичности

Введение к работе

Актуальность исследования. Воспалительные процессы

сопровождают практически все известные заболевания инфекционной и неинфекционной природы. Особо важно предупреждение воспалений на ранних стадиях, поэтому своевременная диагностика и/или визуализация воспалений с последующим купированием угроз осложнения и, как следствие, летального исхода остается одной из наиболее актуальных проблем современной медицины. Для ее решения используются достижения и конкретные результаты исследований в сфере многих фундаментальных наук. Одним из таких направлений является ядерная медицина, использующая открытые радионуклиды в составе радиофармпрепаратов (РФП) и свойство атомных ядер подвергаться радиоактивному распаду для диагностики и терапии в различных областях научной и практической медицины. Мировое производство и потребление РФП ежегодно растет на 10-15% (Сомов Д.В. и др., 2012). Для России ядерная медицина и открытие новых центров ядерной медицины является одним из приоритетных направлений развития отечественного здравоохранения. Следует отметить, что в нашу страну не импортируются РФП; это единственная группа лекарственных средств, где используются только отечественные препараты.

Степень разработанности проблемы. Визуализация воспалительных и инфекционных процессов с использованием РФП методами эмиссионной томографии основывается на локальных физико-химических изменениях в пораженной ткани и позволяет отразить функциональный статус патологии, тогда как другие современные методы (КТ, МРТ, УЗИ) опираются на морфофизиологические изменения в тканях, что лишает возможности оценить патологию на ранней стадии развития (Bollow M. et al., 2002). Традиционно «золотым стандартом» для визуализации воспалений считаются ^99mTc- или ¹¹¹In-меченные лейкоциты (Davina K., 2003). Однако их анализ и большинства других РФП для визуализации воспалений (van Eerd J.E.M. et al., 2005; Bleeker-Rovers C.P. et al., 2007; Meller J. et al., 2007 и др.) подталкивает ученых и клиницистов к поиску и разработке новых РФП, особенно для позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), в связи с ее бурным развитием и внедрением в нашей стране и за рубежом.

Одним из таких РФП является ⁶⁸Ga-цитрат – аналог ⁶⁷Ga-цитрата, применяющегося в однофотонно-эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ) с 70-х гг. прошлого столетия. В литературе описаны несколько метаболических путей накопления галлия в очагах воспаления, в той или иной мере связанные с мечением транспортных белков крови in vivo (Moerlein S.M., Welch M.J., 1981; Harris W.R., Pecoraro V.L., 1983; Martinez J.L. et al., 1990). Однако достаточное связывание ⁶⁷Ga (T 78,28 ч) с белками крови приводит к ее медленному клиренсу от радиоактивности, соответственно, более длительному периоду накопления в патологических очагах и откладыванию процедуры сканирования (до 72 ч), что исключает возможность применения короткоживущего изотопа галлия-68 (T 67,7 минут) для ПЭТ. Одним из путей решения этой задачи предполагается в/в

введение дополнительных химических агентов (со схожими с галлием
физико-химическими свойствами), которые будут конкурировать с

радиоактивным галлием в присоединении к белкам крови, таким образом, освобождая большое количество свободного радиоактивного галлия и делая его доступным для таргетного (целевого) накопления. Наиболее близким по свойствам является трехвалентное железо, поэтому в рамках исследований настоящей диссертационной работы была исследована возможность использования физиологически приемлемых соединений трехвалентного железа (к примеру, цитрата железа) для блокирования металлсвязывающей способности транспортных белков крови.

Актуальность и отсутствие расширенных исследований препарата ⁶⁸Ga-цитрат с его свойствами в качестве нового диагностического средства при совместном введении с цитратом железа (III) обуславливает необходимость проведения исследований, направленных на обоснование возможности применения ⁶⁸Ga-цитрата для быстрой визуализации воспалительных процессов методом ПЭТ.

Цель настоящего исследования заключается в экспериментальном
обосновании возможности применения радиофармацевтического препарата
⁶⁸Ga-цитрат для визуализации воспалительных процессов методом

позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ). Исходя из поставленной цели, необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать влияние раствора цитрата железа (III) in vitro на связывание галлия-68 с трансферрином в реакционной смеси;

2. Исследовать биораспределение ^67/68Ga-цитрата in vivo с и без дополнительного введения цитрата стабильного железа (III);

3. Исследовать и оценить возможность применения ⁶⁸Ga-цитрата для быстрой визуализации смоделированных воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии;

4. Исследовать и оценить токсикологические свойства лиофилизатов для приготовления радиофармацевтического препарата ⁶⁸Ga-цитрат и радиофармацевтической композиции ⁶⁸Ga-цитрата с цитратом стабильного железа (III);

5. Рассчитать прогнозные значения поглощенных доз, создаваемых в органах и тканях, при введении ⁶⁸Ga-цитрата и оценить радиационную безопасность его применения.

Научная новизна. Проведено систематическое изучение поведения ⁶⁸Ga-цитрата в присутствии цитрата стабильного железа (III) (и без него) в экспериментах in vitro и in vivo. Исследован характер биораспределения, а также получены данные биологических и эффективных периодов полувыведения ⁶⁸Ga-цитрата из органов и тканей, подтверждающие его выраженную инфламатотропность (от лат. inflammatio – воспаление). Впервые для оценки безопасности применения радиофармацевтического препарата ⁶⁸Ga-цитрат и радиофармацевтической композиции ⁶⁸Ga-цитрата с цитратом стабильного железа (III) изучены токсические свойства их компонентов для приготовления в виде растворов лиофилизатов из

наработанных партий (ООО «ДИАМЕД», Москва). Впервые рассчитаны и
исследованы прогнозные значения поглощенных и эффективных доз для
оценки радиационной безопасности применения ⁶⁸Ga-цитрата при

эквивалентном пересчете на человека. На основании полученных результатов впервые разработан и защищен патентом РФ способ быстрой визуализации воспалительных процессов с помощью радиофармацевтической композиции ⁶⁸Ga-цитрата с цитратом стабильного железа (III) методом позитронно-эмиссионной томографии.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Описана
возможность применения ⁶⁸Ga-цитрата для быстрой визуализации

воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии. Теоретически обоснована и экспериментально доказана выраженная инфламатотропность (его функциональная пригодность) препарата ⁶⁸Ga-цитрат в организме лабораторных животных (мышей и крыс) и безопасность его применения. В результате систематического изучения поведения ⁶⁸Ga-цитрата в присутствии цитрата стабильного железа (III) (и без него) установлено, что дополнительное введение раствора цитрата железа (III) нужной концентрации позволяет достигнуть высокой аккумуляции РФП в очагах воспаления уже через 30-60 минут после введения. Таким образом, ⁶⁸Ga-цитрат, совместно с цитратом стабильного железа (III), может быть использован для быстрой визуализации воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии в медицинских исследованиях.

Методы проведения и результаты исследований настоящей

диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий по радиобиологии на кафедре радиобиологии и вирусологии им. акад. А.Д Белова и В.Н. Сюрина ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА им. К.И. Скрябина.

Методология и методы диссертационного исследования.

Методологической основой исследования послужили традиционные подходы,
теоретические и экспериментальные наработки к исследованию

функциональной пригодности и безопасности РФП и системного анализа
полученных результатов. Методология исследования определила

целесообразность использования комплексного подхода, включающего
радиохимические, биологические, физические и математические методов
исследования. Экспериментальные исследования выполнены на

сертифицированном и поверенном научном оборудовании с использованием аттестованных методик в аккредитованных лабораториях.

Основные положения, выносимые на защиту:

6. Результаты систематического изучения поведения ^67/68Ga-цитрата в присутствии цитрата стабильного железа (III) (и без него) в экспериментах in vitro и in vivo;

7. Способ визуализации смоделированных воспалительных процессов с помощью радиофармацевтической композиции ⁶⁸Ga-цитрата с

цитратом стабильного железа (III) методом позитронно-эмиссионной томографии через 30-60 минут после ее введения;

3. Оценка общих токсикологических свойств растворов лиофилизатов для приготовления радиофармацевтического препарата ⁶⁸Ga-цитрат и радиофармацевтической композиции ⁶⁸Ga-цитрата с цитратом стабильного железа (III);

4. Расчет прогнозных значений поглощенных и эквивалентных доз для оценки радиационной безопасности применения ⁶⁸Ga-цитрата совместно с цитратом железа (III) при эквивалентном пересчете на человека.

Степень достоверности работы. Достоверность полученных

результатов обусловлена постановкой множества серий различных научно-
исследовательских опытов с использованием большого количества
биологических тест-систем (140 нелинейных крыс-самок массой 181,9±16,0 г,
60 нелинейных мышей-самок массой 20,3±1,7 г, 140 мышей (самок и самцов)
линии BALB/c массой 21,4±1,7 г, 210 крыс (самок и самцов) линии Sprague
Dawley массой 192,1±17,8 г) и дальнейшим анализом полученных данных в
сертифицированных лабораториях, оснащенных современным научным
оборудованием. Экспериментальные данные статистически обработаны с
применением современных компьютерных программ.

Апробация работы. Материалы и основные положения

диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научных мероприятиях (по хронологии):

1. Международная учебно-методическая и научно-практическая конференция «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и биотехнологии», посвященной 95-летию со дня основания МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 10 октября 2014 г., Москва;

2. Всероссийская научная конференция для молодых ученых «Современные проблемы биомедицинской инженерии», 6-8 апреля 2015 г., Саратов;

3. XXII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых (Международный молодежный научный форум) «Ломоносов-2015», 13-17 апреля 2015 г., Москва;

4. II и III этап Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений МСХ РФ в 2015 году в номинации «Биологические науки», 23-24 апреля 2015 г., Брянск, 22 мая 2015 г., Оренбург. Автор является победителем II и III этапов;

5. I Международная научно-практическая конференция «Актуальные проблемы разработки, производства и применения радиофармацевтических препаратов» РАДИОФАРМА-2015, 17-19 июня 2015 г., Москва;

6. X Юбилейная научная конференция «Радиационная защита и радиационная безопасность в ядерных технологиях», 22-25 сентября 2015 г., Москва-Обнинск;

7. 9-й рабочий семинар Canceropole Grand Ouest «Новые достижения в моделях животных и доклинической визуализации для трансляционных исследований в канцерологии» (9^th CGO workshop), 30 сентября – 3 октября 2015 г., Ла Тюрбаль (Франция);

8. V Съезд биофизиков России, 4-10 октября 2015 г, Ростов-на-Дону;

9. 2-й симпозиум по доклинической ядерной визуализации (PNI-2015), 9 ноября 2015 г., Лондон (Великобритания);

10. 11-я Европейская встреча по молекулярной визуализации (EMIM-2016), 8-10 марта 2016 г., Утрехт (Нидерланды);

11. 18-й Европейский симпозиум по радиофармацевтике и радиофармацевтическим препаратам (ESRR-2016), 7-10 апреля 2016 г., Зальцбург (Австрия).

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 19 работ, из них 6 статей в журналах, рекомендуемых ВАК, 1 патент Российской Федерации, 12 тезисов докладов в зарубежных журналах (3) и сборниках по итогам различных российских и зарубежных конференций (9).

Личный вклад автора. Разработка способа визуализации, а также
экспериментальные и расчетные исследования, представленные в

диссертации, проводились либо лично автором, либо при непосредственном участии автора. Исследования были осуществлены с коллективом отдела радиационных технологий медицинского назначения ФГБУ ГНЦ ФМБЦ им. А.И. Бурназяна ФМБА России под руководством к.б.н. Клементьевой О.Е. и к.х.н. Кодиной Г.Е., кому автор выражает несоизмеримую благодарность за помощь, содействие в настоящей работе, предоставление экспериментальной базы, за неоценимые советы и научное воспитание.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 162 страницах печатного текста и состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, который насчитывает 195 источников, из них 149 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 50 рисунками и 19 таблицами.

Этиологические основы возникновения воспалительного процесса

Воспаление – это комплексный, местный и общий патологический процесс, эволюционно сформировавшийся, как защитно-приспособительная реакция организма на действие патогенного раздражителя, проявляющийся развитием на месте повреждения ткани или органа изменений кровообращения и повышением сосудистой проницаемости в сочетании с дистрофией тканей, приводящий к максимальному восстановлению в зоне повреждения (Новицкий В.В. и др., 2009).

Как патологический процесс, лежащий в основе большинства заболеваний человека, воспаление является центральной проблемой патологии на протяжении всей истории учения о болезни. Формирование представлений о сущности воспаления издавна было тесно связано с развитием взглядов на природу болезни.

На ранних этапах изучения воспаления доминировали теории Р. Вирхова (1858) и Ю. Конгейма (1885). Согласно клеточной (аттракционной, нутритивной) теории Р. Вирхова, воспаление заключается в нарушении жизнедеятельности клеточных элементов в ответ на раздражение, развитии дистрофических изменений, состоящих в появлении в клетках белковых зерен и глыбок, притяжении (аттракции) питательного (нутритивного) материала из жидкой части крови, возникновении мутного набухания цитоплазмы.

По сосудистой теории Ю. Конгейма воспаление характеризуется расстройствами кровообращения, приводящими к экссудации и эмиграции, обусловливающими последующие клеточные (дистрофические) изменения. Однако, как впоследствии было установлено, воспаление характеризуется одновременным развитием и тесной взаимосвязью сосудистых и тканевых явлений. Ю. Конгеймом впервые детально описана вся совокупность изменений сосудистого тонуса и кровотока с экссудацией и эмиграцией.

Особенно большой вклад в изучение воспаления внес известный русский ученый, лауреат Нобелевской премии 1908 г. И.И. Мечников (1892). Он положил начало сравнительной патологии воспаления, теории клеточного и гуморального иммунитета, учению о фагоцитозе и сформулировал биологическую (фагоцитарную) теорию воспаления. Согласно ей, воспаление проявляется в локализации и отграничении воспалительного очага от здоровых тканей, фиксации в очаге воспаления патогенного фактора и его уничтожении, в удалении продуктов распада и восстановлении целостности тканей, а также выработке в процессе воспаления иммунитета. Проанализировав воспалительную реакцию у различных видов животных, стоящих на разных ступенях эволюционного развития, И.И. Мечников отметил ее усложнение в филогенезе, что позволило показать значение воспаления как защитно-приспособительной реакции всего организма.

В первой половине нынешнего столетия учение о воспалении стало развиваться в связи с возникновением биофизических и биохимических методов. Результаты разносторонних физико-химических исследований воспалительного очага позволили Г. Шаде (1923) выдвинуть физико-химическую, или молекулярно-патологическую, гипотезу воспаления. Согласно этой теории ведущим в патогенезе воспаления является местное нарушение обмена веществ, приводящее к развитию ацидоза и повышению осмотического давления в ткани, лежащих, в свою очередь, в основе расстройств кровообращения и клеточных явлений. Однако вскоре было показано, что физико-химические изменения, характерные для очага воспаления, обнаруживаются в ходе уже развившейся воспалительной реакции и, следовательно, не могут быть пусковым механизмом сосудистых и клеточных явлений (Альперн Д.Е., 1931).

На основании результатов широких патохимических исследований В. Менкин пришел к выводу о ведущей роли биохимических сдвигов в патогенезе воспаления (Менкин В., 1948). Он выделил ряд специфических для воспаления веществ, опосредующих различные воспалительные феномены – некрозин, экссудин, лейкотоксин, пирексин и др. Как установлено с тех пор, такую роль действительно выполняют физиологически активные вещества – медиаторы воспаления, многие из которых в настоящее время идентифицированы и достаточно изучены. Однако свести весь патогенез воспаления только к разрозненным эффектам отдельных медиаторов было бы неправильным.

Также было установлено участие нервной системы в патогенезе воспаления, возникли гипотезы, отдающие первостепенную роль нервному фактору – рефлекторным механизмам, нарушению трофической функции нервной системы. Так, по вазомоторной (нервно-сосудистой) теории Г. Риккера (1924) первичным в возникновении воспаления является расстройство функции сосудодвигательных нервов. В зависимости от степени их раздражения и, следовательно, развивающейся сосудистой реакции складывается такое соотношение между тканью и кровью, которое ведет к возникновению воспалительной гиперемии и стаза и, соответственно, обусловливает интенсивность и характер нарушений обмена веществ (Риккер Г., 1987). Однако вся совокупность воспалительных явлений не может быть объяснена только реакцией сосудов микроциркуляторного русла.

Альперн Д.Е. особое внимание уделял вопросу единства местного и общего в воспалении, роли реактивности организма в развитии этого процесса. Он подчеркивал сущность воспаления как общей реакции организма на действие вредного агента. Им обоснована нервно-рефлекторная схема патогенеза воспаления, согласно которой различные сосудисто-тканевые реакции регулируются нервной и гуморальной (главным образом гипофизарно-надпочечниковой) системами.

Расчет используемых активностей и доз для исследований

Относительно дешевый и низкотоксичный 67Ga-цитрат, пришедший на смену ранее применяющегося 59Fe-цитрата (Sephton R.G. et al., 1978), используется для визуализации воспалений и инфекций более 40 лет (Ito Y. et al., 1971; Lavender J.P. et al., 1971; Palestro C.J. et al., 1994). 67Ga (T = 78,28 ч) является чистым -излучателем – 93 кэВ (36%), 185 кэВ (20%), 300 кэВ (16%) и 394 кэВ (5%), – распадается электронным захватом в стабильный 67Zn. 67Ga получают на циклотроне по реакции 68Zn(p,2n)67Ga. Радионуклиды галлия были одними из первых (вместе с изотопами йода и фосфора), которые ядерная медицина взяла на вооружение для диагностики и лечения злокачественных новообразований (Raymond L.H., 1978).

Для 67Ga-цитрата зачастую характерна визуализация костно-инфекционных и легочных воспалений, а также воспалительных процессов, связанных с ангиофиброматозом, лимфогранулематозом, нодулярным склерозом, свежими репаративными изменениями в тканях, лимфаденопатией (Куражов А.П. и др., 2012). Долгие годы 67Ga-цитрат использовали в качестве «золотого стандарта» для дифференциальной диагностики лихорадки неясного генеза (Staab E.V., Mc Cartney W.H., 1978).

Наиболее устойчивая степень окисления галлия в водных растворах составляет 3+ (Bartholoma D. et al., 2010). В свободном состоянии катион Ga3+ может существовать в водном растворе только при сильнокислых pH 3,0. В интервале pH от 3,0 до 7,0 Ga3+, без присутствия стабилизирующих лигандов, постепенно гидролизуется с образованием нерастворимого гидроксида Ga(OH)3. При физиологическом pH крови ( 7,4) Ga(OH)3 превращается в растворимый комплексный анион [Ga(OH)4]-. При этом возможно достижение концентрации [Ga(OH)4]– 2,5 10-6 моль/л без образования нерастворимого Ga(OH)3 (Green M.A., Welch M.J., 1989). Такой анион небольших размеров способен проникать через самые разнообразные биологические мембраны.

Хотя механизм накопления 67Ga-цитрата в воспаленных тканях до конца не изучен, известно, что после его внутривенного введения, происходит реакция перелигандирования, и он связывается с транспортными (трансферрин, лактроферрин) и другими железосодержащими белками крови (ферритин), в том числе с ферментами (РНК-, ДНК-редуктазы), подобно железу, что возможно, благодаря сродству галлия к ним на несколько порядков выше в слабощелочной среде, чем к цитрату (Moerlein S.M., Welch M.J., 1981; Harris W.R., Pecoraro V.L., 1983; Martinez J.L. et al., 1990). На сродство галлия к железосвязывающим белкам указывали многие химики еще до внедрения галлия в биологическую и медицинскую практику (Hartman R.E., Hayes R.L., 1969; Gunasekera S.W. et al., 1972; Hara T., 1974; Larson S.M. et al., 1978; Hoffer R., 1980; Vallabhajosula S.R. et al., 1980).

Трансферрин в свою очередь, являясь белком острой фазы воспаления, доставляет галлий в патологические очаги через высокопроницаемые стенки сосудов и трансферриновые рецепторы CD71, которыми богаты многие ткани (Larson S.M. et al., 1979). Затем pH в очаге воспаления резко снижается из-за работы протонно-ионных насосов и вследствие ацидоза, поэтому галлий-трансферриновый комплекс разрушается, высвобождая металл для связывания с лактоферрином из погибающих лейкоцитов, ферритином из макрофагов и бактериальными сидерофорами при инфекционно-воспалительных процессах, чьи комплексы более устойчивы при кислых значениях pH (Gelrud L.G. et al., 1974; Ando A. et al., 1990). Ряд авторов указывали на сродство галлия к лактоферрину еще до достижения очагов воспаления, что означает первоочередное накопление галлия в лейкоцитах, а затем совместно в воспалении (Weiner R.E. et al., 1981; Bernstein L.R., 1998; Love C., Palestro C.J., 2004).

В силу образования комплексов металл-белок логично обнаружение галлия в малых количествах в грудном молоке, слезах, слизистых носоглотки, селезёнке, печени и других областях с высокой экспрессией трансферриновых рецепторов и ферритина. Галлий также аккумулируется в местах остеогенной активности и костной резорбции, часто характерных для опухолевых процессов (Weiner R.E., 1996).

Вместе с тем достаточное связывание 67Ga с белками крови приводит к ее медленному клиренсу от радиоактивности и соответственно более длительному периоду накопления в патологических очагах (Tsan M.F., 1985). Следствием такого поведения является низкое отношение концентрации радионуклида в очаге воспаления к его концентрации в циркулирующей крови в первые часы после введения, что приводит к неблагоприятным последствиям: необходимость откладывания процедуры сканирования (на 24–72 ч) из-за нецелесообразности получения «нечитаемых» и неинформативных сцинтиграмм в первые часы после введения; в свою очередь длительный период ожидания сканирования лишает возможности оценки биораспределения и выведения препарата в невизуализируемых в первые часы органах (кишечник, легкие, сердце, почки); длительный период циркуляции в крови большого количества галлия-67 приводит к получению пациентом высоких лучевых нагрузок, тем самым снижая показатель «эффективность/безопасность» препарата (Weiner R., 1990). Рисунок 16. Сцинтиграммы, полученные через 0, 2, 4, 6, 24 ч, после введения 67Ga-цитрата кролику с моделью легочного аспергиллеза (указан стрелкой), (заимствовано из van Eerd J.E.M., Rennen H.J.J. et al., 2004). 68Ga-цитрат и другие 68Ga-меченные радиофармацевтические препараты РФП для ПЭТ-визуализации зачастую имеют в своем составе радионуклиды с дорогостоящим циклотронным способом получения (11C, 13N, 18F, 64Cu, 89Zr и др.). Однако развитие и распространение ПЭТ-центров в России и за рубежом, с одной стороны, и нехватка циклотронов в медицинских учреждениях с их дорогостоящей эксплуатацией, с другой стороны, подталкивают ученых и клиницистов к использованию более дешевых и доступных генераторных радионуклидов, одним из которых является изотоп галлия 68Ga, получаемый из генератора 68Ge/68Ga (Yano Y., Anger H.O., 1964; Кодина Г.Е., 1998; Fani M. et al., 2008; Rsch F., 2012).

68Ga распадается путем электронного захвата (ЭЗ) (10 %) и испускания позитронов (90 %, Е+ = 1900 кэВ). Распад сопровождается эмиссией аннигиляционных -квантов (Е = 511 кэВ, выход 180 %) и -квантов с энергией Е = 1077,4 кэВ (выход 2,93 %). Радионуклид получают на месте применения элюированием генератора 68Ge/68Ga.

Одним из перспективных препаратов для ПЭТ-визуализации воспалений является 68Ga-цитрат – аналог 67Ga-цитрата. Однако описанные выше недостатки, связанные с чрезмерной аффинностью галлия к железосодержащим белкам крови, исключают возможность применения короткоживущего изотопа (T (68Ga) = 67,7 мин).

Визуализация смоделированных воспалительных процессов методом позитронно-эмиссионной томографии

В настоящее время для определения доз внутреннего облучения принят расчетный метод, включающий сведения о заранее известных ядерно-физических характеристиках инкорпорированного радионуклида и о биораспределении РФП, благодаря методам радиометрии и томографии. При расчете лучевых нагрузок в органе / необходимо учитывать все виды излучения (Малаховский В. Н. и др., 2008). К примеру, изотоп галлия 68Ga является одновременно +- и -эмиттером за счет аннигиляции, поэтому в простом виде формула поглощенной дозы органа / должна выглядеть как сумма поглощенных доз от гамма-квантов и позитронов: Dtot(t) = Da(t) + Dy(t); (12) о где D\ot(t) - функция общей поглощенной дозы органа / в единицу времени t; Dlo(t) - функция поглощенной дозы органа / от +-излучения в единицу времени t; Dy(t) - функция поглощенной дозы органа / от -излучения в единицу времени t; т - масса фантома (отдельного органа или биологического объекта в целом); $ и гу - отношение суммарного выхода частиц данного типа; F(t) - зависимость по времени от активности радионуклида от момента введения до момента t с учетом радиоактивного распада.

Энергии гамма-квантов, испускаемых при распаде, таковы, что облучение органов животного гамма-квантами радионуклида, инкорпорированного в соседних органах и тканях, может быть заметным. Иными словами, лучевая нагрузка данного органа зависит не только от поглощенной дозы самого органа /, но и от дозы соседних органов у. Пробеги же позитронов столь малы, что практически вся их энергия поглощается в том органе, в котором инкорпорирован радионуклид. Таким образом, энергия излучения гамма-квантов органов /дает дополнительную лучевую нагрузку на орган І, что необходимо учесть в формуле поглощенной дозы: ВЕв + уЕу sr Dltot(t) = у F(t)dt У dji; (15) о і где YJJ dji - сумма фракций поглощенных энергий djt в і-м органе за счёт радионуклида, содержащегося в j-м органе (конверсионный фактор дозы).

Расчеты переноса ионизирующего излучения в организмах лабораторных животных для величины _/ dji выполняются с помощью метода статистических испытаний (метода Монте-Карло), который предполагает так называемый «розыгрыш» всех возможных вариантов взаимодействия излучения с веществом (поглощение, рассеяние и т. д.) посредством генерирования случайных чисел. Взаимодействие излучения с веществом зависит от плотности ткани и ее элементарного состава, подразумевающего вероятность «попадания» в ядро определенного химического элемента. На практике пользоваться методом Монте-Карло вручную нецелесообразно в силу трудоемкого математического вычисления, требующего больших временных затрат, поэтому удобнее применять прикладные пакеты компьютерных программ MCNP (Yoriyaz H. et al., 2001).

Формулы расчета поглощённых доз, которые используются на практике, выглядят иначе, хотя от этого их физический смысл не изменяется. К примеру, уравнение, используемое Обществом ядерной медицины (Society of Nuclear Medicine, SNM, США) для расчета дозы в органе / от источников внутреннего облучения у, предложено Комитетом по дозиметрии (Committee Medical Internal Radiation Dose, MIRD) и выглядит в соответствии с формулой (Loevinger R. et al., 1988): D(i -y) = Aj S(i -y) = A0Tj S(i -y) (16) где Aj - накопленная в органе-источнике активность РФП, равная полному числу ядерных распадов в этом органе (мКич или МБк-с); ту резидентное время (с), численно равное —; Аа - введенная активность (МБк), и S(i г- у) - поглощенная доза в органе-мишени / на единицу активности, накопленной в органе-источникеу, определяется как: кїіЩЕіф - j) SU - /) = (17) 771 где щ - количество излучений с энергией Ei (МэВ), испускаемых за один ядерный переход в органе / с поглощенной фракцией ер (і - у), являющуюся аналогом величины _/ dji; т - масса целевого органа, г; к константа пропорциональности, 2,13 или 1,602 Ю-7 . мКи-ч-МэВ Бк-с-МэВ Следует отметить, что вклад в поглощенную дозу органа-мишени вносят не только соседние органы-источники, но и сам орган-мишень с собственной накопленной активностью, иначе говоря, орган-мишень одновременно для себя также выполняет роль органа-источника.

В Международной комиссии по радиологической защите (International Commission on Radiological Protection, ICRP) (ICRP Pub 60, 1991) используется следующее уравнение для расчета эффективной дозы: Е = У Н WT = У (D WR) WT (18) где Е - эффективная доза, численно равная произведению поглощенной дозы D на соответствующий взвешенный коэффициент WR; WT -взвешенный коэффициент для определенного органа или ткани (103 Публикация МКРЗ от 2008 г.).

По мнению Stabin M.J. и Siegel J.A. (Stabin M.G., 2008), системы расчета доз из руководств MIRD и ICRP могут быть приспособлены с помощью универсального уравнения, переменные которого интуитивно более понятны большинству исследователей: D = N DF (19) „ мГр где и - лучевая нагрузка органа или ткани, —; N - число ядерных МБк превращений в органе (накапливаемая активность), наблюдавшееся в Т МБк-ч исходной области (эквивалент для Л,), , соответствует интегралу от функции Г F(t)dt, отражающей зависимость выведения препарата во п„ мГр времени; DP - конверсионный фактор дозы (эквивалент для Ь . ), МБк.ч Конверсионный фактор учитывает все остальные математические операторы (ядерные характеристики радионуклида, массы органов, фракции органов, рассчитанные в программе MCNP) и чаще всего имеет табличные значения для стандартных фантомов животных и человека.

Поэтому соблюдение оптимального соотношения информативности и безопасности является приоритетным при разработке диагностических и терапевтических РФП, так как их применение сопряжено с риском развития ряда осложнений, напрямую связанных с ионизирующим излучением радионуклида (Stabin M.G., Siegel J.A., 2003).

Исследование хронической токсичности

Результаты, представленные ниже, по прогнозному расчету поглощенных доз являются вероятностными, так как экстраполированы с организма лабораторных животных на человека, и могут служить для оценки общей дозиметрической картины. Важно отметить, что создаваемые поглощенные дозы в организме человека крайне индивидуальны, поэтому в условиях клиники при проведении диагностических и терапевтических мероприятий с применением РФП необходимо вести учет создаваемых лучевых нагрузок и безопасности персонально. Иными словами, дозиметрия РФП и дозиметрическое планирование при проведении радионуклидной диагностики или терапии должны быть персонализированы.

Для получения величин накапливаемой активности (резидентного времени) всех органов и тканей были использованы экстраполированные значения на организм человека по данным распределения препарата 68Ga-цитрата с использованием программы OLINDA/EXM 1.0.

Физический смысл накапливаемой (резидентного времени) активности N показывает, какая активность радионуклида (МБк) в исследуемом органе или ткани накопится за 1 час при введении препарата активностью 1 МБк. В свою очередь суммарный фактор дозы показывает, какая поглощенная доза (мГр) формируется в органе или ткани i за счет собственного накопления и окружающих ее органов или тканей j за 1 час при введении препарата активностью 1 МБк. При расчете факторов дозы учитывались ядерно-физические характеристики изотопа галлия-68. Суммарное значение фактора дозы зависит от вклада в поглощенную дозу соседних органов и тканей, а также накопления в них. К примеру, для селезенки фактор дозы, выше (табл. 16), чем для остальных органов, но формируемая поглощенная доза в ней меньше (табл. 17).

Вклад позитронного р+-излучения в большинстве органов и тканей выше, по сравнению с у-излучением, что обусловлено высокой энергией р+ 127 излучения у изотопа галлия Ga (Е зл = 1,76 МэВ) и высокой ЛПЭ, а также малым пробегом позитронов в тканях. Наибольшие поглощенные дозы регистрировались в мочевом пузыре и почках в связи с его интенсивным выведением и кишечнике в силу близкого расположения к органам мочевыделения, и при вводимой диагностической активности 400 МБк составили, соответственно, 18,4 мГр, 11,6 мГр и 23,7 мГр (рис. 47).

Гистограмма прогнозных поглощенных доз, создаваемых в органах и тканях организма человека, при введении 400 МБк 68Ga-цитрата. ККМ – красный костный мозг.

Как отмечается в МКРЗ, признавая потенциальную значимость наблюдений за пациентами после облучения в медицинских целях, Комиссия (МКРЗ) решила, что имеющиеся в настоящее время данные не позволяют включить в оценку вреда облучение в малых дозах, не превышающих около 100 мЗв (МКРЗ 103, 2009), выше приведенные дозы в разы меньше. Этот вывод согласуется с мнением НКДАР ООН (2008), который указал на небольшое число доказательств наличия какого-либо избыточного риска при облучении в дозе менее 1 Гр (Mettler F.A. et al., 2008).

Рассчитанные в настоящем исследовании лучевые нагрузки, создаваемые препаратом 68Ga-цитрат в организме человека, сопоставимы с поглощенными дозами других известных РФП для визуализации воспалений (табл. 18), применяемых не только в позитронно-эмиссионной (ПЭТ), но и в однофотонно-эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). Сравнение поглощенных доз, создаваемых в организме человека, настоящего исследования (отмечено ) с поглощенными дозами других радиофармпрепаратов для визуализации воспалений

Лучевые нагрузки, создаваемые препаратом 18F-FDG для большинства органов сопоставимы с нагрузками, создаваемыми 68Ga-цитратом. Для 67Ga-цитрата поглощенные дозы на порядок выше, чем у цитрата, меченного 68Ga. Аналогичные высокие лучевые нагрузки создаются лейкоцитами, меченными индием 111In, что связано с высокой энергией -излучения, большим периодом полураспада радионуклида, а также малой скоростью и долей накопления от общего числа лейкоцитов в воспалении. Немногим меньше создают лучевые нагрузки лейкоциты и человеческие иммуноглобулины (HIG, human immunoglobulin), меченные технецием 99mTc, для ОФЭКТ-исследований, чьи недостатки известны по отношению к ПЭТ.

Несущественная разница между настоящими расчетами и расчетами по 68Ga-цитрату (рис. 48), представленными в сборнике (Stabin M.G. et al., 1996), . Сравнение удельных поглощенных доз (мкГр/МБк) для 68Ga-цитрата. Примечание: Ga-68 cit – настоящие исследования, Ga-68 cit (CE) – литературные данные (Stabin M.G. et al., 1996), рассчитанные для антропоморфного фантома Christy Eckerman Необходимо отметить немногим большие нагрузки в органах мочевыделительной системы (почки, мочевой пузырь), что связано с более интенсивным выведением, благодаря введению дополнительного химического агента для частичного блокирования металлсвязывающей способности трансферрина в крови.

Для оценки отдаленных детерминированных последствий рекомендуется использовать эффективную дозу, учитывающую долю критичности от общего количества инкорпорированного радионуклида. При сравнении полученной в настоящих исследованиях эффективной дозы E с дозой других известных РФП для визуализации воспалений (табл. 19) следует отметить, что данные величины не должны интерпретироваться, как персональная оценка риска – эффективная доза необходима для оценки безопасности среднего значения в популяции.