Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Перспективы применения генистеина как средства профилактики и патогенетичской терапии радиационных поражений (обзор литературы) 18
1.1 Современные подходы к фармакологической профилактике и терапии радиационных поражений 18
1.2 Фармакологические свойства изофлавоноида генистеина 24
1.3 Радиозащитная эффективность генистеина 39
ГЛАВА 2 Материалы и методы 46
2.1 Выбор и содержание лабораторных животных 46
2.2 Характеристика используемых препаратов 47
2.3 Оценка острой токсичности синтетического генистеина 52
2.3.1 Изучение показателей выживаемости и клинической картины интоксикации животных при введении им синтетического генистеина в растворе полиэтиленгликоля 52
2.3.2 Изучение показателей выживаемости и клинической картины интоксикации животных при введении им синтетического генистеина в растворе диметилсульфоксида 53
2.3.3 Методика морфологических исследований 54
2.4 Радиобиологические методы 55
2.4.1 Условия облучения 55
2.4.2 Оценка выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных 56
2.4.3 Определение фактора изменения дозы 56
2.5 Гематологические методы 57
2.5.1 Определение количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови 57
2.5.2 Определение количества колоний на селезенке методикой эндогенного колониеобразования 57
2.5.3 Определение количества колоний на селезенке методикой экзогенного колониеобразования 58
2.6 Биохимические методы 60
2.6.1 Методы исследования биохимических показателей сыворотки крови 60
2.6.2 Определение показателей системы глутатиона в эритроцитах периферической крови 61
2.6.3 Оценка антиоксидантной активности синтетического генистеина методом хемилюминесценции 63
2.7 Оценка поведенческих реакций крыс в тесте «Открытое поле» 63
2.8 Статистическая обработка результатов 64
ГЛАВА 3 Оценка острой токсичности синтетического генистеина 66
3.1 Изучение основных показателей острой токсичности генистеина, растворенного в полиэтиленгликоле 66
3.2 Изучение основных показателей острой токсичности генистеина, растворенного в диметилсульфоксиде 71
ГЛАВА 4 Изучение фармакодинамики синтетического генистеина 76
4.1 Влияние генистеина на гематологические показатели крыс 76
4.2 Влияние генистеина на биохимические показатели крыс 80
4.3 Изучение антиоксидантных свойств генистеина на модели in vitro 83
4.4 Влияние генистеина на состояние системы глутатиона в эритроцитах периферической крови крыс 84
4.5 Влияние генистеина на цитокиновый статус крыс 89
4.6 Влияние генистеина на эстрогенный статус крыс 92
4.7 Влияние генистеина на поведение крыс 93
ГЛАВА 5 Оценка радиозащитной эффективности синтетического генистеина при остром внешнем радиационном воздействии 96
5.1 Оценка радиозащитной эффективности генистеина при различных схемах применения препарата в условиях острого внешнего облучения 96
5.2 Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина, мексидола, литана и цитохрома С по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей 99
5.3 Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина и -эстрадила по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей 104
5.4 Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина 106
и цистамина по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей 106
5.5 Влияние генистеина на функцию кроветворения облученных мышей, оцененную с применением методик эндогенного и экзогенного колониеобразования. 109
5.6 Влияние генистеина на гематологические показатели облученных крыс 112
5.7 Влияние генистеина на состояние системы глутатиона и перекисного
окисления липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс 119
ГЛАВА 6 Возможные пути реализации радиозащитной эффективности генистеина (обсуждение полученных результатов) 126
Выводы 146
Практические рекомендации 149
Список сокращений 150
Список литературы 151
- Фармакологические свойства изофлавоноида генистеина
- Изучение показателей выживаемости и клинической картины интоксикации животных при введении им синтетического генистеина в растворе диметилсульфоксида
- Изучение основных показателей острой токсичности генистеина, растворенного в диметилсульфоксиде
- Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина, мексидола, литана и цитохрома С по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Использование источников ионизирующих излучений в промышленности, науке и медицине в ряде случаев может привести к сверхнормативному воздействию радиации как на отдельного человека, так и на популяцию в целом. Не снижается опасность аварийного облучения при ликвидации последствий ядерных катастроф на объектах атомной энергетики, примером чему могут служить радиационные аварии в США, Англии, Франции, СССР (в т.ч. на Чернобыльской АЭС) и России, Японии [Иванов В.К. и др., 2011; Chin F.K.C., 2007; Vogel H., 2007; Yamamoto L.G., 2013]. Существует вероятность ядерного и радиологического терроризма, что неизбежно создает дополнительный риск радиоактивного загрязнения окружающей среды, поражения людей, животных и растительного мира [Булдаков Л.А. и др., 2007; Timins J.K., Lipoti J.A., 2003; Anderson P.D., Bokor G., 2013]. Проблема радиационных поражений здоровых органов и тканей, которые нередко встречаются в результате проведения лучевой терапии опухолей, также не снимается с повестки дня [Ярмоненко C.П. и др., 2005; Гуськова А.К., 2008; Mornson W.H. et al., 2000]. По мнению ряда авторов [Ушаков И.Б. и др., 2013; Atwell W.A. et al., 2004], именно радиационный фактор может стать главным барьером на пути продвижения человека в космос. Все эти ситуации требуют дальнейшего совершенствования радиационной безопасности, важным элементом которой является использование фармакологических средств. Однако, разработанные к настоящему времени радиозащитные препараты далеки от совершенства, вследствие чего создание и испытание новых высокоэффективных медицинских средств противорадиационной защиты является одной из актуальных проблем современной радиобиологии, фармакологии и клинической фармакологии [Назаров В.Б. и др., 2008; Васин М.В., 2010; Seed T.M., 2005; Xiao M. et al., 2009].
В настоящее время работы по поиску, разработке и созданию, экспериментальному (доклиническому) изучению безопасности, фармакодинамики и механизмов действия новых противолучевых лекарственных средств на животных и в опытах in vitro активно продолжаются [Легеза В.И. и др., 2008; Антушевич А.Е. и др., 2012; Gudkov A.V., Komarova E.A., 2010; Koukourakis M.I., 2012; Wang X.Y. et al., 2013]. При этом большое внимание уделяется веществам природного происхождения и их синтетическим аналогам, которые могут быть эффективны как при профилактическом, так и лечебном их применении [Jagetia G.C., 2007; Weiss J.F., Landauer M.R., 2009]. Особое значение придается тому, чтобы впервые синтезированный фармакологический препарат был не только высокоэффективным, но и безопасным, удобным в применении и мог использоваться в обычной медицинской практике, т.е. имел бы двойное назначение.
Степень разработанности темы исследования
В настоящее время многочисленные отечественные и зарубежные исследователи показывают перспективность использования для профилактики и терапии радиационных поражений ингибиторов свободнорадикальных реакций, т.е. антиоксидантов, которые, являясь эффективными регуляторами окислительных процессов, проявляют радиозащитные свойства при остром облучении животных в сублетальных и минимально летальных дозах [Бурлакова Е.Б., 2007; Мороз Б.Б. и др., 2009; Шишкина Л.Н., 2013; Weiss J.F., Landauer M.R., 2000; Kumar K.S. et al., 2002]. Динамично развиваются исследования по оценке противолучевых свойств стимуляторов гемопоэза, в частности цитокинов и их индукторов [Смирнов Н.А. и др., 2000; Легеза В.И. и др., 2008; Рождественский Л.М. и др., 2008; Grebenyuk А. et al., 2007]. Не прекращается поиск средств профилактики и раннего лечения лучевых поражений среди веществ стероидной структуры, в частности, эстрогенов и их природных аналогов – фитоэстрогенов [Гребенюк А.Н. и др., 2012; Whitnall M.H. et al., 2002; Taghizadeh B. et al., 2013].
В настоящее время в качестве одного из наиболее перспективных радиозащитных средств рассматривается изофлавоноид сои – генистеин, полученный из природных источников растительного происхождения [Landauer M.R. et al., 2000, 2010]. Весьма интересным является тот факт, что для генистеина, по данным экспериментальных наблюдений, характерно наличие антиоксидантных свойств [Lengyel J. et al., 2013], стимулирующее влияние на продукцию цитокинов [Zhou Y., Mi M., 2005], а также умеренная эстрогенная активность [Zhu R. et al., 2012]. Кроме того, препарат обладает и другими биологическими эффектами: регулирует апоптоз, пролиферацию и дифференцировку клеток [Liu X. et al, 2013], повышает сопротивляемость организма при химиотерапии [Versantvoort C.H.M. et al., 2007], индуцирует апоптоз опухолевых клеток [Polkowski K., 2000; Schultz D.R., Harrington W.J.Jr., 2003], подавляет ангиогенез новообразований [Zhou J.R. et al., 2000] и функции остеокластов [Bliar H.C. et al., 1996], снижает активацию и пролиферацию лимфоцитов [Sakai T., 2008], оказывает влияние на тучные клетки и проявляет умеренные противовоспалительные свойства [Verdrengh M. et al., 2003].
Кроме того, генистеин обнаруживает в эксперименте выраженную радиозащитную активность при хорошей переносимости [Landauer M.R. et al., 2003; Day R.M. et al., 2013; Ha C.T. et al., 2013]. Однако возможности практического применения этого препарата ограничиваются его весьма недешевым производством из растительного сырья, а также трудностями, связанными с получением стабильного, хорошо очищенного препарата. Химическая структура генистеина изучена в достаточной степени [Rozman K.K. et al., 2006] и российским ученым удалось синтетическим путем получить вещество, полностью соответствующее природному аналогу. Однако экспериментальное (доклиническое) изучение острой токсичности, во многом определяющей безопасность применения препарата, исследование фармакодинамики и механизмов действия синтетического генистеина, а также оценка его радиозащитной эффективности в условиях острого облучения до настоящего времени не проводились, что послужило основанием для выполнения настоящей работы.
Цель исследования:
Экспериментально оценить острую токсичность и фармакологические свойства синтетического генистеина, а также его радиозащитную эффективность при остром воздействии рентгеновского излучения.
Задачи исследования:
-
В опытах на мелких лабораторных животных определить острую токсичность синтетического генистеина при различных способах его введения.
-
Изучить влияние синтетического генистеина на морфологический состав периферической крови, биохимические показатели углеводного, белкового и липидного обменов, содержание провоспалительных цитокинов и -эстрадиола в сыворотке крови белых беспородных крыс.
-
Провести сравнительную оценку антиоксидантных свойств генистеина, кверцетина и аскорбиновой кислоты in vitro, а также изучить влияние препарата на систему глутатиона и перекисное окисление липидов в эритроцитах периферической крови интактных крыс.
-
Оценить радиозащитную эффективность синтетического генистеина по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни мышей, подвергнутых острому воздействию рентгеновского излучения, при различных схемах применения препарата.
-
Провести сравнительную оценку радиозащитной эффективности синтетического генистеина, антиоксидантов (мексидола, литана, цитохрома С), эстрогенов (-эстрадиола) и серосодержащих радиопротекторов (цистамина) по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей.
-
Изучить механизмы радиозащитного действия синтетического генистеина в отношении костномозгового кроветворения и клеточного состава периферической крови облученных животных.
-
Исследовать влияние синтетического генистеина на постлучевые изменения показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс.
Научная новизна
Впервые проведена оценка острой токсичности, фармакологических свойств и радиозащитной эффективности отечественного синтетического генистеина.
Установлена плохая растворимость синтетического генистеина в воде, масле и ТВИНе-80. Показано, что генистеин хорошо растворяется в полиэтиленгликоле и диметилсульфоксиде, при этом, в отличие от полиэтиленгликоля, раствор препарата в диметилсульфоксиде в проведенных исследованиях не оказывал токсического влияния на организм мелких лабораторных животных. Определена численная характеристика токсичности препарата, растворенного в диметилсульфоксиде, на основании которой отечественный синтетический генистеин можно рассматривать как малотоксичное соединение.
Установлено, что однократное внутрибрюшинное введение синтетического генистеина не изменяет морфологического состава крови и не нарушает течения основных обменных процессов в организме животных. Выявлено, что на модели in vitro синтетический генистеин обладает антиоксидантными свойствами, выраженность которых уступает кверцетину, но сопоставима с таковыми у аскорбиновой кислоты. Показано, что внутрибрюшинное введение генистеина крысам сопровождается увеличением концентрации восстановленного глутатиона и активацией сопряженных ферментов, а также способствует увеличению содержания провоспалительных цитокинов в сыворотке крови крыс через 1 и 24 ч после введения препарата. Установлено стимулирующее влияние генистеина на синтез и продукцию -эстрадиола, содержание которого в сыворотке крови крыс по сравнению с контролем было более чем в 2 раза выше уже через 1 ч после введения препарата. Показано, что введение синтетического генистеина не сопровождается изменением эмоционального статуса и двигательной активности белых беспородных крыс.
Обнаружено, что синтетический генистеин обладает противолучевой эффективностью при остром внешнем радиационном воздействии. При этом выраженный защитный эффект наблюдался при внутрибрюшинном введении препарата за 1 ч до острого рентгеновского облучения в дозах СД50-90/30. Введение препарата мышам за 24 ч до или через 1 ч после облучения, а также курсом из 5 инъекций – один раз в день в течение 5 сут после радиационного воздействия, не оказывало существенного противолучевого эффекта.
Показано, что при профилактическом однократном применении за 1 ч до облучения синтетический генистеин более эффективно снижал летальность облученных в дозах СД50-90/30 мышей, чем мексидол, цитохром С или литан, обладал сопоставимой с -эстрадиолом радиозащитной эффективностью, но проявлял менее выраженные противолучевые свойства, чем цистамин.
Установлено, что профилактическое применение синтетического генистеина сопровождалось увеличением количества сохранивших жизнеспособность гемопоэтических клеток и снижением выраженности постлучевой гемодепрессии в отношении общего числа лейкоцитов и тромбоцитов, а также абсолютного количества нейтрофилов. Показано, что введение генистеина за 1 ч до острого лучевого воздействия снижало выраженность оксидантного стресса, оцененного по содержанию в эритроцитах периферической крови облученных крыс малонового диальдегида и восстановленного глутатиона.
Теоретическая и практическая значимость
В результате проведенного исследования научно обоснована возможность и целесообразность применения синтетического генистеина в качестве средства повышения радиорезистентности организма путем его влияния на антиоксидантную, кроветворную и иммунную системы организма. Опираясь на принципы доказательной медицины, показано, что применение синтетического генистеина в дозе 200 мг/кг за 1 ч до острого внешнего рентгеновского облучения способствует увеличению выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных, а также снижению выраженности постлучевых нарушений костномозгового кроветворения и морфологического состава периферической крови, изменений в системе глутатиона и перекисном окислении липидов в эритроцитах периферической крови облученных крыс. Сформулированы и научно обоснованы возможные механизмы радиопротекторного действия синтетического генистеина, связанные со способностью препарата предотвращать постлучевую депрессию кроветворения, уменьшать выраженность лейко- и тромбоцитопении, а также стимулировать систему антиоксидантной защиты организма.
Практическая значимость заключается в экспериментальном обосновании возможности использования отечественного синтетического генистеина в медицинской практике, в том числе в качестве перспективного средства медицинской противорадиационной защиты. Выявленные у препарата гипохолестеринемические, антиоксидантные, эстрогенные свойства, а также стимулирующее влияние генистеина на продукцию цитокинов позволяют найти ему применение при фармакотерапии ряда заболеваний. Кроме того, проведена апробация различных схем применения синтетического генистеина для защиты организма от негативного воздействия острого облучения в поражающих дозах.
Полученные результаты о малой токсичности, фармакологических свойствах, радиозащитной эффективности и возможных механизмах реализации противолучевого эффекта синтетического генистеина позволяют рекомендовать дальнейшее экспериментальное изучение препарата при различных вариантах облучения.
Методология и методы исследований
На проведение экспериментального исследования получено разрешение локального независимого комитета по вопросам этики при Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (протокол № 129 от 16.10.2012 г).
Исследование проводилось на базе кафедры военной токсикологии и медицинской защиты ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» МО РФ. Работа была выполнена на 215 белых беспородных крысах (203 самцах и 12 самках) массой 180-220 г, 1118 самцах мышей первого поколения СВА х С57В1 (100 особей) и белых беспородных (1018 особей), 100 самках белых беспородных мышей массой 18-22 г разводки питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово» (пос. Рапполово Ленинградской обл.).
В работе использовали генистеин – препарат, синтезированный во ФГУП «Научно-производственный центр «Фармзащита» ФМБА России. Генистеин полностью соответствовал по структуре природному аналогу и представлял собой кристаллический порошок светло-желтого цвета. Оценку острой токсичности препарата проводили в соответствии с Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (2011). Генистеин растворяли в воде, масле, ТВИНе-80, ПЭГ-400 и ДМСО, затем вводили белым беспородным мышам разного пола или мышам линии F1(CBAхC57Bl) в разных дозах различными способами однократно, но в ходе отдельного эксперимента было произведено повторное двукратное введение препарата. В течение двух недель фиксировали общее состояние животных, особенности их поведения, уровень двигательной активности, регистрировали сроки развития интоксикации и время наступления летального исхода. Морфологическое исследование тканей проводили с использованием стандартной методики приготовления гистологических препаратов [Меркулов Г.А., 1956].
Изучение фармакологических свойств препарата проводили после растворения генистеина в 60% ДМСО. При этом животным экспериментальных групп генистеин вводили внутрибрюшинно в дозе 200 мг/кг. В течение 30-ти суток после введения препарата регистрировали динамику содержания лейкоцитов, тромбоцитов и эритроцитов в периферической крови у самцов и самок белых беспородных крыс. Через 1, 3, 24 и 72 ч после введения генистеина в сыворотке крови крыс-самцов определяли показатели углеводного, белкового и липидного обменов. В эти же сроки оценивали содержание в сыворотке крови крыс -эстрадиола и цитокинов, а также динамику показателей системы глутатиона и перекисного окисления липидов в эритроцитах периферической крови животных. Кроме того, изучали влияние синтетического генистеина на двигательную активность и эмоциональный статус крыс в тесте «Открытое поле», а также проводили сравнительную оценку антиоксидантной активности отечественного генистеина с кверцетином (Sigma, США) и аскорбиновой кислотой (Sigma, США) в концентрациях от 0,78 до 100 мкг/мл на модели in vitro.
Для изучения противолучевых свойств синтетического генистеина препарат растворяли в 60% ДМСО и в дозе 200 мг/кг вводили животным за 1 сут, 1 ч до или через 1 ч после радиационного воздействия, а также курсом из 5 инъекций – один раз в день в течение 5 сут после воздействия радиации.
Моделирование общего однократного рентгеновского облучения животных осуществляли на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 (Мосрентген, СССР) при напряжении 180 кВ, силе тока 14 мА, фильтре 0,5 мм Сu + 1,0 мм Al, направлении облучения спина – грудь, кожно-фокусном расстоянии 50 см, мощности дозы 0,2 мА/кг (38,4 Р/мин). Дозиметрический контроль проводили с помощью индивидуального дозиметра «ИД-11» с последующей оценкой показаний прибора на аппарате «ГО-32».
В качестве противолучевых средств сравнения использовали мексидол (Фармсофт, Россия), цитохром С (Самсон-Мед, Россия), литан (ВАМ, Россия), -эстрадиол (Sigma, США) и цистамин (ГНИИИ военной медицины, Россия). Мексидол в дозе 25 мг/кг, цитохром С в дозе 10 мг/кг и литан в дозе 30 мг/кг мышам вводили внутрибрюшинно однократно за 1 ч до или через 1 ч после облучения, а также курсом из 5 инъекций – один раз в день в течение 5 сут после радиационного воздействия. Субстанцию -эстрадиола в дозе 40 мг/кг вводили внутримышечно за 5 сут до радиационного воздействия. Цистамин в дозе 225 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 20 мин. до облучения.
Оценку выживаемости и средней продолжительности жизни (СПЖ) погибших от облучения мышей проводили в течение 30 сут после радиационного воздействия. Радиозащитную эффективность соединений оценивали путем расчета фактора изменения дозы (ФИД).
Определение общего количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови лабораторных животных проводили пробирочным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского по Н.Г. Алексееву (1956). Методики эндо- и экзогенного колониеобразования выполняли по J.E. Till и E.A. McCulloch (1961). Оценку концентрации общего белка, холестерина, глюкозы, мочевины, креатинина, активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке крови крыс проводили на биохимическом анализаторе «BS-120» (Mindray, Китай). Содержание в сыворотке -эстрадиола оценивали методом ферментативно-усиленной хемилюминесценции на анализаторе «Immulite 2000» (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США) при участии врача Е.Е. Ершова. Определение ИЛ-1, ИЛ-2 и ИЛ-6 в сыворотке крови крыс выполняли методом твердофазного иммуноферментного анализа сиспользованием наборов «Bender Medsystems» (Австрия) на анализаторе «EVOLIS Twin Plus» (BIO RAD, США) под руководством д.м.н. профессора В.Л. Пастушенкова. Концентрацию восстановленного глутатиона (ВГ) в гемолизатах эритроцитов определяли по методике G.L. Ellman (1959). Определение активности глутатион-редуктазы (ГР) проводили методом I. Carlberg и B. Mannervik (1959), активности глутатион-S-трансферазы (ГТ) – методом W.H. Habig и W.B. Jakoby (1981), активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6ФДГ) – методом A. Kornberg и соавт. (1955). Концентрацию малонового диальдегида (МДА) определяли по методу М. Uchiyama и M. Michara (1978). Оценку антиоксидантной активности соединений проводили на модели in vitro с использованием хемилюминесцентной реакции рибофлавина в присутствии ионов двухвалентного железа и перекиси водорода под руководством д.м.н. В.М. Прокопенко и д.м.н. профессора А.В. Арутюняна. Для оценки влияния синтетического генистеина на двигательную активность и эмоциональный статус животных использовали тест «Открытое поле» [Буреш Я. и др., 1991].
Полученные в ходе экспериментальных исследований данные были подвергнуты статистической обработке с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. С целью выбора метода анализа взаимосвязи показателей (параметрические или непараметрические методы) исходные количественные характеристики были проверены на соответствие нормальному распределению с использованием тестов Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка и графических методов (гистограмм). Оценку различий средних значений данных при распределениях, близких к нормальным, проводили параметрическим методом с использованием t-критерия Стьюдента. Оценку различий данных, полученных при анализе выборок малого объема, проводили непараметрическим методом с использованием U-критерия Манна-Уитни. Вероятность p0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической значимости различий полученных данных. Среднюю величину относительных показателей и ее ошибку определяли с помощью таблиц В.С. Генеса (1967). Достоверность различий средних значений показателей выживаемости погибших животных оценивали с использованием точного метода Фишера.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Отечественный синтетический генистеин является малотоксичным соединением, обладает антиоксидантными свойствами, стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов, повышает уровень -эстрадиола в периферической крови экспериментальных животных.
-
Профилактическое применение синтетического генистеина увеличивает выживаемость лабораторных животных, подвергнутых внешнему относительно равномерному облучению. Пути реализации радиозащитного эффекта препарата связаны с повышением радиорезистентности клеток стволового пула кроветворной системы и увеличением числа клеток, сохранивших жизнеспособность после облучения, в результате снижения глубины постлучевой лейко-, нейтро- и тромбоцитопении.
Степень достоверности и апробация результатов
Результаты получены на современном сертифицированном оборудовании: микроскоп «Микмед-6» (ЛОМО, Россия), биохимический анализатор «BS-120» (Mindray, Германия), анализатор «Immulite 2000» (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., США), анализатор «EVOLIS Twin Plus» (BIO RAD, США).
Степень достоверности полученных результатов определяется достаточным количеством экспериментальных животных, использованных в исследовании, рандомизацией и формированием групп сравнения и контроля, адекватными токсикологическими, фармакологическими и радиобиологическими моделями и методами исследования, длительными сроками наблюдения и корректными методами статистической обработки.
Результаты исследования доложены и обсуждены на международной научной конференции «Охрана здоровья военнослужащих в региональных военных, климатических и эпидемиологических условиях» (Москва, 2012), научно-практической конференции «Актуальные вопросы радиационной медицины и промышленной токсикологии» (Красноярск, 2012), ХХХХV научной конференции «Хлопинские чтения» (Санкт-Петербург, 2012), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медико-санитарного обеспечения персонала объектов морской техники, работников предприятий с вредными и (или) опасными производственными факторами, а также населения территорий, обслуживаемых ФМБА России» (Санкт-Петербург, 2012), IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (Казань, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), Российской научной конференции «Острые проблемы разработки противолучевых средств: консерватизм или модернизация» (Москва, 2012), на заседании Санкт-Петербургского отделения Всероссийской общественной организации токсикологов (Санкт-Петербург, 2013), IV съезде токсикологов России с международным участием (Москва, 2013), международной научно-практической конференции по военной медицине (Санкт-Петербург, 2013).
Реализация результатов исследования
Результаты, полученные в ходе диссертационного исследования, используются в учебном процессе и научно-исследовательской работе на кафедре военной токсикологии и медицинской защиты ФГБВОУ «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ и научно-исследовательской работе ФГУП «Научно-производственный центр «Фармзащита» ФМБА России.
В процессе выполнения работы оформлено и принято к использованию 3 рационализаторских предложения.
Связь темы диссертации с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения
Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова: тема НИР № 211/5 шифр «Генистеин», тема НИР № 51/212/1 шифр «Изофлавоноид», тема НИР № 51/213/3 шифр «Комплексон-3», тема НИР № VMA.02.02.01.1315/0021 шифр «Гемопоэз-2».
Публикации
По теме диссертационного исследования опубликовано 19 научных работ, из них 8 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.
Личный вклад автора
Автор принимал личное участие в планировании, организации и выполнении экспериментов по изучению острой токсичности, фармакодинамики и радиозащитной активности синтетического генистеина. Автором лично осуществлялся учет и оценка полученных данных, статистическая обработка, обобщение и анализ полученных результатов.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 35 таблиц и 7 рисунков. Список литературы содержит 238 библиографических источников, из них 73 отечественных и 165 иностранных публикаций.
Фармакологические свойства изофлавоноида генистеина
В течение многих лет после открытия генистеин не привлекал большого внимания научного сообщества, поскольку предполагали, что его значение ограничено эффектами фитоэстрогена. Однако со временем отношение к соединению решительно менялось, и в конце XX и начале XXI века произошел взрыв интереса к генистеину, что подтверждается стремительным ростом количества публикаций за указанный выше срок. Многочисленные исследования сосредоточились на изучении механизмов фармакологической активности генистеина, его положительных и неблагоприятных эффектах на здоровье животных и человека.
Генистеин (4,5,7-тригидроксиизофлавоноид, генистерин, прунетол, софорикол) – органическое вещество растительного происхождения из класса изофлавонов. Получен в 1899 году из растения Дрок красильный или Дрок кровожадный (лат. Gensta tinctria) - вид растений рода Дрок (Genista) семейства Бобовые (Fabaceae), произрастающих в Евразии. Молекулярная формула соединения была установлена в 1926 году, а его химический синтез был впервые осуществлен в 1928 году [218]. Сегодня генистеин один из самых известных изофлавоноидов. Номер по CAS - 446-72-0.
Интерес к генистеину был связан с открытием у изофлавоноидов эстрогенной активности (фитоэстрогены). В 1931 году E. Waltz установил, что генистеин является основным фитоэстрогеном сои [219]. В 1981 году K.I. Asahi и соавторы изолировали от фильтрата культуры стрептомицетов новое вещество, которое вызывало дифференцирование клеток мышей с лейкемией и было малотоксично; впоследствии это соединение было идентифицировано как генистеин [80]. Еще больший интерес к препарату был вызван открытием в 1987 году факта, что генистеин является специфическим ингибитором тирозинкиназы белка [75], а следовательно способен регулировать механизмы внутриклеточной сигнализации, в том числе пролиферацию клетки.
Относительно высоко содержание генистеина в бобовых и особенно в сое [124]. К другим растениям, которые используются в пищу и содержат генистеин относят: ячмень, семена подсолнечника, клевер, семена тмина, арахис, фасоль, нут, горох, чечевицу, брокколи, цветную капусту, кофе и др. [77, 139].
Несмотря на то, что природный генистеин не зарегистрирован как лекарственный препарат, многие компании выпускают это соединение в качестве пищевой или биологически активной добавки для ежедневного употребления.
По своим физическим свойствам генистеин представляет собой субстанцию светло-желтого цвета [114]. Лучше всего это соединение растворяется в 80% этаноле и метаноле при нагревании, а также горячем ацетоне и пиридине. Растворяется в смеси хлороформа и метанола, образуя прозрачный раствор желтого цвета [134]. В концентрации не более 100 мМ/л хорошо растворим в диметилсульфоксиде и практически не растворим в воде [204].
Генистеин существует в формах как гликозидных конъюгатов, содержащих молекулу глюкозы, так и в виде агликонов (рисунок 1). Рисунок 1 – Структура генистеина и его гликозидов [184]
Наличие гетероциклического кольца в молекуле генистеина делает это соединение гидрофобным [85]. Конъюгация генистеина с группами глюкозы увеличивает водорастворимость генистеина.
Данные токсикокинетики в организме человека и экспериментальных животных показывают, что генистеин достаточно хорошо всасывается в системный кровоток детей и взрослых при пероральном поступлении [102]. Воздействие генистеина теоретически связано со смесью агликона и соответствующего соединению гликозида. Агликон снова конъюгируется в стенке кишечника, а оставшиеся примерно 1-2% свободного агликона поступают в портальную систему кровообращения. Генистеин всасывается и циркулирует в качестве глюкуронида и в гораздо меньшем количестве – как агликон. Образование глюкуронида происходит в кишечнике и печени, но наиболее важное значение для этого процесса имеет кишечник [94]. Генистин проходит через кишечно-печеночный цикл, и в процессе этого может быть деконъюгирован кишечными бактериями. Роль кишечных микроорганизмов в метаболизме генистеина четко установлена [198]. Генистеин может быть метаболизирован этим путем, что в конечном итоге приводит к образованию 6-гидрокси-O-деметилданголензина.
После всасывания генистеин в виде гликозида или в небольшом количестве в виде агликона распространяется по органам и системам. Максимальная концентрация генистеина определялась для свободного генистеина в течение 1-6 ч [190]. Большая часть генистеина выводится с мочой в течение 24 ч. У человека средний объем распределения для свободного генистеина составляет около 71-441 л/кг, а для общего генистеина 1-6 л/кг. Предполагают, что свободный генистеин легче проникает в ткани и может накапливаться в них [94].
У основных потребителей сои в сыворотке определяется генистеин в диапазоне 1-5 мкМ/л [85], главным образом как конъюгат с глюкуроновой кислотой и сульфатом.
Вопрос о токсичности генистеина целесообразно рассмотреть с нескольких позиций. В первую очередь это данные о длительном использовании генистеина, входящего в состав сои. Следует отметить, что потребление сои на протяжении почти пяти тысячелетий в Юго-Восточной Азии является свидетельством того, что длительное употребление генистеина не оказывает токсического действия на человека. В то же время имеются данные литературы о видовой чувствительности к генистеину среди различных животных [203]. Хотя соя и продукты из нее употребляются в больших количествах жителями Азии без очевидных отрицательных эффектов, вопрос о потенциальном токсическом действии генистеина из-за эстрогенного влияния по-прежнему открыт. Наряду с активной рекламой пользы продуктов переработки сои, все больше накапливается фактов, свидетельствующих о токсических свойствах соевых бобов на организм здорового человека. Одним из нежелательных последствий воздействия компонентов соевых белков является репродуктивная токсичность [71]. Данный эффект обусловлен содержанием в сое изофлавоноидов, нестероидных эстрогеноподобных соединений, так называемых фитоэстрогенов, обладающих биологической активностью, которые подобно женскому половому гормону эстрогену и оказывают фитоэстрогенное воздействие на млекопитающих [6, 71, 133].
Другая проблема при оценке токсичности генистеина связана с малым количеством публикаций о его эффектах при остром введении в высоких дозах. Так, не наблюдалось проявлений острой токсичности генистеина после его внутрибрюшинной инъекции мышам в дозах 100 мг/кг и даже 500 мг/кг в другом эксперименте [80]. Расчетные данные предполагают, что в этих случаях концентрация вещества сразу после инъекции в сыворотке крови равнялась приблизительно 620 и 3080 мкМ/л соответственно. В тоже время противоопухолевая эффективность препарата была выявлена для концентрации 5-40 мкМ/л [84].
R.M. McClain и соавторы сообщили о серии исследований по изучению токсичности генистеина [163]. Оценка токсичности изофлавоноида проводилась на крысах Вистар обоего пола и включала изучение острой, подострой (4 и 13 недель) и хронической (52 недели) токсичности. Часть крыс содержали на диете, свободной от генистеина, а другую на стандартной диете для грызунов. Затем крысам вводили через зонд генистеин в дозе 2 г/кг и наблюдали за животными в течение 14 суток. В результате проведенного экспериментального исследования все животные в течение 2-х недель наблюдения выжили. При макроскопии органов животных, получавших генистеин, патология не выявлялась, изменений массы паренхиматозных органов (печени и почек) не было. Однако, были выявлены некоторые различия в поведении животных разного пола. Так, у животных, которые находились на обычной диете, после введения препарата наблюдалась заторможенность движений у всех самцов и у 1 самки в первые сутки. Кроме того, к концу срока исследования (на 14-15 сутки) у животных, получавших генистеин, наблюдалась очаговая аллопеция. Авторы работы сделали заключение, что генистеин при однократном введении малотоксичен [163].
В случае, когда препарат вводили повторно в дозах до 500 мг/кг/в день в течение 4 и 13 недель, в периферической крови крыс наблюдалось снижение количества эритроцитов, появлялся ретикулоцитоз [163]. Данные биохимических исследований крови выявили небольшое увеличение активности гамма-глутамилтрансферазы у самок и самцов, изменения остальных показателей были не достоверны. При макроскопии внутренних органов значимые изменения были выявлены лишь при 52-недельном введении: у животных, получавших генистеин, наблюдалось увеличение объема матки и единичные кисты яичников. Изменения веса органов крыс-самцов включали увеличение массы почек, селезенки, надпочечник и яичек, а у самок наблюдалось увеличение массы печени, почек, селезенки, яичников и матки. Следует отметить, что после 4 и 13 недель введения генистеина гистологических изменений не выявлено. В то же время, после 26 и 52 недельного курса генистеина гистологические изменения были замечены в женских (яичники и матка) и в мужских (придатки яичка и простата) репродуктивных органах, а также в костях, почках, сердце, печени и селезенке у крыс обоего пола. Авторами сделан вывод, что наблюдаемые эффекты применения природного генистеина были связанны с проявлением препаратом эстрогенных свойств [163]. Выявленные изменения морфологии внутренних органов у животных, получавших генистеин в высокой дозе, имели функциональный характер и, следовательно, не расценивались как его побочное действие [163].
Изучение показателей выживаемости и клинической картины интоксикации животных при введении им синтетического генистеина в растворе диметилсульфоксида
В ходе определения острой токсичности синтетический генистеин вводили мышам-самцам внутрибрюшинно. Для создания как высоких, так и низких доз препарата использовали 100% ДМСО. Применение растворителя в меньших концентрациях накладывало определенные ограничения, связанные с образованием взвеси белого цвета, введение которой животным не представлялось возможным. Растворы генистеина вводили в максимальном объеме 0,1 мл на 20 г массы тела животного с учетом острой токсичности ДМСО. Токсичность растворителя была определена на основе результатов собственных исследований и подтверждена данными литературы [42]. Растворы генистеина готовили непосредственно перед их введением мышам. Животным контрольной группы тем же способом и в том же объеме вводили растворитель 100% ДМСО. Дополнительно была сформирована группа из интактных животных (биологический контроль). В каждой группе было не менее 8 мышей. При оценке общего состояния животного обращали внимание на его поведение (беспокойство, возбуждение судороги, боковое положение). Отмечали наличие адинамии или двигательного возбуждения, пугливость, беспокойство животных. Оценивали состояние кожи и шерсти (грязная, взъерошенная, тусклая и т.д.). Обращали внимание на состояние слизистых оболочек носа, гиперемию, наличие корок, изъязвления. Проводили наблюдение за характером дыхания экспериментальных животных. Отмечали потребление корма и воды, наличие жажды, характер испражнений. Регистрировали сроки гибели животных.
На основании данных по выживаемости мышей расчетным методом по Личфилду и Уилкоксону [67] определяли показатели летальных доз LD50, LD16 и LD84.
Погибших животных сразу вскрывали и регистрировали видимые изменения внутренних органов. Через две недели наблюдения все выжившие животные были подвергнуты эвтаназии с помощью медицинского эфира и подвергнуты вскрытию. Было проведено макроскопическое описание внутренних органов. Кроме того, у белых беспородных мышей самцов после введения генистеина различными путями в различных дозах проводили гистологическое исследование тканей. После вскрытия головной мозг и внутренние органы (сердце, легкие, печень, почки, желудок, поджелудочную железу и кишечник) мышей извлекали и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике приготовления гистологических препаратов [52]. Производили ленточные срезы головного мозга и внутренних органов. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Изготовленные препараты изучали в светооптическом микроскопе Leica (Германия) при 100-, 200- и 400-кратном увеличении.
Общее однократное рентгеновское облучение животных осуществляли на рентгенотерапевтической установке РУМ-17 при напряжении 180 кВ, силе тока 14 мА, фильтре 0,5 мм Сu + 1,0 мм Al, направлении облучения спина – грудь, кожно-фокусном расстоянии 50 см, мощности дозы 0,2 мА/кг (38,4 Р/мин). Для облучения крысы помещались по 4, а мыши по 10 особей в пластиковые пеналы. Пеналы укреплялись на подставке (кимографе), вращающейся со скоростью 2 оборота в мин. Доза облучения составляла для мышей – 6,5; 7; 8 или 9 Гр, а для крыс – 6 Гр. Что соответствовало дозам, при которых в течение 30-ти сут погибало 70-90% облученных мышей и крыс.
Животные опытных и контрольных групп облучались совместно, в первую половину дня, после чего содержались в тех же условиях, что и необлученный контроль. Ложнооблученные животные помещались в пеналах под аппарат РУМ-17 с выключенной анодной трубкой на то же время, что и облученные.
Дозиметрический контроль проводили с помощью индивидуального дозиметра «ИД-11» с последующей оценкой показаний прибора на аппарате «ГО-32». 2.4.2 Оценка выживаемости и средней продолжительности жизни облученных животных
Оценку выживаемости и средней продолжительности жизни погибших от облучения мышей проводили в течение 30 сут после радиационного воздействия. Для этого ежедневно регистрировали число погибших животных. По истечению срока наблюдения рассчитывали процент павших и выживших животных в каждой группе.
Изучение основных показателей острой токсичности генистеина, растворенного в диметилсульфоксиде
Для исключения токсического синтетического генистеина на организм, было проведено исследование по определению острой токсичности изучаемого изофлавоноида, растворенного в другом растворителе, а именно в 100% ДМСО.
Объем введения растворителя был основан на показателях его острой токсичности, определенных в предварительном эксперименте на мышах (табл. 3).
В ходе проведенных расчетов была вычислена среднелетальная доза LD50, значение которой для растворителя ДМСО в концентрации 100% составило 16,04±4,86 г/кг, что полностью согласуется с ранее полученными данными [42].
Учитывая значения плотности ДМСО и массы экспериментальных животных, а также максимальную растворимость препарата в 100% ДМСО, которая была не более чем 4,8 мМ/л, конечный объем растворов синтетического генистеина для введения составил 0,05 мл/10 г массы животного. Растворы синтетического генистеина готовили непосредственно перед внутрибрюшинным введением белым беспородным мышам в разных концентрациях, не превышающих 6 г/кг (2 г/кг, 4 г/кг, 6 г/кг). Животным контрольной группы тем же способом и в том же объеме вводили растворитель. В каждой группе было не менее 8 мышей.
При введении мышам синтетического генистеина, растворенного в 100% ДМСО, при всех изученных дозах препарата заметных изменений в их поведении по сравнению с интактными животными обнаружено не было. Шерсть мышей имела опрятный вид, была блестящей, без очагов облысения. Кожа обычной окраски, без признаков раздражения. Окраска и состояние слизистых оболочек не отличались от интактных животных.
Результаты оценки массы тела животных после введения генистеина в растворе ДМСО представлены в таблице 4.
По данным, представленным в таблице 4, видно, что значимых отличий показателей массы тела у животных после внутрибрюшинного введения им препарата по сравнению с группой ДМСО обнаружено не было.
Проведенное на 14 сут наблюдения макроскопическое исследование не выявило различий по сравнению с интактными животными у выживших мышей после введения им синтетического генистеина в дозе 6000 мг/кг, растворенного в ДМСО. Так, оболочки головного мозга были тонкими, прозрачными. Вещество мозга имело умеренную плотность, расширения желудочков не наблюдалось. Слизистые оболочки ротовой полости, глотки и гортани без изменений; очагов раздражения, воспаления или некроза не наблюдалось. При осмотре грудной и брюшной полостей нарушений в расположении внутренних органов не отмечалось. Величина и форма сердца изменений не представляли. Мышца сердца была коричневатой, плотной. Поверхность лёгких имела бледно-розоватую окраску, лёгкие спались при вскрытии грудной клетки. Ткань на разрезе также имела однородную бледно-розовую окраску. Слизистая оболочка внелегочных бронхов была гладкой, блестящей, бледно-розовой. Желудок имел обычную форму и размеры, просвет был заполнен плотным пищевым содержимым. Слизистая оболочка тела желудка была бледно-розовая, блестящая, складчатая. Слизистая оболочка тонкой и толстой кишки была блестящей, гладкой. Величина и форма печени изменений не представляли. Капсула печени была тонкой, прозрачной. Ткань печени имела коричневый цвет и умеренно плотную консистенцию. Величина и форма почек не отличалась от контроля, капсула легко снималась. Поверхность почек была гладкой, однородной коричнево-красной окраски. На разрезе отчётливо различались корковое и мозговое вещество. Селезёнка имела темно-вишнёвый цвет, гладкую поверхность и плотноватую консистенцию.
Результаты проведенного исследования по оценке острой токсичности генистеина, растворенного в 100% ДМСО, при внутрибрюшинном пути введения препарата приведены в таблице 5.
На основании данных по выживаемости расчетным методом [8] были определены значения летальных доз LD16, LD50 и LD84 для синтетического генистеина, растворенного в 100% ДМСО. Результаты исследования представлены в таблице 6.
Установлено, что при введении синтетического генистеина, растворенного в 100% ДМСО, расчетное значение LD50 соответствовало дозе 8292 мг/кг. Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что изученный синтетический отечественный генистеин в соответствии с [21] относится к классу малотоксичных веществ.
Таким образом, в результате проведенного исследования по оценке острой токсичности синтетического генистеина при внутрибрюшинном введения препарата было установлено, что введение изучаемого изофлавоноида в растворе ДМСО белым беспородным мышам-самцам не изменяет поведения и массы тела животных. Кроме того, не было обнаружено и морфологических изменений внутренних органов у мышей после введения им синтетического генистеина в дозе 6000 мг/кг, растворенного в ДМСО.
Таким образом, при изучении острой токсичности синтетического генистеина была установлена малая растворимость препарата в различных жидкостях (в воде, масле и ТВИН-80), что потребовало проведения дополнительных исследований.
Показано, что генистеин, растворенный в ПЭГ-400, относится к умеренно токсичным соединениям, при этом были выявлены негативные последствия от введения препарата животным, связанные с изменением их поведения и выраженной патологией внутренних органов. Кроме того, не было обнаружено отличий по изученным показателям между мышами, получавшими генистеин, растворенный в ПЭГ-400, или сам растворитель. Результаты исследования токсичности синтетического генистеина, растворенного в ПЭГ-400, по всей вероятности, отражают токсичность самого растворителя, а не растворенного в нем препарата.
В тоже время, в рамках проведенного нами исследования, расчетным методом была определена численная характеристика токсичности препарата, растворенного в 100% ДМСО, на основании которой отечественный синтетический генистеин можно рассматривать как малотоксичное соединение. При этом, изменений поведения, массы тела и морфологии внутренних органов у мышей на фоне введения им синтетического генистеина, растворенного в 100% ДМСО, обнаружено не было.
Имеющиеся в литературе данные о фармакологических эффектах природного генистеина с учетом полученных данных о малой токсичности синтетического генистеина свидетельствуют о целесообразности продолжения изучения этого изофлавоноида в рамках доклинических исследований по оценке его радиозащитных свойств. В качестве растворителя для синтетического генистеина при проведении исследований, по-видимому, лучше использовать ДМСО. Во-первых, в отличие от ПЭГ-400, ДМСО в проведенных исследованиях не оказывал токсического действия на организм животных. Во-вторых, генистеин хорошо растворялся в ДМСО, при этом образовывался полупрозрачный раствор, пригодный для внутрибрюшинного введения.
Сравнительная оценка радиозащитной эффективности генистеина, мексидола, литана и цитохрома С по показателям выживаемости и средней продолжительности жизни облученных мышей
Для сравнительной оценки радиозащитной эффективности синтетического генистеина были выбраны мексидол, литан и цитохром С, обладающие, по данным литературы [2, 35], антиоксидантными свойствами. Антиоксидантная активность выявлена и для синтетического генистеина в представленных ранее исследованиях in vitro и in vivo (см. главу 4).
В ходе проведенных исследований генистеин растворяли в 60% ДМСО, а остальные препараты – в дистиллированной воде. Все изученные препараты вводили однократно внутрибрюшинно за 1 ч до облучения, через 1 ч после облучения или курсом из 5 инъекций – один раз в день в течение 5 сут после воздействия радиации в объеме 0,1 мл/10 г веса животного. Радиозащитную эффективность оценивали при введении генистеина в дозе 200 мг/кг, мексидола в дозе 25 мг/кг, литана в дозе 30 мг/кг, цитохрома С в дозе 10 мг/кг. Выбор доз изучаемых препаратов был обоснован данными литературы [30, 51, 55].
В таблицах 20-22 представлены данные, отражающие сравнительную оценку радиозащитной эффективности синтетического генистеина, мексидола, цитохрома С и литана в схемах профилактики и терапии радиационных поражений.
Установлено, что изучаемые соединения в различной степени защищали облученных в дозах СД50-90/30 мышей от лучевой гибели, а выраженность их радиозащитного эффекта зависела от схемы введения препаратов.
Как видно из данных, представленных в таблице 20, при профилактическом применении за 1 ч до облучения наиболее выраженным радиозащитным действием обладал генистеин. Его введение в дозе 200 мг/кг позволяло увеличить выживаемость облученных в дозе 7 Гр мышей на 40%, в дозе 8 Гр - на 46% (p0,05), в дозе 9 Гр - на 58% (p0,05). Расчетное значение ФИД для генистеина при введении за 1 ч до облучения составило 1,28±0,09. При облучении в дозе 9 Гр генистеин почти на 2 сут (p0,05) увеличивал среднюю продолжительность жизни погибших от облучения животных.
Применение мексидола, литана или цитохрома C за 1 ч до облучения в дозах СД50-90/30 способствовало незначительному повышению выживаемости мышей и не оказывало существенного влияния на среднюю продолжительность жизни погибших от облучения животных (табл. 20). При данной схеме введения изучаемых препаратов расчетное значение ФИД составило: для мексидола 1,17±0,13, для литана - 1,12±0,10, а для цитохрома C - 1,07±0,07.
На следующем этапе оценивали эффективность изучаемых антиоксидантов при их использовании в качестве средств ранней (экстренной) терапии радиационных поражений. Установлено, что при однократном введении через 1 ч после облучения все изучаемые препараты способствовали повышению выживаемости облученных в дозах СД50-90/30 животных в среднем на 15-25%, однако статистически значимых отличий от контроля не выявлено (табл. 21). Рассчитанная по показателям выживаемости величина ФИД при однократном раннем терапевтическом использовании генистеина составила 1,17±0,12, мексидола - 1,20±0,13, литана - 1,10±0,09, цитохрома C - 1,13±0,10. При этом изучаемые антиоксиданты практически не влияли на среднюю продолжительность жизни погибших от облучения мышей и только генистеин при облучении в дозе 9 Гр значимо повышал СПЖ почти на 3 сут (табл. 21).
Выявлено, что в условиях курсового введения в течение 5 сут после острого облучения в дозах СД5о-9о/зо наиболее выраженная противолучевая активность была у мексидола. Использование этого препарата сопровождалось повышением выживаемости облученных в дозе 7 Гр животных на 40% (p0,05), в дозе 8 Гр - на 28%, а в дозе 9 Гр - на 33% (p0,05). Кроме того, курсовое применение мексидола позволило почти в 2 раза (p0,05) увеличить среднюю продолжительность жизни облученных в дозе 9 Гр мышей. Расчетное значение ФИД мексидола при данной схеме его использования для лечения острой лучевой болезни составило 1,30±0,14.
Курсовое введение генистеина, литана и цитохрома C в течение 5 сут после радиационного воздействия также позволило предотвратить гибель части мышей, подвергнутых острому воздействию рентгеновского излучения. Величина ФИД этих препаратов при терапевтическом применении составила: для генистеина – 1,08±0,07, для литана – 1,18±0,11, для цитохрома C – 1,19±0,12. При этом литан более чем на 3 суток (p0,05) увеличивал среднюю продолжительность жизни животных, погибших после облучения в дозе 9 Гр.
Таким образом, в условиях острого воздействия рентгеновского излучения в дозах СД50-90/30 при однократном профилактическом ведении за 1 ч до радиационного воздействия наибольшую радиозащитную эффективность продемонстрировал синтетический генистеин. Мексидол оказался наиболее эффективен в схеме курсового приема.
