Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Обзор литературы 12
1.1. р53-зависимая системазащиты генома и ее нарушение при развитии отдаленных последствий действия радиации .12
1.1.1. Контроль функциональной активности белка р53 на различных уровнях .12
1.1.2. Механизмы снижения эффективности функционирования белка р53 .15
1.1.3. Функциональная активность системы Р53-MDM2-MDM4 после облучения ...17
1.2. Роль микроРНК в функционировании р53-системы защиты генома в отдаленный период после облучения 20
1.2.1. МикроРНК, их биогенез и функции, а также причины нарушения экспрессии микроРНК, значение в диагностике и терапии заболеваний .20
1.2.2. МикроРНК и р53 .27
1.2.3.МикроРНК, модулирующие активнсть р53 после воздействия ионизирующей радиации 42
1.3. Эксперименты по изучению экспрессии микроРНК, модулирующих активность р53-системы защиты генома, в отдаленные сроки после облучения 50
ГЛАВА 2 Материалы и методы .59
2.1. Объект исследования .59
2.1.1. Животные 59
2.1.2. Пациенты, пренесшие ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП .60
2.1.3. Онкологические больные, перенесшие курс ЛТ .61
2.2. Методы исследования .61
2.2.1. Получение гомогената клеток костного мозга крыс .61
2.2.2. Получение гомогената ткани молочной железы крыс .61
2.2.3. Выделение общей РНК, содержащей фракцию зрелых микроРНК из гомогената костного мозга и молочной железы, а также цельной крови .63
2.2.4. Определение концентрации РНК 63
2.2.5. Обратная транскрипция для мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 крыс и
человека 63
2.2.6. Обратная транскрипция для зрелых miR-21, miR-34, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7 крыс и человека со шпилькообразными праймерами «stem-loop» .64
2.2.7. Основные этапы подбора праймеров для целевых генов Р53, MDM2, MDM4, mir-34, mir-125b, mir-145, mir-16, mir-21, let-7 и конститутивных генов GAPDH, -actin крыс и человека для постановки ПЦР в реальном времени .66
2.2.8. ПЦР в реальном времени .69
2.2.9. Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в реальном времени 74
2.2.10. Статистическая обработка результатов .75
ГЛАВА 3 Результаты исследования .76
3.1. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую систему защиты генома, в опухолях молочных желез и костном мозге аутбредных крыс-самок после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр 76
3.1.1. Динамика возникновения опухолей молочной железы у аутбредных крыс-самок в условиях проведенного эксперимента 76
3.1.2. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате опухолей молочных желез аутбредных крыс-самок на 315 и 550 сутки после -облучения в дозе 2,5 Гр .77
3.1.3. Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессия зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс самок на 75, 315 и 550 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр 80
3.1.4. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4, miR-34с, miR-145, miR-16-2, miR-125b, let-7a, miR-21 в гомогенате опухолей молочных желез и костного мозга аутбредных крыс-самок на 75, 315 и 550 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр 88
3.2. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53-зависимую системузащиты генома, в отдаленный период у лиц, перенесших ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП .91
3.2.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c,
miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови лиц в отдаленный период после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП с помощью метода ПЦР в реальном времени со специально подобранными праймерами и условиями амплификации 91
3.2.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4,
miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови пациентов в отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП 93
3.3. Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую системусохранения стабильности генома, в крови онкологических больных до и после курса дистанционной -терапии 95
3.3.1. Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7i в периферической крови онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ, РГШ до и после полного курса ЛТ с помощью метода ПЦР в реальном времени с теми же праймерами и условиями амплификации, которые были экспериментально подобраны при исследовании крови пациентов с диагнозом ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП .95
3.3.2. Анализ соотношениия содержания мРНК гена Р53 и мРНК генов MDM2, MDM4, miR-34с, miR-145, miR-16, miR-125b, let-7a, miR-21 в периферической крови онкобольных с диагнозом РПЖ, РМЖ и РГШ до и после полного курса дистанционной -терапии 99
ГЛАВА 4 обсуждение результатов исследования 101
Заключение 125
Выводы 127
Список литературы
- Функциональная активность системы Р53-MDM2-MDM4 после облучения
- Получение гомогената клеток костного мозга крыс
- Динамика возникновения опухолей молочной железы у аутбредных крыс-самок в условиях проведенного эксперимента
- Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую системусохранения стабильности генома, в крови онкологических больных до и после курса дистанционной -терапии
Введение к работе
Актуальность темы. Техногенные катастрофы, использование ионизирующей радиации в медицине для лечения онкологических заболеваний, радиологические диагностические процедуры (рентген, компьютерная томография, радионуклидные исследования) связаны с возможностью формирования опасных для здоровья последствий радиационных поражений, в первую очередь, злокачественных новообразований. Для усиления эффективности лучевой терапии (ЛТ) и снижения риска развития отдаленных последствий облучения интенсивно проводятся молекулярно-генетические исследования механизмов онкотрансформации, включая радиационный канцерогенез [Christophorou M. et al. 2006, Zhu Y. et.al. 2010, Gudkov A.V. 2010, Mazdarani H. 2012, Lee C. et al. 2013, Wang Ya. et.al. 2014, Михайлов В.Ф. и др. 2015].
Установлено, что в первые сутки после радиационного воздействия наблюдаются значительные изменения профиля экспрессии сотен генов, вовлеченных в работу важнейших внутриклеточных регуляторных путей [Saini D. 2012, Brachova P. 2014]. Временная динамика пострадиационного изменения экспрессии генов, захватывающая отдаленные сроки после лучевого воздействия, на млекопитающих мало изучена. При всем разнообразии нарушений экспрессии генов, наблюдаемых при различных формах злокачественных новообразований, общим для них является изменение функционирования р53- зависимой системы защиты генома. Эффективность работы системы защиты генома определяется активностью онкосупрессора - белка р53, воздействующего на гены - мишени. Усиление активности белка р53, вызванное стресс-воздействием, является кратковременным. Содержание самого белка в клетке зависит от времени жизни его молекулы, скорости транскрипции, трансляции и деградации мРНК, а активность -от белок-белковых взаимодействий [Bai L. et al. 2006]. Основными белковыми регуляторами содержания р53 в клетке является Е3 лигаза mdm2 и ее структурный гомолог mdm4. mdm2 убиквинтилирует р53 и способствует его быстрой протеосомной деградации. mdm4 блокирует взаимодействие р53 с генами-мишенями и увеличивает время жизни белков mdm2 и р53, причем р53 является транскрипционным фактором для гена MDM2. Быстрая деградация белков и мРНК указанных генов увеличивает значимость определения содержания мРНК в клетках после облучения. На сегодняшний день активно исследуются микроРНК, которые связываются с мРНК генов-мишеней и останавливают трансляцию. Поэтому экспрессия мРНК не дает полной информации, так как при е высоком уровне синтез продукта может быть снижен при вмешательстве специфических для данного гена микроРНК. Например, сверхэкспрессия miR-125b подавляет эндогенный уровень белка р53 и уменьшает апоптоз [Le M.T. 2011]. С другой стороны, сами микроРНК могут быть мишенями транскрипционных факторов [Chaudry M., Omaruddin R. 2012, Erson-Bensan A. 2014]. Так, в промотерных регионах
генов mir-34a,b,c, mir-145, mir-16-2, let-7a,-b найдены р53-респонсивные элементы. miR-21 оказывает пролиферативный эффект на клетки и напрямую не связана с р53, но ингибирует активность р53 -системы защиты генома. Таким образом, эффективность функционирования p53-системы после стресс-воздействий в клетке определяется балансом активации транскрипционного фактора р53, а также экспрессией специфических микроРНК, модулирующих трансляцию мРНК генов этой системы. Изменение этого баланса в отдаленные сроки после лучевого поражения может повысить опасность развития канцерогенеза.
Поэтому целью нашего исследования было изучение экспрессии микроРНК, модулирующих функциональную активность р53-зависимой системы защиты генома, при формировании отдаленных последствий радиационного воздействия у экспериментальных животных и человека. Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать содержание мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессию зрелых микроРНК miR-34c, miR-16-2, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7i, влияющих на функциональную активность р53, в клетках костного мозга аутбредных крыс-самок в отдаленные сроки (75, 315 и 550 сутки) после однократного кратковременного тотального -облучения в дозе 2,5 Гр.
-
Оценить содержание мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессию зрелых мик-роРНК miR-34c, miR-16-2, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7i, влияющих на функциональную активность р53, в образовавшихся опухолях молочной железы у ин-тактных и облученных в дозе 2,5 Гр аутбредных крыс-самок.
-
Выявить уровень содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессии зрелых микроРНК miR-34a, miR-16, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7a в крови у пациентов в отдаленные сроки (2-51 год) после перенесения острой лучевой болезни (ОЛБ) и местных лучевых поражений (МЛП).
-
Изучить уровень мРНК генов Р53, MDM2, MDM4, а также содержание зрелых мик-роРНК miR-34a, miR-16, miR-125b, miR-145, miR-21, let-7a в периферической крови онкологических больных с диагнозом рак предстательной железы (РПЖ), рак молочной железы (РМЖ) и рак головы и шеи (РГШ) до и после курса дистанционной -терапии.
Положения, выносимые на защиту
1) В отдаленные сроки после радиационного воздействия в костном мозге и молочных железах экспериментальных животных и в периферической крови человека происходят изменения содержания зрелых микроРНК, модулирующих функциональную активность р53-зависимой системы защиты генома.
2) Изменения экспрессии зрелых микроРНК, модулирующих активность р53, оказывают влияние на патофизиологическое состояние организма в отдаленный период после облучения.
Научная новизна
Впервые изучены закономерности временной динамики изменения транскрипционной активности генов P53, MDM2, MDM4, а также содержания зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в костном мозге аутбредных крыс-самок в длительный период (550 суток), сопоставимый со временем их жизни, после острого - облучения в дозе 2,5 Гр.
Обнаружено изменение функционирования р53-зависимой системы защиты генома в отдаленные сроки после облучения в период, предшествующий возникновению опухолей.
Показаны изменения транскрипционной активности гена MDM4, а также содержания зрелых miR-21, miR-34c, miR-145, в периферической крови пациентов в отдаленные сроки после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП и МЛП.
Исследована корреляция между содержанием зрелых miR-21, miR-34, miR-125b, miR-145, miR-16, let-7 и мРНК P53 гена в костном мозге и молочных железах крыс, а также в периферической крови человека в отдаленные сроки после действия радиации.
Практическая значимость результатов
Изучение изменений содержания микроРНК и мРНК генов р53-зависимой системы защиты генома в клетках крови после радиационного воздействия может представлять практический интерес для формирования групп риска развития отдаленных лучевых эффектов у лиц после профессионального облучения, вследствие катастроф и аварий. Экспрессия зрелых микроРНК имеет прогностическую значимость для индивидуальной оценки эффективности лечения опухолей и может быть полезна при отборе средств, способных снижать острые или поздние радиационные осложнения.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы доложены на VI Cъезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2010 г.), научной конференции «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011 г.), Международной конференции «Медико-биологические проблемы действия радиации» (Москва, 2012 г.), V Международной школе молодых ученых по молекулярной генетике «Непостоянство генома» (Звенигород, 2012 г.), Международной конференции «Genome Instability, Evolution and Human Diseases» (Санкт-Петербург, 2013 г.), Международной научной конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии опухолей» (Москва, 2013 г.), VII Съезде по радиационном исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2014 г.). Диссертация апро-
бирована на заседании секции 1 Ученого совета ФГБУ ГНЦ «ФМБЦ им А.И.Бурназяна» (протокол №3 от 29.05.2014 г).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 7 статей в российских изданиях, рекомендованных ВАК, а также 10 тезисов докладов в материалах отечественных и международных конференций.
Структура диссертации
Функциональная активность системы Р53-MDM2-MDM4 после облучения
Локализация и биогенез микроРНК Гены микроРНК находятся либо в межгенных регионах, либо в интронах кодирующих белки генов. Результаты исследований показали, что транскрипция многих микроРНК регулируются по принципу белок-кодирующих генов. Биогенез микроРНК включает в себя несколько этапов. Транскрипция генов микроРНК может идти с «чужих» или собственных промоторов в зависимости от локализации микроРНК в геноме и специфики самого гена. Гены микроРНК могут транскрибироваться в ядре поодиночке, или одним полицистронным транскриптом с помощью РНК-полимераз. Образованные первичные транскрипты, которые называются при-микроРНК (pri-microRNA), имеют длину от 70 до 200 нуклеотидов и более, с характерными множественными шпильками с неполной внутренней комплементарностью. Молекулы при-микроРНК подвергается кэпированию, полиаденилированию и редактированию. Зрелая микроРНК может быть локализована как на 3/ , так и на 5/-концах шпилечной структуры. Следующий этап биогенеза микроРНК - это превращение при-микроРНК в пре-микроРНК (pre-microRNA), осуществляемое микропроцессорным комплексом ядерной РНКазой III Drosha/ DGCR8 (область 8, критическая для синдрома Ди-Джорджи), в котором DGCR8 распознает особенности структуры двухцепочечной РНК и связывается с ней, а Drosha осуществляет разрезание нити при-микроРНК. Отрезанные фланкирующие элементы деградируют в ядре. Образующаяся пре-микроРНК имеет стеблепетлевую 70-нуклеотидную структуру и «липкий» 3/-конец размером две нулеотидные пары. Этот конец необходим для взаимодействия с белком экспортином 5 Ran-GTP-зависимым (Exportin 5–Run-GTP), участвующим в переносе пре-микроРНК из ядра в цитоплазму [Bohnsack М.Т. et al. 2004]. Далее пре-микроРНК превращается в двухцепочечную микроРНК, длиною в 20-25 нуклеотидов с помощью фермента РНКазы III, названного Dicer, который вместе с его dsRBD-партнером TRBP осуществляют двухцепочечный разрез. На последнем этапе биогенеза одна цепь двухцепочечной микроРНК связывается с белком Argonaute (Ago), который вовлекает одноцепочечную микроРНК в работу РНК-индуцируемого комплекса выключения гена RISC (RNA-Induced Silencing Complex).
После включения miR в состав RISC запускается механизм сайленсинга. Мишенями для микроРНК, расположенных в составе RISC, являются MRE (microRNA Response Elements), находящиеся на мРНК в области 3/UTR-региона. miR, не связанные с мишенью, удаляются из клетки. Комплекс RISC может блокировать инициацию трансляции, за счет удержания RISC на MRE, препятствуя узнаванию кэпа фактором инициации трансляции и сборке рибосом. Комплекс RISC также может ингибировать элонгацию, индуцировать быстрое отделение рибосомы или облегчать протеолиз образующегося пептида [Fabian M.R. et al. 2010].
Функциональное взаимодействие miR с мишенью miRNA-RISC-комплекс связывается с 3 UTR-регионом мРНК за счет нуклеотидной комплементарности. Механизм работы RISC зависит от степени комплементарности его взаимодействия с мРНК, т.е. при полной комплементарности MRE с микроРНК происходит деградация мишени (85-90% случаев), а при неполном комплементарном взаимодействии происходит трансляционная репрессия мишени без влияния на стабильность мРНК. Благодаря связи с белками Argonaute (Ago) микроРНК высокостабильны, время их полужизни сильно варьируют (от нескольких часов до нескольких дней). Однако, при отсутствии мишеней в клетке возможно быстрое снижение содержания микроРНК из-за их деградации с помощью специфических нуклеаз. Кроме репрессивного действия микроРНК на мишени, возможно и активирующее влияние микроРНК в случае расположения центров связывания микроРНК в области 5/UTR-региона мРНК-мишени. Хотя связывание может осуществляться и в 5 UTR-регионе и в открытой рамке считывания, тем не менее, такой вид взаимодействия встречается относительно редко [Bartel D.P. 2009]. Присутствие в miR последовательности из 6 - 8 нуклеотидов, именуемых «seed» («семя»), комплементарной к MRE мишени приводит к специфическому связыванию с мРНК.
Как правило, одна miR может иметь много мишеней. Бионформационный анализ последовательности мРНК предоставляет достаточно сведений для отбора соответствующих miRs к интересуемой мишени, однако необходима экспериментальная проверка реальности таких взаимодействий, приводящих к биологическому эффекту для разных типов клеток/тканей или стадией заболевания [Landgraf P. et al. 2007]. Учитывая огромное количество прогнозируемых мишеней для любой miR, очевидно, что только часть прогнозируемых мишеней является существенно значимой [Selbach M. et al. 2008].
Исследования показали, что большинство miR, потенциально взаимодействующих с транскриптами, не имеют, либо имеют слабый функциональный выход [Lal A. et al. 2011]. Поэтому необходимо использовать комбинированные подходы анализа биологических сетей для полного разделения miR-функциональных мишеней, снижая их количество и выделяя наиболее важные miR-мишени. МикроРНК в диагностике заболеваний Анализ 217 miRs млекопитающих в нескольких сотнях образцов, включающий клинические образцы, раковые линии клеток и мышиные опухоли, показал, что профиль экспрессии miR может отличаться в опухолях разного происхождения, и что экспрессия miRs в большинстве своем в опухолях ингибируется. Интересно, что слабо дифференцированные опухоли показывают низкий уровень экспрессии miR по сравнению с опухолями высокой степени дифференцировки [Lu J. et al. 2005]. Анализ отдельных видов рака демонстрирует, что профиль экспрессии miR может предсказывать клиническое развитие опухоли. miR-15a и miR-16-1 могут быть прогностическими биомаркерами хронической лимфоидной лейкемии, а let-7a - рака легких [Calin G.A. et al. 2005]. Профиль экспрессии miR полезен и может быть использован для характеристики различных форм заболеваний сердца, мышечных нарушений, нейродегенеративных нарушений. Циркулиующие микроРНК Подавляющее большинство сообщений о профиле экспрессии miR вытекают из анализов солидных опухолей, тем не менее miRs могут быть обнаружены в человеческой плазме, сыворотке или в цельной крови [Schwarzenbach H. еt al. 2011]. Циркулирующая в сыворотке miR-21 может быть биомаркером у пациентов с большой диффузной В-клеточной лимфомой [Lawrie C.H. et al. 2008]. Больные РПЖ могут отличаться от здоровых доноров по уровню экспрессии miR-143 [Volinia S. et al. 2006]. Такие же выводы сделаны при исследованиях miRs при РМЖ (с использованием цельной крови) [Heneghan H.M. et al. 2010], колоректальном раке (с использованием плазмы) [Huang Z. et al. 2010] и при плоскоклеточном раке легких (с использованием мокроты) [Xing L. et al. 2010]. Циркулирующие в биологических жидкостях miRNAs могут также быть использованы для прогностических целей [Boeri M. еt al. 2011]. Keller et al. анализировали 863 miRNAs в 454 образцах крови у пациентов, страдающих 14 различными заболеваниями, включая рак легкого, РПЖ, рак протоков поджелудочной железы, меланому, рак яичников, рак желудка, рак поджелудочной железы, рассеянный склероз, хроническое обструктивное заболевание легких, периодонтит, панкреатит и инфаркт миокарда. В среднем, содержание более чем 100 miRs было изменено в крови при каждом заболевании. Применение математических алгоритмов и построение вероятностных графиков показало информационную значимость полученных данных для выявления заболевания более чем у 2/3 больных, участвующих в этом исследовании [Keller A.et al. 2011].
Источниками miR в периферической крови являются различные ткани организма. Установлено, что секреция miRs из В-клеток осуществляется в экзосомах, обеспечивающих защиту miRNA от РНК-аз [Pegtel D.M. et al. 2010]. Опухолевые клетки, эпиталиальные клетки, стволовые и мезенхимальные клетки также способны выделять экзосомы с микроРНК. Перемещение miRs из эмбриональных стволовых клеток к фибробластам осуществляется в клеточных микровизикулах [Yuan A. et al. 2009].
Получение гомогената клеток костного мозга крыс
В экспериментах in vitro и in vivo показано, что пострадиационная активация р53 приводит к увеличению содержания зрелых miR-34 [Girardi C. 2012, Kato M. 2009]. Установлено, что увеличение содержания miR-34 наблюдается и через 4 часа после воздействия низких доз радиации, причем в опухолевых клетках оно менее выражено [Stankevicins. L.2013].
Транскрипция микроРНК семейства let- 7 после облучения в зависимости от типа клеток может репрессироваться, либо активироваться [Saleh A.D. 2011]. Кроме того, р53 после радиационного воздействия способен активировать посттранскрипционный биогенез таких микроРНК, как miR-16, miR-143, miR-145 [Zhang J. 2013]. Связываясь с р68/р72, онкосупрессор р53 взаимодействует с комплексом Drosha/DGCR8, регулируя его активность и ускоряя созревание miR-16, miR-145, miR-21.
Показано, что через 8 часов после -облучения наблюдается снижение экспрессии miR-125 [Le M.T. 2009]. Поскольку хорошо известно, что miR-125 может являться ингибитором р53 и некоторых других генов р53-сети, снижение miR-125 является одним из факторов, способствующим радиационно-индуцированной экспрессии р53 и ряду других генов р53-завиисимых путей. Увеличение экспрессии miR-504 приводит к тому, что после облучения разных типов клеток с геном p53+/+ , наблюдается снижение содержания белка р53 и его действия как транскрипционного фактора на экспрессию mdm2 и р21 ослабевает [Hu W. 2010]. Увеличение miR-25 и miR-30 приводили к ингибированию р53-зависимой остановке клеточного цикла [Kumar M. 2011].
В клетках, имеющих мутации в гене P53, влияние облучения на экспрессию микроРНК меняется [Brachova P. 2014]. «Онкоморфный» ген P53 с мутациями, препятствующими остановке клеточного цикла и апоптозу, теряет способность через 0.5, 1 , 4 , 8 ч и 24 ч после облучения в дозе 8 Гр активировать, как транскрипционный фактор, экспрессию микроРНК, которые модулируют эти процессы, например, miR-34. Установлено, что в таких клетках не наблюдается пострадиационной р53 -зависимой активации комплекса Drosha, обеспечивающего созревание mir-16 и mir-145 [Kawai S. 2012].
Таким образом, ответ р53- зависимой системысохранения стабильности генома на радиационное воздействие определяется многими факторами, такими как мощность и доза облучения, фенотип клетки и, конечно, уровенем экспрессии микроРНК, имеющих отношение к сохранению клеточного гомеостаза и пролиферации. Лучевая терапия и экспрессия miR в опухолях Лучевая терапия (ЛТ) представляет собой основную форму лечения опухолей. Устойчивость новообразований к действию радиации определяется состоянием генома, эпигенетической регуляцией в раковых клетках, микросредой, состоянием кровотока и является существенной клинической проблемой. Исследования последних лет показали, что микроРНК могут изменять радиочувствительность опухолей, влияя на репарацию повреждений ДНК, механизмы остановки клеточного цикла, процессы апоптотической гибели клеток [Zhao L. 2012]. МикроРНК модулируют эти программы, и их функционирование в трансформированных клетках отличается от функционирования в нормальных клетках. Полагают, что важнейшее значение для развития злокачественных новообразований приобретает дисрегуляция микроРНК. В настоящее время получены убедительные доказательства, что дисрегуляция экспрессии микроРНК является отличительной чертой злокачественных гемобластозов [Iorio M.V. 2009]. Причины аномальной экспрессии микроРНК в гемобластозах многочисленны и могут включать в себя хромосомные аберрации, эпигенетическое дерегулирование, аномальную экспрессию транскрипционных факторов, которые регулируют промоторные регионы микроРНК. Многие из микроРНК, которые аномально экспрессируются в гематологических злокачественных новообразованиях, также являются ключевыми регуляторами кроветворения.
Получено очень много данных, свидетельствующих о ключевой роли микроРНК в нарушениях гемопоэза, в том числе и после радиационного воздействия. Однако, применение полученных результатов в клинической практике весьма скромно. Существует надежда, что использование препаратов, влияющих на экспрессию индивидуальных микроРНК, позволит регулировать процессы кроветворения. Показано, что miR-15а, miR-16, miR-342, miR-107, let-7а, miR-21, miR-34a, miR-125 принимают активное участие в формировании гемабластозов.
Уже в 2005 году удалось показать, что существуют комплекс из 29 микроРНК, изучение экспрессии которых позволяет различить опухоли молочной железы от нормальных тканей с точностью до 100%. [Iorio M.V. 2005]. miR-10b, miR-125b и miR-145 cнижали свою экспрессию в опухолях молочной железы, в то время как miR-21 и miR-155 были активированы. Индивидуальные микроРНК, такие как члены семейства let-7, связаны с подтипом опухоли и позволяют оценить степень развития РМЖ. Пять микроРНК (miR-210, -21, -106b , - 197, и let-7i) были связаны с выживаемостью, метастазами.
Примерно один из трех мужчин в возрасте старше 50 лет демонстрирует гистологические признаки аденомы предстательной железы. Тем не менее, только у 10% диагностированы клинически значимые карциномы предстательной железы. Большинство же аденом никогда не прогрессируют и не становятся опасными для жизни. До сих пор мало известно о механизмах, приводящих к злокачественному перерождению аденомы предстательной железы, делающей е опасной для жизни. Исследование профиля экспрессии микроРНК в опухолях выявили значительные изменения в содержании микроРНК, по сравнению с нормальной тканью. Кластер mir-15а/16-1 находится в хромосомной
области 13q14, которая инактивируется в 50% случаев РПЖ [Bonci D. 2008]. Повышенная экспрессия этого кластера при РПЖ обеспечивает ингибирование пролиферации клетки, индукцию апоптоза и подавление онкогенеза как in vitro, так и in vivo.
В связи с этим, влияние радиации на экспрессию микроРНК в нормальных клетках отличается от картины, наблюдаемой после облучения опухолей. Радиациационно-индуцированные повреждения ДНК в нормальных клетках вызывают увеличение активности транскрипционного фактора р53, что приводит к индуции экспрессии miR-34a, участвующей в реализации механизмов ареста клеточного цикла, старения и апоптоза [He L. et al. 2007]. Однако, хорошо известно, что в большинстве опухолей активность р53 ингибирована, наиболее часто за счет мутаций в гене, либо при высокой активности ингибиторов: mdm2 и mdm4. Поэтому после облучения опухолей не наблюдается адекватной стресс-воздействию активации онкосупрессора р53, а также экспрессии микроРНК, гены которых являются мишенями этого транскрипционного фактора, например, miR- 34, miR- 16.
Экспрессия miR, являющихся онкосупрессорами, часто подавлена в первичных человеческих опухолях, например, снижено содержание let-7c при РПЖ [Nadiminty N. 2012]. Некоторые miR также участвуют в замкнутых циклах регулирования р53 и, главным образом, транскрипта, добавляя другой регуляторный «слой» в радиационном ответе [Feng et al. 2011]. Нарушения основных сигнальных путей выживаемости клеток, опосредованные микроРНК, являются общими путями защиты раковых клеток от радиационно-индуцированной остановки клеточного цикла и смерти. Например, miR-21 и miR-95 вызывает увеличение выживаемости с помощью подавления регуляторов PTEN и SGPP1, соответственно [Huang X. 2013]. И наоборот, miR-9 и let-7 воздействуют на транскрипт NF-B1, отменяя эффект усиления выживаемости посредством активации NF-B –зависимого сигнального пути [Arora H. 2011]. Вовлечение miR в эти хорошо изученные пути опухолевой выживаемости подчеркивает возможность развития терапевтических стратегий, нацеленных на эти пути.
Особое значение имеют эксперименты на стволовых опухолевых клетках. Показано, что miR-34a подавляет сохранение и развитие человеческих стволовых раковых клеток предстательной железы CD44+ , нарушая развитие опухоли и метастазов в условиях in vivo [Liu C. 2011]. miR-145 воздействует на транскрипционные факторы OCT4, SOX2 и KLF4, которые являются центральными белками поддержания свойств стволовых клеток [Xu N. 2009], а также участвует в регуляции способности к самообновлению стволовых клеток в различных опухолях, включая РПЖ [Huang S. 2012].
Динамика возникновения опухолей молочной железы у аутбредных крыс-самок в условиях проведенного эксперимента
Как видно из таблицы 6 содержание мРНК гена P53 в гомогенате опухолей м.ж., образованных спонтанно на 550 сутки эксперимента (группа «биоконтроль+опухоль м.ж.), достоверно снижено во всех образцах по сравнению с нормальной тканью. В этой же группе наблюдается падение мРНК гена MDM2 (медиана составила 0,32 отн.ед., р 0,05) и увеличение зрелых let-7i и miR-21 (медиана составила 955,43 и 38,05 отн.ед. соответственно). Нестабильность содержания зрелой miR-16-2 от одного образца к другому проявляется широким диапазоном между верхним и нижним квартилями (таблица 6), по критерию Манна-Уитни изменение относительного количества miR-16-2 статистически не значимо (р 0,05).
В гомогенате опухолей м.ж., образованных после облучения на 550 сутки (группа «облучение+опухоль м.ж.»), не наблюдается изменений относительной экспрессии генов Р53, MDM2, MDM4 по сравнению с контролем. Относительное количество зрелой let-7i было высоким и варьировало во всей выборке (n=6) от 18820 до 1956712 отн.ед. (медиана 24117 отн.ед., р 0,05). Содержание зрелых miR-21 и miR-34c также статистически значимо превышало контрольный уровень и колебалось от 349 до 4871,6 отн.ед. для miR-21 и 36,76-676 отн.ед. для miR-34c. В 5-ти образцах опухолевой ткани м.ж. после облучения удалось зафиксировать достоверное увеличение содержание зрелых miR-145 и miR-16-2 в 22,3 и 103,9 раза соответственно по сравнению с нормальной тканью. Относительное количество зрелой miR-125b статистически превышало группу «биоконтроль».
Различия групп «облучение+опухоль м.ж.» и «биоконтроль+опухоль м.ж.» статистически значимы для мРНК MDM4 и let-7i (р 0,05).
Примечание: -изменения уровней содержания (Ме) мРНК и микроРНК отображено на круговых осях в логарифмическом масштабе; - значения медианы (Ме) показателей экпериментальных групп нормированы к медиане группы «контроль», условно принятой за 1,0; - различия между группами «облучение+опухоль» и «биоконтроль» статистически значимы (р 0,05); - различия между группами «облучение+опухоль» и «биоконтроль+опухоль» статистически значимы (р 0,05); - различия между группами «биоконтроль+опухоль» и «биоконтроль» статистически значимы (р 0,05)
Экспрессия генов Р53, MDM2, MDM4 и экспрессия зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок на 75, 315 и 550 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр Другой радиочувствительной тканью является костный мозг, где после острого лучевого воздействия в сублетальных дозах у крыс появление злокачественных новообразований маловероятно, в отличие от тканей молочной железы - органе, в котором образование спонтанных и радиационно-индуцированных опухолей достаточно частое событие. Проведение исследований по сопоставлению влияния ионизирующей радиации в молочной железе и костном мозге полезно для оценки антиканцерогенных возможностей р53 82 системы и определения маркеров, способных выявить различия в функционировании р53-системы в этих органах в длительной временной динамике после облучения. А) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок на 75 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном времени
Впервые исследованы изменения состояния р53-сиситемы путем относительного количественного анализа мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок в отдаленный период после острого однократного -облучения (75 сутки), когда в костном мозге происходит субкомпенсированное восстановление клеточности, но образование опухолей еще маловероятно. Полученные результаты нормированы к группе «биоконтроль», условно принятой за 1, и представлены в виде медианы и 25% и 75% квартилей в таблице 7.
Из таблицы 7 видно, что в гомогенате костного мозга после облучения (группа «облучение») происходит достоверное уменьшение содержания мРНК Р53, MDM2 в 52 и в 21 раз соответственно по сравнению с группой «биоконтроль» (р 0,05).
Относительный уровень содержания miR-34c в гомогенате костного мозга на 75 сутки после облучения составляет 0,03 отн.ед., что достоверно ниже группы «биоконтроль» (р 0,05). Обращают на себя внимание данные по содержанию зрелой miR-21 в клетках костного мозга у облученных крыс на 75 сутки после радиационного воздействия (рисунок 13). В клетках костного мозга у 5 крыс из 10 обследованных животных на 75-е сутки после облучения обнаружено более чем 10-кратное увеличение содержания зрелой микро РНК miR-21 по сравнению с медианой этого показателя группе «биоконтроль». Таких значений содержания зрелой микро РНК miR-21 в контрольной группе, состоящей из 15 животных, не обнаруживалось. Применение непараметрического точного критерия Фишера при сопоставлении групп «облучение» и «контроль» показало, что появление в клетках костного мозга у части облученных крыс значений, превышающих более чем в 10 раз медиану содержания miR-21 в группе контроль, не является случайным (р = 0,0038).
Б) Анализ содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок на 315 сутки после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр с помощью метода ПЦР в реальном времени
Впервые было исследовано содержание микроРНК, характеризующие р53-систему в гомогенате костного мозга аутбредных крыс-самок в отдаленный период (315 сутки) после однократного -облучения в дозе 2,5 Гр, когда продолжаются восстановительные процессы в кроветворении, а развитие опухолей гематологической и солидной природы становится весьма вероятным. Результаты определения относительного содержания мРНК генов Р53, MDM2, MDM4 и зрелых miR-21, miR-34c, miR-125b, miR-145, miR-16-2, let-7i, нормированого к группе «биоконтроль», условно принятой за 1, представлены в виде медианы и 25% и 75% квартилей в таблице 8.
Исследование экспрессии микроРНК, регулирующих р53- зависимую системусохранения стабильности генома, в крови онкологических больных до и после курса дистанционной -терапии
В наших исследованиях в периферической крови пациентов с диагнозом ОЛБ и МЛП статистически значимо отличался от контрольной группы «Доноры» уровень содержания мРНК гена MDM4, miR-34a, miR-21 miR-145. Конкретно показано, что содержание miR-34a и miR-21 снижено только у больных с диагнозом ОЛБ, а miR-145 – повышен у больных МЛП, содержание мРНК гена MDM4- увеличено в обеих группах.
Согласно данным литературы известно, что miR-21 высоко экспрессируется при солидных опухолях, при сердечно-сосудистых заболеваниях, при воспалительных процессах. Индукция miR-21 воспалительными стимулами зафиксирована в гемопоэтических клетках иммунной системы (особенно в моноцитах/макрофагах, дентритных клетках и Т-лимфоцитах), а также в негемопоэтических опухолевых клетках. Недавние исследования подтвердили ключевую роль miR-21 в процессах воспаления и отрицательной регуляции провоспалительного ответа, индуцированного теми же стимулами, которые вызывают индукцию самого miR-21 [Frederick J. et al. 2015]. В частности, miR-21 является ключевым посредником противовоспалительной реакции макрофагов. Это говорит о том, что ингибирование miR-21 в лейкоцитах может провоцировать воспаление. Известно, что miR-21 умеренно экспрессируется в кроветворных прогениторных клетках, однако ее количество значительно увеличивается в зрелых клетках крови, находящихся в активном состоянии, а именно в тучных клетках, нейтрофилах, активированных Т-лимфоцитах [Monticelli S. et al. 2005]. Следовательно, высокий уровень экспрессии miR-21 – это маркер активации иммунной системы, хотя необходимо еще выяснить, причина это или следствие.
На примере нейтрофилов больных миелодиспластическим синдромом было продемонстрировано, что эктопическая экспрессия miR-34a влияет на миграцию нейтрофилов [Cao M. et al. 2015]. Обнаружено, что высокий эктопический уровень miR-34a не оказывает воздействие на дегрануляцию нейтрофилов, поскольку уровень миелопероксидазы и эластазы не изменялся по сравнению с контрольными клетками, однако миграция клеток была значительно понижена из-за высокого количества miR-34. Авторам удалось идентифицировать прямую мишень miR-34a- это фактор обмена гуаниновых нуклеотидов DOCK-8, который активирует регулятор клеточной миграции Сdc42.
Известно, что макрофаги осуществляют фагоцитоз апоптотических клеток для предотвращения воспаления и скретируют большое количество интерлейкина-10 (Il-10) для поддержания нормального гомеостаза. Не опровергая факт, что miR-145 способствует апоптозу как опухолевой супрессор, в исследовании авторов [Li L., Jin H. et al. 2013] показано, что экспрессия Il-10 находится под контролем miR-145, благодаря тому, что miR-145 воздействует на деацетилазу гистонов HDAC, вызывающую сайленсинг IL-10.
Кроме неполноценности кроветворения, обнаруживаемоего в отдаленный период после облучения, длительное наблюдение за пациентами позволяет оценить риски развития опухолей солидной и гематологической природы. Показано, что частота появления солидных опухолей, развиваюшихся в отдаленном периоде после ОЛБ, в целом не превышает частоту развития раков населения России, а частота появления онкогематологических заболеваний превышает таковую по стране. Наиболее часто встречаемой солидной опухолью явилась базалиома (базальноклеточный рак кожи), выявляемая в случае перенесения тяжелых МЛП и предусматривающая непосредственную связь новообразования и лучевого поражения.
Базалиомы – одна из наиболее часто встречаемых злокачественных опухолей кожи, развивающаяся из базальных клеток эпидермиса и волосяных фолликулов, для которой характерен местнодеструирующий рост без образования метастазов в лимфоузлы и внутренние органы. Показано, что возникновение базалиом в большинстве случаев происходит на фоне сниженного иммунитета и дефектов репарации ДНК [Писклакова Т.П. 2004]. Анализ индивидуальных показателей, характеризующих P53-зависимую систему защиты генома, не выявил каких-либо изменений в периферической крови пациентов с диагнозом базалиомы.
Помимо базалиом из солидных опухолей, обнаруживаемых среди пациентов после перенесения ОЛБ, ОЛБ+МЛП, МЛП, были рак гортани, РПЖ, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, рак левой почки, рак ректосигмоидального отдела толстой кишки, а из онкогематологических нарушений – хронический миелолейкоз и миелодиспластический синдром (МДС). Длительный период наблюдения за состоянием здоровья больных (2-51 год) показал, что пациенты с диагнозом ОЛБ+МЛП имели большую нагруженность эпизодами опухолей, т.е. у одного и того же пациента последовательно развивалось несколько опухолей различной локализации, включая базалиомы. У пациентов с диагнозом МЛП ни одного случая развития злокачественного новообразования за все сроки динамического обследования зафиксировано не было. Данный патофизиологический феномен может быть трактован как ранняя активация неспецифических адаптационных механизмов, предотвращающий развитие более серьезных последствий. Из литературы известно, что предварительное нанесение легкой механической травмы или ожога повышает устойчивость организма к последующему радиационному воздействию, облегчает течение ОЛБ и снижает показатели летальности [Гребенюк А.Н. 2012]. В данном случае зафиксированное нами повышенное содержание miR-145 в периферической крови у пациентов с диагнозом МЛП в отдаленный период может коррелировать с противовоспалительным действием miR-145 и отсутствием появлением новообразований.
Следует напомнить, что источником мРНК и микроРНК в периферической крови являются клетки крови и выделяемые различными тканями организма экзосомы, содержащие эти РНК-соединения. При развитии патологий в различных органах пациентов может наблюдаться изменение их выброса в кровь в составе экзосом. Поскольку у обследуемых нами пациентов, имевших в анамнезе ОЛБ, наблюдалось снижение экспрессии зрелых miR-34а и miR-21, можно предполагать, что уменьшение содержания miR-21 вцелом может определяться снижением пролиферативной способности тканей. Уменьшение экспрессии зрелой miR-34а в периферической крови, возможно, обусловлено наличием в организме тканей, в которых нарушена эффективность функционирования p53. Это может увеличивать риск онкотрансформации. При изучении содержания показателей р53-системы в периферической крови «Доноров» и пациентов достоверные корреляции выявляются не часто. Обнаружено, что в группе «Доноры» мРНК Р53 положительно коррелирует только с miR-145, и мРНК MDM2. У пациентов с диагнозом ОЛБ содержание мРНК гена Р53 положительно коррелирует с мРНК гена MDM4, а в группе МЛП – с miR-145. В группе пациентов с диагнозом ОЛБ+МЛП достоверные корреляции не выявляются.
Индивидуальный анализ исследованных нами пациентов показал, что у лиц, перенесших во время обследования, либо после него, рак толстой кишки, рак щитовидной железы, рак мочевого пузыря, либо хронический миелолейкоз обнаруживали многократное уменьшение зрелой miR-34, либо увеличение miR-21. Это подтверждает информационную значимость исследованных нами показателей для оценки эффективности P53 -системы защиты генома и возможности их использования для оценки риска развития отдаленных последствий.
Основными методами лечения онкологических заболеваний являются удаление опухолей хирургическим путем, применение химиотерапии и ЛТ. Согласно данным литературы до 40-60% онкологических больных получают ЛТ в процессе их лечения.