Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Литературный обзор 11
1.1. Строение сетчатки глаза животных 11
1.2. Резистентность сетчатки глаза при действии генотоксических агентов 13
1.3. Факторы, приводящие к цитотоксическим последствиям для сетчатки глаза 18
1.3.1. Радиационное воздействие на человека при осуществлении пилотируемых космических полетов 18
1.3.2. Радио-, химиотерапия и вторичные патологии зрения 21
1.4. Действие метилнитрозомочевины на сетчатку глаза животных 23
Глава 2. Материалы и методы исследования 26
2.1 .Содержание мышей 26
2.2. Облучение животных 26
2.3. Введение животным метилнитрозомочевины 26
2.4. Выделение сетчатки глаза мышей и приготовление суспензии ее клеток 27
2.5. Приготовление препаратов для морфологических исследований 27
2.6. Вестерн-анализ белков Р53 и ATM 29
2.7. Иммуноцитохимическое определение экспрессии белков 30
2.8. TUNEL-детекция гибели клеток 32
2.9. Регистрация электроретинограммы 32
2.10. Визуализация глиалъных клеток Мюллера в срезах сетчатки глаза 34
2.11. Метод ДНК-комет 34
Глава 3. Результаты исследования 41
3.1. Реакция сетчатки глаза мышей на облучение ускоренными протонами 41
3.2. Влияние метилнитрозомочевины на сетчатку глаза мышей 53
3.3. Спонтанные повреждения и репарация ДНК в клетках сетчатки глаза мышей 58
3.4. Адаптивный ответ сетчатки глаза мышей на введение метилнитрозомочевины и облучение протонами 62
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 76
4.1. Генотоксическая устойчивость сетчатки глаза мышей 76
4.2. Структурное и функциональное восстановление сетчатки глаза мышей после генотоксического воздействия 80
Выводы 82
Заключение 83
Список литературы
- Радиационное воздействие на человека при осуществлении пилотируемых космических полетов
- Действие метилнитрозомочевины на сетчатку глаза животных
- Приготовление препаратов для морфологических исследований
- Спонтанные повреждения и репарация ДНК в клетках сетчатки глаза мышей
Введение к работе
Актуальность проблемы
Исследование патогенеза дегенеративных заболеваний сетчатки глаза является ключевой и до сих пор нерешенной проблемой современной экспериментальной и клинической офтальмологии. Значительный вклад в возникновение и развитие этих патологий вносят генотоксические факторы внешней среды - радиация и химические вещества. Изучение механизмов действия этих факторов на сетчатку глаза принципиально важно для оценки рисков постлучевых осложнений, возникающих при лучевой терапии глаза и мозга и, как правило, в сочетании с химиотерапией. Пострадиационная ретинопатия и когнитивные расстройства часто являются нежелательными побочными эффектами при радиотерапии, поскольку локальные дозы на органы головы человека могут быть весьма значительными. Так, при радиотерапии опухолей носоглотки и глаза суммарная доза облучения может превышать 50 Гр, а при протонной терапии меланомы глаза кумулятивная доза фракционированного облучения составляет 54-75 Гр.
Радиационный фактор также представляет вполне реальную опасность для сетчатки глаз космонавтов при осуществлении длительных космических полётов. В последнем случае речь идёт о повреждающем действии тяжёлых заряженных частиц Галактического космического излучения при длительных полетах вне магнитосферы Земли. При этом клинически значимые повреждения могут возникать не непосредственно после воздействия, а спустя месяцы и даже годы, что важно для разработки средств профилактической терапии, базирующейся на способности сетчатки к восстановлению.
Цитотоксическая химиотерапия также вызывает офтальмологические осложнения в виде обратимых и необратимых острых и хронических глазных заболеваний. Базовым компонентом стандартных протоколов химиотерапии, в том числе меланомы, являются метилнитрозомочевина (МНМ) и ее производные. Метилнитрозомочевина - монофункциональный метилирующий агент, вызывающий повреждение ядерной ДНК в клетках млекопитающих. В середине 90-х годов в литературе появились сообщения о цитотоксическом действии супермутагена МНМ на клетки сетчатки глаза лабораторных животных (Yuge et al, 1996). Особенностью действия МНМ является ее высокая избирательная цитотоксичность по отношению только к фоторецепторным клеткам сетчатки (Tsubura et al, 2011), что делает МНМ удобным инструментом для изучения дегенерации сетчатки и оценки эффективности веществ и процедур, препятствующих ее развитию.
Основу зрелой сетчатки глаза млекопитающих составляют терминально дифференцированные клетки, утративших свой регенеративный потенциал. Для них апоптоз представляется гибельным, угрожающим существованию органа и организма в целом. Вместе с тем в эмбриогенезе глаза апоптоз играет важную роль. По мере дифференцировки клеточных элементов сетчатки частота апоптоза снижается (Walsh, 1997). Таким образом, зрелая сетчатка приобретает высокую устойчивость к генотоксическому стрессу и связанному с ним апоптозу. Ранее разными авторами была показана резистентность сетчатки по отношению как к ионизирующему излучению (Gorgels et al., 2007, Тронов и соавт., 2008, Amoaku W.M. et al., 1992), так и к действию алкилирующих агентов (Jenkins et al., 2005). Также было показано, что дозы, вызывающие детектируемые морфологические изменения сетчатки глаза, превышают летальные дозы для исследуемого животного при общем облучении (Gorgels et al., 2007; Williams and Lett, 1996; Keng and Lett, 1981).
Наследственная или вызванная внешним воздействием дегенерация сетчатки начинается с гибели фоторецепторных клеток, вслед за которой разрушается система трофической поддержкиткани, приводящая к гибели нейронов сетчатки глаза (Marc et al, 2003). Хотя доминирующей формой гибели фоторецепторных клеток сетчатки глаза признается апоптоз (Хи, 1996; Marigo, 2007), тем не менее связь повреждения ДНК с гибелью постмитотических клеток, формирующих сетчатку глаза, в настоящее время не исследована. Показано, что в постмитотических клетках активной сохраняется репарация ДНК, ассоциированная с транскрипцией активных генов, она из разновидностей экспизионной репарации нуклеотидов (NER) (Nouspikel, Hanawalt, 2002; Simonatto et al, 2007).
Цель и задачи исследования
Цель диссертационной работы заключалась в оценке повреждающего действия протонов высоких энергий и метилнитрозомочевины на структуру ДНК в сетчатке, на функциональную активность сетчатки глаза мышей и оценка способности сетчатки к восстановлению после воздействия этих генотоксических агентов.
На пути ее выполнения решались следующие задачи:
1. Исследовались морфологические изменения сетчатки глаза мышей после
действия ускоренных протонов с энергией 150 МэВ и у-излучения Со (дозы 14 Гр и
25 Гр) и метилнитрозомочевины (дозы 35 и 70 мг/кг). Данные дозы различаются по их
цитотоксичному воздействию на сетчатку.
2. Исследовалось повреждение генома клеток зрелой сетчатки глаза и
активность репарационной системы после действия ускоренных протонов, у-
излучения и метилнитрозомочевины.
3. Оценивалось изменение функциональной активности сетчатки глаза в ответ
на воздействие протонами высоких энергий и метилнитрозомочевиной.
-
Оценивалось адаптирующее действие на сетчатку глаза ускоренных протонов и метилнитрозомочевины в относительно низких дозах и способность сетчатки глаза мышей к восстановлению.
-
Исследовалась роль глиальных клеток Мюллера в повреждении и восстановлении сетчатки глаза мышей после воздействия протонами и метилнитрозомочевиной.
Положения, выносимые на защиту:
-
Ответ зрелой сетчатки глаза на облучение протонами и инъекцию метилнитрозомочевины свидетельствует о наличии у нее генотоксического порога и способности к структурному и функциональному восстановлению.
-
Обнаружен адаптивный ответ сетчатки глаза на фракционированное введение метилнитрозомочевины, а также на комбинированное воздействие протонами и введение МНМ.
3. Обнаружено возможное участие глиальных клеток Мюллера в восстановлении от генотоксического стресса. Научная новизна В работе впервые:
1. Исследована динамика формирования разрывов ДНК и их последующая
репарация in vivo в сетчатке глаза мышей, облученных протонами высоких энергий и
у-квантами Со. Показано, что в ответ на возникшие повреждения ДНК после
облучения возрастает экспрессия генострессовых белков ATM и р53 в сетчатке глаза,
которые стимулируют репарацию ДНК и не вызывают апоптоза поврежденных
клеток.
2. Показана нелинейная зависимость ответа сетчатки глаза мышей на
воздействия, что говорит о наличии у сетчатки глаза генотоксического порога. Этот
порог эквивалентен дозе облучения ускоренными протонами ~ 15 Гр, ниже которого
происходит восстановление поврежденого генома, а также структурной целостности
и функциональной активности сетчатки глаза мышей. При воздействии облучения
ускоренными протонами в дозе выше пороговой, 25 Гр или после введения МНМ в
дозе 70 мг/кг в сетчатке наблюдались структурная деградация и необратимое
снижение/утрата функциональной активности.
3. Показано, что предварительное введение мышам метилнитрозомочевины в
нетоксической дозе повышает толерантность сетчатки глаза к последующему
действию агента в ретинотоксической дозе. Такое фракционированное воздействие
МНМ снижает экспрессию эффекторной апоптотической каспазы-3 и гибель фоторецепторных клеток по сравнению с однократным воздействием МНМ в ретинотоксической дозе.
-
Показано, что предварительное облучение ускоренными протонами в дозе 1 Гр вызывает адаптирующий эффект зрелой сетчатки глаза: она приобретает устойчивость к последующему ретинотоксическому действию МНМ. Эффект радиационного гормезиса сетчатки согласуется с возрастанием эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК.
-
Обнаружена активация глиальных клеток Мюллера (ГКМ) в сетчатке глаза в ответ на инъекцию мышам метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг. Отмечается тенденция к снижению числа активированных ГКМ в сетчатке глаза после последовательного введения МНМ в дозе 17 и 70 мг/кг.
-
Показано наличие в сетчатке глаза спонтанных повреждений ДНК в виде щелочелабильных сайтов, которые являются окси-модифицированными основаниями
ДНК.
Научно-практическая значимость работы
Результаты проведенного исследования имеют теоретическое и практическое значение для решения фундаментальной проблемы повреждения и восстановления терминально дифференцированных клеток и, состоящих из них, тканей (в данном случае сетчатки глаза).
Результаты по восстановлению и гормезису сетчатки глаза могут быть использованы для оптимизации радио- и химиотерапии опухолей головы, мозга, шеи и глаз (подбор дозы фракционированного воздействия, длительности интервалов между фракциями).
Модель МНМ-индуцированной дегенерации сетчатки глаза может использоваться для первичной оценки эффективности лекарственных средств, препятствующих дегенерации сетчатки, и для прогноза опасности ретинотоксического воздействия на человека радио- и химиотерапевтических процедур. Полученные данные также могут послужить прогностическим показателем влияния условий космоса на человека при осуществлении длительных пилотируемых космических полетов.
Апробация работы
Основные положения и результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на 10 конференциях: XVI, XVII, XVIII и XIX научные конференции молодых ученых и специалистов (2012, 2013 и 2014 гг., Дубна); 16-ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ -
НАУКА XXI ВЕКА» (2012 г, Пущино); I и II Школа-конференция для молодых ученых и специалистов (2012, 2013, 2015 гг., Алушта); 36-я сессия программно-консультативного комитета ОИЯИ по физике конденсированных сред (2012 г., Дубна); Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '13» (2013 г., Пущино); 40th meeting of the РАС for Condensed Matter Physics (2014, Dubna); VII Съезд по радиационным исследованиям (2014 г., Москва); Круглый стол «Актуальные проблемы общей и космической радиобиологии и астробиологии» (2014 г., Дубна).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 94 страницах, состоит из введения, 4 глав, выводов и заключения, содержит 6 таблиц и 32 рисунка. Список литературы включает 95 наименования, из которых 8 — на русском и 87 — на английском языках.
Радиационное воздействие на человека при осуществлении пилотируемых космических полетов
Основным поражающим фактором при пилотируемых космических полетах являются потоки заряженных частиц, составляющих Галактическое космическое излучение (ГКИ), и протоны, генерируемые при солнечных вспышках. Поскольку зрительная система (в том числе и сетчатка глаза) характеризуются достаточно высокой степенью радиационной устойчивости, то следует исключать рентгеновские лучи и -кванты, как ретинопатические факторы при космических полетах.
Основную часть ГКИ составляют протоны и ионы гелия (до 98%). Остальная часть представлена тяжелыми заряженными частицами (Винклер Дж.Р., 1964; Curtis S.B., 1974). При длительных полетах вне магнитосферы Земли наибольшую биологическую опасность представляет ГКИ из-за высокого содержания высокоэнергетичных тяжелых ядер (http://www.nap.edu/openbook.plip7record id=12045&displayrelated=22). При прогнозировании длительных космических полетов в глубоком космосе имеют значение следующие особенности протонов и ГКИ: протоны солнечных вспышек обладают энергией до нескольких ГеВ/нуклон, тяжелые ядра в составе ГКИ характеризуются высокими величинами линейных потерь энергии (ЛПЭ). Поэтому видимый биологический эффект при их воздействии достигается уже при невысоких дозах, магнитосфера и атмосфера Земли практически исключают попадание высокоэнергитичных заряженных частиц на ее поверхность. Вследствие этого все живые организмы не имеют эволюционной адаптации к этим воздействиям.
В наземных условиях смоделировать воздействие космических видов излучения возможно лишь в лабораторных экспериментах, проводимых на ускорителях протонов и тяжелых заряженных частиц. В Объединенном институте ядерных исследований для таких экспериментов используются фазотрон, генерирующий протоны с энергией 660 МэВ, Нуклотрон - ускоритель релятивистских тяжелых ядер с энергиями до нескольких ГэВ/нуклон и изохронный циклотрон МЦ-400, ускоряющий заряженные ядра до энергии 50 МэВ/нуклон.
При облучении ретинальных эксплантов эмбрионов цыплят (Vazquez М.Е. and Kirk Е., 2000) морфометрически было показано, что дозы 0,1-0,5 Гр тяжелых ионов железа тормозят формирование нейритов ганглиозными клетками. Максимальное торможение наблюдалось при дозе 1 Гр. Однако при морфологическом анализе срезов сетчатки глаза крыс после пролета отдельных ускоренных ионов аргона с энергией 570 МэВ/нуклон (доза 1 Гр) во всех слоях облученной сетчатки не было обнаружено «микроповреждений» (Krebs W. et al., 1988). Отмечалось, что облучение сетчатки глаза крыс in vivo ускоренными ионами железа с энергией 450 МэВ/нуклон в дозе 2,5 Гр приводило к 20%-му снижению общего количества клеток пигментного эпителия, фоторецепторов и биполяров. Со временем наблюдалось ее восстановление до контрольных значений. При облучении в дозе 0,1 Гр повреждающий эффект отмечен не был (Krebs W., Krebs I. and Worgul B.V., 1990).
Уже при первых пилотируемых космических полетах космонавты фиксировали появление в глазах световых вспышкек (фосфенов) в виде ярких точек, черточек и линий, двигающихся по зрительному полю. Было высказано предположение, что их появление является следствием пролета заряженных частиц, присутствующих в космических лучах. Эта гипотеза была подтверждена экспериментально. В прямых экспериментах с участием добровольцев аналогичные вспышки наблюдались при пролете через глаз ускоренных тяжелых заряженных частиц с энергией, ниже пороговой для видимого черенковского свечения (Curtis S.B., 1994). Проведенный анализ частоты вспышек в глазах космонавтов показал, что они вызваны, в основном, ионами углерода и/или кислорода. Хотя наблюдения не идентифицировали каких-либо прямых последствий от фосфенов для зрения космонавтов, тем не менее их исследование включено в научные программы по безопасности NASA для космонавтов, работающих на МКС (Sannita W.G., Narici L. and Picozza P., 2006; http://www.nap.edu/openbook.php7record id=12045&page=9).
Следствием воздействия ГКИ на космонавтов могло быть наблюдаемое у них впоследствии возникновение катаракты. Изучение катарактогенеза при действии низких доз радиации способствовало тому, что была пересмотрена норма минимальной дозы радиоактивного излучения, вызывающая образование катаракты у человека. Если ранее минимальная доза равнялась 2 Гр, то в 2012 г. она была снижена до 0,6 Гр (Thome М.С, 2012).
Под действием радиации нарушаются процессы образования и миграции волоконных клеток хрусталика глаза. В результате этого в эпителиальном слое появляются пустоты, что ведет к увеличению диффузии молекул кислорода в хрусталик, а в кортексе появляются клетки, содержащие митохондрии. Увеличение концентрации кислорода в хрусталике приводит к усилению образования активных форм кислорода (АФК) в митохондриях, откуда они диффундируют в окружающие ткани. Так, взаимодействие АФК с белками хрусталика вызывает денатурацию и агрегацию белка, приводит к нарушению белок-белковых взаимодействий и усилению светорассеяния в цитоплазме хрусталика. Помутнение хрусталика затрагивает сначала кортикальные области, но постепенно распространяется и на его ядерную область. Конечной стадией этого процесса является окислительное повреждение белков цитоплазмы волоконных клеток хрусталика, главным образом, кристаллинов (Муранов К.О. и Островский М.А., 2013).
Действие метилнитрозомочевины на сетчатку глаза животных
Тотальное облучение животных в дозе 14 Гр не приводило к существенным дегенеративным изменениям сетчатки глаза мышей в течение трех суток после облучения ускоренными протонами и у-квантами 60Со. Как можно видеть на рисунке 8, некоторые изменения наблюдаются только через 7 суток после облучения. После воздействия ускоренными протонами отмечено (рис. 8) небольшое снижение толщины ядерного слоя фоторецепторных клеток (рис. 8 б), которое не сопровождалось морфологическими изменениями ядер и сегментов фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей (рис. 8 а). Аналогичная картина наблюдается и после у-облучения животных. Через 7 суток после облучения мышей у-квантами 60Со в той же дозе отмечается только некоторое разупорядочивание слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза (рис. 8 а). В обоих случаях морфологические изменения ядер и сегментов фоторецепторных клеток сетчатки глаза не являлись стабильно воспроизводимым эффектом при тотальном облучении мышей.
Исследование влияния облучения на физиологическую активность сетчатки глаза мышей проводилось электроретинографически: сравнивались профили электроретинограммы (ЭРГ) и зависимости амплитуд а- и й-волн от интенсивности вспышек белого света в контрольных животных и для облученных ускоренными протонами и у-квантами 60Со тотально в дозе 14 Гр. На рисунке 9 представлены репрезентативные профили ЭРГ сетчатки глаза мышей. Можно видеть, это исследование не показало существенных изменений электроретинограммы у облученных животных по сравнению с контролем. Небольшое снижение амплитуды ЭРГ после облучения протонам высоких энергий, скорее всего, не связано с деструктивным эффектом облучения, как и в случае с изменением толщины ядерного слоя (рис. 8). При этом не отмечено существенных различий у животных, облученных тотально как ускоренными протонами, так и у-квантами 60Со.
Морфологические изменения сетчатки глаза мышей после тотального облучения ускоренными протонами и у-квантами 60Со в дозе 14 Гр: а) микрофотографии сетчатки глаза, полученные в разные сроки после общего облучения: СФР - слой наружных и внутренних сегментов фоторецепторных клеток, НЯС - наружный ядерный слой, НСС - наружный сетчатый слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ВСС - внутренний сетчатый слой, СГК - слой ганглиозных клеток, СГВ - слой ганглиозных волокон. б) средняя толщина ядерного слоя фоторецепторных клеток (% от общей толщины сетчатки), соответствующая микрофотографиям а) Контроль б) р , 14 гр в) у , 14Гр Рис. 9. Изменение физиологической активности (ЭРГ) сетчатки глаза мышей через 15 ч после общего облучения ускоренными протонами (р) и у -квантами в дозе 14 Гр: а) контроль, б) и в) облученные животные. Зависимость величины амплитуды электроретинограммы от интенсивности возбуждающих вспышек белого света с интервалом 3 минуты между ними представлена на рисунке 10. Как в контроле, так и у обученных животных амплитуды а- и й-волн электроретинограммы увеличиваются с повышением интенсивности вспышек белого света. В области интенсивностей от -1,5 до -0,5 кд с/м (lg) кривые выходят на плато (рис. 10 а), что позволяет корректно провести усреднение значений амплитуд ЭРГ в этом диапазоне интенсивностей. Средние значения амплитуд электроретинограммы в зависимости от срока исследования (9, 15 и 20 ч) представлены в виде гистограммы на рисунке 10 б. Можно отметить некоторое снижение величин амплитуд ЭРГ в первые 10-15 часов после облучения ускоренными протонами. В последующем, к исходу первых суток, значения амплитуд электроретинограммы сетчатки глаза мышей после облучения восстанавливаются до контрольных значений.
Несмотря на отсутствие существенных изменений в морфологии и функциональной активности сетчатки глаза мышей, тем не менее, облучение животных ускоренными протонами и у-квантами 60Со тотально в дозе 14 Гр вызывало увеличение экспрессии генострессовых белков ATM и р53. На рисунке 11 представлен репрезентативный результат вестерн-блоттинга для этих белков в сетчатке глаза мышей в разные сроки после облучения ускоренными протонами и у-квантами в дозе 14 Гр. Показано, что после воздействия облучения в сетчатке глаза мышей происходит накопление белков ATM и р53. Видно, что через 12-14 ч после воздействия ускоренными протонами и у-квантов 60Со наблюдается нормализация экспрессии белков ATM и р53 до контрольного уровня. К
Вестерн-анализ экспрессии белков ATM и р53 в сетчатке глаза мышей в разные сроки после облучения ускоренными протонами и у-квантами в дозе 14 Гр Генострессовые белки р53 и ATM являются сенсорами однонитевых и двунитевых разрывов ДНК. Поэтому было важно исследовать динамику репарации таких разрывов в клетках сетчатки глаза после облучения животных. Нами впервые была осуществлена попытка оценить динамику репарации однонитевых и двунитевых разрывов ДНК в сетчатке in vivo методом ДНК-комет после воздействия ионизирующего излучения в дозе 14 Гр. Как видно на рисунке 12, отмечается аналогичный характер динамики возникновения однонитевых и двунитевых разрывов ДНК.
Возникающие однонитевые и двунитевые разрывы ДНК сетчатки глаза эффективно репарируются в течение 10-15 ч после воздействия ускоренными протонами и у-квантами 60Со. Этот процесс коррелирует с динамикой снижения экспрессии генострессовых белков ATM и р53 после облучения (рис. 11).
Локальное облучение головы мышей ускоренными протонами позволило увеличить дозу облучения до 25 Гр. В результате такого облучения животные сохраняли жизнеспособность в течение 6 дней. За этот период исследования наблюдалась нарастающая во времени дегенерация фоторецепторных клеток сетчатки глаза. По микрофотографиям срезов сетчатки глаза мышей на рисунке 13 видно, что происходило разупорядочивание и деструкция сегментов фоторецепторных клеток, снижение общего количества клеток ядерного слоя и уменьшение его толщины. Снижение толщины слоя сегментов и ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей после облучения протонами высоких энергий в дозе 25 Гр подтверждено представленными результатами на рисунке 14. Эти изменения оставались достоверными (р 0,01) в течение 6 дней после облучения. Они отражают нарастающую гибель фоторецепторных клеток в сетчатке глаза мышей в течение исследуемого периода после облучения.
Приготовление препаратов для морфологических исследований
На это указывает локализация TUNEL-фокусов только в наружном ядерном слое сетчатки глаза (рис. 27 б). Следует также отметить, что морфологическая деструкция этого слоя сетчатки заметно менее выражена, несмотря на то, что наблюдается разупорядочивание фоточувствительных сегментов фоторецепторных клеток (рис. 27 г). Это служит свидетельством того, что апоптотическая деградация ДНК и активация эндонуклеаз в ядрах фоторецепторных клеток происходит ранее, чем морфологические изменения сетчатки — примерно на 24 ч.
На рисунке 28 представлена интенсивность флуоресценции ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей в контроле и через 48 ч после однократного и комбинированного воздействия протонов и МНМ. Количественная оценка интенсивности TUNEL-флуоресценции была проведена с помощью программы ImageJ. Она показала достоверное снижение цитотоксического эффекта от сочетанного воздействия ускоренных протонов и метилнитрозомочевины по сравнению с эффектом только от однократного введения МНМ в дозе 70 мг/кг (уровень значимости различий р 0,001). Другими словами, предварительное облучение ускоренными протонами головы мышей в дозе 1 Гр делает сетчатку глаза мышей более толерантной к цитотоксическому действию метилнитрозомочевины.
Известно, что апоптоз клеток инициируется двунитевыми разрывами ДНК, имеющими ферментативную природу (Разин СВ. и Юдинкова Е.Ю., 1998). Поскольку, как отмечено ранее, метилнитрозомочевина не вызывает разрывов ДНК, то следует предположить, что в апоптотических клетках сетчатки глаза должно наблюдаться формирование таких ферментативных двунитевых разрывов ДНК, инициирующих апоптоз. Их возникновение в клетках может коррелировать со средней скоростью апоптоза в сетчатке глаза. На рисунке 29 видно, что полученные результаты по оценке содержания двунитевых разрывов ДНК в клетках сетчатки глаза подтверждают это
Интенсивность флуоресценции ядерного слоя фоторецепторных клеток сетчатки глаза мышей в контроле и через 48 ч после однократной инъекции 70 мг/кг метилнитрозомочевины и при комбинированном действии протонов (1 Гр) и введения метилнитрозомочевины (70 мг/кг). Штрихи -средние значения для разных срезов сетчатки a)
Двунитевые повреждения ДНК (с ДНК) в клетках сетчатки глаза мышей через 48 ч после облучения адаптирующей дозой ускоренных протонов (1 Гр) и однократным введением метилнитрозомочевиной (70 мг/кг). а) распределение клеток по степени повреждения двунитевой ДНК; б) микрофотографии комет двунитевой ДНК, доминирующие в каждом из распределений; в) средние значения повреждений ДНК, найденные из этих распределений ±SD предположение. Среднее содержание двунитевых разрывов ДНК в клетках сетчатки после комбинированного действия ускоренных протонов и метилнитрозомочевины оказывается сниженным по сравнению с действием только метилнитрозомочевины. Результаты TUNEL-исследования показали, что этот эффект совпадает с частотой возникновения апоптоза в сетчатке глаза мышей (рис. 28).
Поскольку, считается, что важная роль в восстановлении сетчатки от повреждения принадлежит глиальным клеткам Мюллера (ГКМ), мы попытались на феноменологическом уровне оценить участие их и в адаптивном ответе сетчатки у мышей. Активацию этих клеток в сетчатке глаза после адаптирующей инъекции мышам метилнитрозомочевины регистрировали через 48 часов — минимальное время для промечивания ГКМ пролиферативным маркером бромдезоксиуридином. Клетки Мюллера чутко реагируют на химическое воздействие. Эта реакция (реактивный глиозис) на генотоксический стресс выражается их гипертрофией (увеличением размера), пролиферацией и миграцией к поврежденным участкам сетчатки. Эти три компонента реакции ГКМ представлены на микрофотографиях срезов сетчатки глаза в виде FITC-фокусов в фоторецепторном слое сетчатки (рис. 30). Фокусы представляют собой ядра пролиферирующих клеток, включивших BrUdR в ДНК. Подсчет таких фокусов на единичной площади среза дает количественную меру активации глиальных клеток Мюллера на генотоксический стресс. При введении МНМ однократно в дозе 70 мг/кг наблюдается выраженная активация ГКМ (рис. 30 б), соответствующая степени повреждения клеток. При последовательном введение МНМ (17+70 мг/кг), разделенном во времени 4-мя часами, обнаруживается снижение глиозиса (рис. 31) по сравнению с однократным введением МНМ по 70 мг/кг. Отмечается уверенная тенденция к снижению числа ГКМ в сетчатке глаза после фракционированного воздействия МНМ, что свидетельствует о снижении повреждающего действия этого агента (Р=0,08).
Активация клеток Мюллера в сетчатке глаза мышей in vivo после введения метилнитрозомочевины в дозе 70 мг/кг: а) срезы сетчатки глаза -стрелками показаны глиальные клетки Мюллера, меченные анти-BrUdR антителами; б) число FITC-фокусов на единицу площади среза через 48 часов после введения метилнитрозомочевины см
Активация глиальных клеток Мюллера в сетчатке глаза мышей в контроле, при однократном и фракционированном введении мышам метилнитрозомочевины. Штрихи — средние значения количества активированных глиальных клеток Мюллера в сетчатке глаза мышей Следует отметить, что использованная нами процедура визуализации глиальных клеток Мюллера открывает дополнительные возможности для характеристики ответа этих клеток на повреждение сетчатки глаза. На рисунке 32 представлены кометы однонитевой ДНК из клеток Мюллера, включивших маркер BrUdR. Эти кометы указывают на высокую степень поврежденности ДНК в этих клетках. Как уже отмечалось ранее, спонтанные повреждения наблюдаются во всех клетках сетчатки глаза. Поскольку зрительный процесс связан с высоким потреблением кислорода, сетчатка глаза оказывается самой оксигенированной тканью с высоким содержанием активных форм кислорода. Это объясняет высокий уровень спонтанного повреждения ДНК. При такой поврежденности ДНК, наблюдаемая устойчивость клеток сетчатки к апоптозу и способность к восстановлению, подчеркивает высокую степень адаптации сетчатки глаза к генотоксическим воздействиям, механизмы которой представляют, на наш взгляд, предмет дальнейшего изучения.
Спонтанные повреждения и репарация ДНК в клетках сетчатки глаза мышей
Другой обнаруженной нами особенностью сетчатки глаза является активная репарация повреждений ДНК. Она удаляет большую часть повреждений, индуцированных облучением и влиянием метилнитозомочевины. Однако она не затрагивает ранее существовавшие спонтанные повреждения ДНК (рис. 24). Спонтанные повреждения в виде однонитевых разрывов ДНК в клетках разных органов мышей отмечались и в работах других авторов (Valarde М. et al, 2000; Valarde М., Trejo С. and Rojas E. 2001). Степень повреждаемости ДНК в клетках мышей нарастала в таком же порядке, что и полученная в наших исследованиях: лейкоциты клетки печени клетки мозга клетки сетчатки (Wang A.,L. et al, 2010). Таким образом, наличие нерепарируемых дефектов в ДНК клеток интактной сетчатки, обратимое снижение ее функциональной активности также свидетельствуют о высокой генотоксической устойчивости сетчатки глаза мышей.
Как известно, апоптоз пролиферирующих клеток с сохранившимися в них повреждениями ДНК признается радикальным путем предотвращения появления генетически нестабильного потомства клеток. В настоящее время остается неясным, подвергаются ли апоптозу дифференцированные клетки сетчатки глаза под влиянием генотоксического стресса (Walsh К. and Perlman Н., 1997). Известно, что в постмитотических клетках подавлены некоторые механизмы репарации. Так, терминально дифференцированные клетки не способны осуществлять репарацию по механизму гомологичной рекомбинации (Homologous Recombination Repair - HRR), ассоциированному с репликацией. Кроме того, в этих клетках регуляторно подавлена глобальная репарация генома — одна из разновидностей механизма NER (Simonatto М., Latella L. and Puri P.L., 2007). Вместе с тем, терминально дифференцированные клетки транскрипционно активны и нуждаются в поддержании целостности транскрибируемой части генома на протяжении их жизни. Данную функцию выполняет механизм репарации, ассоциированный с транскрипцией (Nouspikel Т., 2007). Учитывая эти процессы, можно полагать, что большая часть генома терминально дифференцированных клеток (в том числе и клеток сетчатки) является некритичной для выполнения специфических функций этих клеток. И поэтому репарацией ДНК в этой части генома клетка может, в какой-то степени, пренебречь. В результате в ней могут накапливаться спонтанные повреждения ДНК без очевидных цитотоксических последствий. Возникновение спонтанных повреждений ядерной ДНК в клетках сетчатки глаза свидетельствует о толерантности клеток к генотоксическому стрессу.
Таким образом, полученные результаты указывают на то, что одной из причин толерантности постмитотических клеток сетчатки к повреждениям ДНК (как и для делящихся клеток) является репарация этих повреждений. Другой причиной их толерантности может быть уменьшение физического размера радиочувствительной мишени до размеров транскрибируемого локуса генома. Можно предположить, что решающая роль в трансформации полученных повреждений ДНК в клетках сетчатки глаза в цитотоксический эффект принадлежит молекулам топоизомеразы 2 (topo 2), локализованным в транскрибируемых сайтах (это относится к разрывам ДНК после облучения, а после воздействия МНМ — к модифицированным основаниям и АП-сайтам).
Известно, что регуляция генной экспрессии осуществляется путем структурной перестройки (remodeling) хроматина с формированием петель (Kouzarides Т., 2007; Kadauke S. and Blobel G.A. 2009). Важную роль в этом играет топоизомераза 2, входящая в состав комплекса, осуществляющего remodeling (Varga-Weisz P.D. et al., 1997; Kuniaki Sano K. et al, 2008). Topo 2 локализована в транскрибируемой области генома, где она модифицирует топологию ДНК. При этом она временно надрезает двунитевую ДНК и в последующем лигирует этот разрыв, благодаря своей эндонуклеазной и лигазной активности (Champoux J.J., 2001). Активация эндонуклеазной функции topo 2 может осуществляться индуцированным внешним воздействием, например при применении противоопухолевых препаратов (Sabourin М. and Osheroff N., 2000), или при спонтанно возникающих повреждений ДНК (Liu L. and Gerson S.L., 2004). В результате в транскрибируемых локусах генома формируются нерепарируемые двунитевые разрывы, приводящие к образованию высокомолекулярных (300-0,5 Mb) фрагментов двунитевой ДНК (Taverna P. et al., 2001), которые являются ранним маркером апоптотической деградации генома (Tronov V.A. et al., 1999). Подтверждением данного эффекта могут служить данные, полученные рядом исследователей (Fishel M.L. et al., 2007). Ими показано, что для инициации формирования нерепарируемых двунитевых разрывов ДНК необходимо образование повреждения ДНК в той области, которая перекрывается эндонуклеазной активностью topo 2. В остальных случаях повреждение может быть отрепарировано и не приведет к цитотоксической реакции сетчатки глаза. Такой механизм может объяснить наличие генотоксического порога и вклада репарации в его формирование, а также, в конечном счете, сам процесс трансформации/трансляции полученных повреждений ДНК в цитотоксический эффект для постмитотических клеток сетчатки глаза мышей.