Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Действие ионизирующего излучения на растения 26
1.1 Ионизирующее излучение как стрессовый фактор 26
1.2 Активные формы кислорода и их роль в трансдукции стрессового сигнала 50
Глава 2. Материалы и методы исследования 70
2.1 Объекты исследования 70
2.2 Характеристики экспериментальных участков в зоне аварии на Чернобыльской АЭС 72
2.3 Облучение и проращивание семян H. vulgare 81
2.4 Анализ изоферментного полиморфизма в популяциях P. sylvestris 83
2.5 Анализ полиморфизма длины амплифицированных фрагментов в популяциях P. sylvestris 2.6 Анализ содержания низкомолекулярных антиоксидантов и малонового диальдегида 97
2.7 Анализ активности ферментов 102
2.8 Анализ концентраций фитогормонов в проростках облучённых семян H. vulgare 107
2.9 Анализ уровня полногеномного метилирования хвои P. sylvestris 110
2.10 Анализ транскриптома хвои P. sylvestris методом высокопроизводительного секвенирования РНК 113
2.11 Анализ транскриптома зародышей H. vulgare методом ДНК-микрочипов 119
2.12 Анализ концентраций пероксида водорода в проростках H. vulgare 124
2.13 Изучение метаболома проростков облучённых семян H. vulgare 125
Глава 3. Особенности техногенного загрязнения экспериментальных участков в зоне Чернобыльской аварии 128
3.1 Химические свойства почв экспериментальных участков 128
3.2 Загрязнение почв экспериментальных участков тяжёлыми металлами 128
3.3 Содержание радионуклидов в почве и биологическом материале 130
3.4 Оценка годовых поглощённых доз в кронах P. sylvestris 132
Глава 4. Мутагенез и генетическая структура популяций P. sylvestris из зоны аварии на ЧАЭС 137
4.1 Анализ изоферментного полиморфизма метаболических и антиоксидантных ферментов 138
4.2 Исследование генетической структуры методом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов 143
Глава 5. Биохимические особенности ответа P. sylvestris на хроническое облучение 149
5.1 Анализ активности ферментов в эндоспермах семян 149
5.2 Анализ концентраций низкомолекулярных антиоксидантов и малонового диальдегида в хвое 152
Глава 6. Эпигенетические изменения и контроль активности транспозонов в геномах хронически облучаемых деревьев P. Sylvestris 156
6.1 Оценка уровня метилирования генома P. sylvestris в образцах хвои 156
6.2 Изучение активности транспозонов в геномах хронически облучаемых деревьев P. sylvestris 159
Глава 7. Дифференциальная экспрессия генов и анализ однонуклеотидных полиморфизмов в хронически облучаемых популяциях P. sylvestris 162
7.1 Сборка транскриптома de novo и кластерный анализ 162
7.2 Дифференциальная экспрессия генов в хронически облучаемых популяциях P. sylvestris 164
7.3 Однонуклеотидные полиморфизмы в условиях облучения 176
Глава 8. Биохимические изменения в проростках H. vulgare, индуцированные облучением семян 180
8.1 Активность ферментов в проростках облучённых семян 180
8.2 Анализ концентраций фитогормонов в проростках облучённых семян 188
8.3 Анализ концентраций пероксида водорода в проростках облучённых семян 202
Глава 9. Профиль экспрессии генов в зародышах облучённых семян H. vulgare 206
9.1 Морфологический анализ облучённых растений 206
9.2 Дифференциальная экспрессия генов и анализ функционального обогащения 208
Глава 10. Анализ метаболома проростков облучённых семян H. vulgare 239
10.1 Фенотип растений, использованных для метаболомного анализа 239
10.2 Общие метаболические изменения в тканях облучённых растений 241
10.3 Изменения метаболизма азота в проростках ячменя после низкодозового облучения семян 245
10.4 Метаболиты стрессового ответа 247
Заключение. Концептуальная схема развития адаптивных реакций растений при действии ионизирующего излучения в низких дозах 251
Выводы 258
Список сокращений и условных обозначений 260
Список использованной литературы 264
- Ионизирующее излучение как стрессовый фактор
- Оценка годовых поглощённых доз в кронах P. sylvestris
- Дифференциальная экспрессия генов в хронически облучаемых популяциях P. sylvestris
- Метаболиты стрессового ответа
Ионизирующее излучение как стрессовый фактор
Стресс у растений представляет собой состояние, при котором под действием внешнего фактора на организм сначала происходит дестабилизация функционального состояния, затем его нормализация и итоговое повышение сопротивляемости. Если интенсивность стрессового воздействия превышает пределы устойчивости и адаптивную способность растения, это может привести к серьёзным повреждениям и к гибели организма (Колупаев, Карпец, 2010).
Любые воздействия, изменяющие гомеостаз, влияющие на метаболизм растений, их рост или развитие могут рассматриваться в качестве стрессовых факторов. Таким образом, стрессовые факторы могут иметь как естественную, так и антропогенную природу. При оценке последствий стрессовых воздействий учитывают кратковременный (неспецифический) стрессовый ответ, развивающийся в течение короткого промежутка времени после воздействия, и долгосрочный ответ на стрессовое воздействие. Действию стрессов низкой интенсивности необходимо уделять особое внимание, поскольку оно может быть частично компенсировано акклиматизацией, адаптацией и механизмами репарации. В свою очередь, сильное стрессовое воздействие или хронический стресс обусловливают значительные повреждения, которые могут привести к смерти организма (Lichtenthaler, 1996).
Большинство стрессовых реакций относят к неспецифическим, поскольку они мало зависят от природы стрессора. Однако характер стрессового ответа, обеспечивающего долговременную адаптацию к действию стрессора, часто зависит от типа неблагоприятного фактора. К неспецифическим относятся следующие реакции (цит. по Колупаев, Карпец, 2010):
снижение общей интенсивности синтетических процессов;
повышение активности гидролитических ферментов, обусловливающее усиление катаболизма биополимеров;
появление физиологически активных (сигнальных) продуктов катаболизма;
усиление образования активных форм кислорода и активация перекисного окисления липидов;
повышение проницаемости и деполяризация мембран;
выход ионов Са2+ в цитозоль;
закисление цитоплазмы;
выход ионов K+ из клетки;
активация синтеза гормонов стресса и гормоноподобных соединений – этилена, абсцизовой кислоты, жасмоновой и салициловой кислот;
синтез стрессовых белков;
торможение деления и роста клеток и пр.
Большинство из перечисленных неспецифических реакций характерны и для случаев воздействия на растения ионизирующим излучением, однако существенно меньше информации доступно в научной литературе о специфических адаптивных реакциях растений, позволяющих им приспосабливаться к долговременному действию ИИ. Развитие адаптивных реакций в ответ на ИИ связано с молекулярными особенностями действия этого стрессора на клетку.
Ионизирующее излучение может вызывать эффекты на разных уровнях организации растений – от молекулярно-клеточного до экосистемного. Известно, что ионизирующее излучение может индуцировать мутации в ДНК (Ward, 1995), при этом в основе радиационного мутагенеза лежат повреждения ДНК, вызванные как прямым, так и косвенным действием излучения. Мутагенное действие ИИ играет важную роль в развитии радиобиологических эффектов на более высоких уровнях биологической организации. Другой чувствительной мишенью к действию радиации являются клеточные мембраны. Облучение может приводить к их деструктивным изменениям, ингибированию мембраносвязанных ферментов, нарушению проницаемости мембран и активного транспорта веществ через них, изменению ионных градиентов в клетке, нарушению синтеза АТФ (De Micco et al., 2011). В конечном итоге, облучение сказывается и на многих физиологических процессах: ускоряется либо тормозится ход онтогенеза, что приводит к изменению темпов формообразования; нарушаются процессы дыхания, фотосинтеза, наблюдаются метаболические изменения (Гродзинский, 1989). Крайним проявлением радиобиологической реакции является гибель растений.
Качество и доза ионизирующего излучения влияют на конечный радиобиологический эффект, который может заключаться в поражении отдельных структур и функций организма, формировании уродств и аномалий развития, угнетении роста и размножения, а также приводить к гибели организма. Общей закономерностью считается снижение степени проявления радиобиологического эффекта по мере снижения дозы. Однако в области низких доз монотонный характер зависимости доза-эффект изменяется (Гераськин, 1995), что связано с качественным различием в биологическом действии высоких и низких доз ИИ. Более того, в области низких доз может наблюдаться не ингибирование физиологических процессов, а их стимуляция (Calabrese, Blain, 2009). Наблюдаемые в области низких доз эффекты облучения, по-видимому, можно отнести к адаптивным реакциям растений на действие стрессового фактора низкой интенсивности (Calabrese, Mattson, 2011).
Выделяют (Кудряшов, 2004) несколько стадий взаимодействия ИИ с веществом:
1. физико-химическая стадия – прямое или косвенное действие излучения на молекулы-мишени (10-18 - 10-11 с);
2. биохимическая стадия – воздействие на основные структурные компоненты клеток с последующим изменением метаболизма (10-6 – 10-3 с);
3. биологическая стадия – формирование генетических и соматических эффектов облучения (секунды – годы).
Развитие радиобиологического эффекта во времени связано с особенностями протекания физико-химической и биохимической стадий. Особую роль при возникновении радиационных повреждений играет процесс радиолиза воды – разложения молекулы воды под действием ионизирующего излучения с образованием свободных радикалов (Riley, 1994). При радиолизе воды происходят сдвиг кислотно-основного равновесия и изменения в окислительно-восстановительных процессах, приводящие к нарушениям метаболизма. Продукты радиолиза активно вступают в реакции с нуклеиновыми кислотами, белками и мембранами, запуская каскад биохимических реакций и постепенно приводя к разрушению клеточных мембран и накоплению повреждений в геноме, что ведёт к нарушениям отдельных функций или систем организма. Таким образом, прямое действие излучения связано с непосредственным взаимодействием кванта энергии или частицы с биологическими макромолекулами и мембранами, а косвенное действие опосредуется цепочкой окислительных реакций и образованием активных форм кислорода.
Существуют принципиальные различия в биологических последствиях действия высоких и низких (малых) доз излучения. В литературе существует несколько определений понятия «малая доза излучения». С позиций микродозиметрии малой называется такая доза, при облучении которой в критической мишени (чаще всего имеется в виду ядро клетки) возникает в среднем не более одного радиационного события (Цыб и др., 2005). Малой дозой ионизирующего излучения для человека считается доза, не превышающая 100 мГр, а малой мощностью дозы – менее 5 мГр/ч (Wakeford, Tawn, 2010).
Оценка годовых поглощённых доз в кронах P. sylvestris
Результаты расчёта мощности поглощённой дозы в генеративных органах P. sylvestris, формируемой - и -излучением в 2008-2016 гг., с учётом вклада 238-241Pu и 241Am в поглощённую дозу, а также суммарная мощность дозы, формируемая -, - и -излучениями, приведены в Таблице 3.5.
На участках Кул и Мас (Республика Беларусь) зафиксированы наибольшие диапазоны годовых поглощённых доз (45.8 – 85.3) мГр и (59.7 – 97.5) мГр. Существенный вклад в суммарную поглощённую дозу на этих участках внесло -излучение. Однако на участке Кул основной вклад в формирование поглощённой дозы вносит -излучение (до 63.3 мГр), причём среди всех изучаемых участков этот вклад был максимален (Таблица 3.5).
На самых загрязнённых участках Брянской области (ЗП и ЗК) диапазон мощности годовой поглощённой дозы составил (29.5 – 44.9) и (32.3 – 50.1) мГр/год, соответственно, при этом максимальный вклад в суммарную дозовую нагрузку вносило -излучение (Таблица 3.5).
Основной вклад в формирование поглощённой дозы практически на всех исследуемых участках вносил 137Cs, содержащийся в лесной подстилке и верхнем 0-5 сантиметровом почвенном слое. Максимальный вклад -излучения, зависящий от удельной активности 90Sr в шишках, зафиксирован на участке Масаны (Мас), как и максимальный вклад -излучения.
Возможный вклад в модификацию биологических эффектов поллютантов могут вносить погодные условия, в том числе солнечное УФ-излучение, вызывающее повреждения ДНК и синергически взаимодействующее с ИИ (Martignoni, Smith, 1973). В связи с этим следует отметить, что заложенные на радиоактивно загрязнённых территориях экспериментальные площадки характеризуются довольно равномерными погодными условиями (Гераськин и др., 2015).
Дифференциальная экспрессия генов в хронически облучаемых популяциях P. sylvestris
Сравнение популяций Мас, Кул и ЗК с контрольной популяцией К1 выявило 225, 278 и 69 дифференциально экспрессирующихся генов, соответственно (p 0.001; log2FC 1). В Приложении В приведены основные функциональные группы ДЭГ и их краткое описание. На Рисунке 7.2 отражено количество ДЭГ с повышенной и пониженной экспрессией, общих для трёх популяций с загрязнённых участков.
Транскрипт, кодирующий белок с F-box доменом PP2-B11 (P2B11_ARATH), характеризующийся пониженной экспрессией (Таблице 7.2), контролирует ответ растений на АБК (Cheng et al., 2017). Согласно литературным данным, среди генов, представленных в Таблице 7.2, только ген анионного канала S-типа (SLAC1_ARATH) также отвечает на острое облучение, характеризуясь повышенной экспрессией после острого облучения A. thaliana (Приложение Г). В целом, всего несколько ДЭГ, выявленных в транскриптомах хронически облучаемых деревьев, также отвечают изменениями экспрессии и на острое радиационное воздействие (Приложение Г). Большинство ДЭГ, реагирующих и на хроническое, и на острое облучение, характеризуются антагонистическим паттерном экспрессии (Приложение Г).
Популяция ЗК произрастает в наиболее загрязнённых районах Брянской области, где уровень -излучения эквивалентен уровню -излучения в популяции Мас из зоны отчуждения ЧАЭС (Таблица 3.5). Однако в популяции ЗК было обнаружено небольшое количество ДЭГ (Рисунок 7.2, Приложение В). Вероятно, для индукции постоянного транскрипционного ответа на хроническое радиационное воздействие, который наблюдается в популяциях Мас и Кул, необходим определённый дозовый порог. Другим возможным объяснением существенного количества ДЭГ в популяциях зоны отчуждения служит присутствие в окружающей среде -излучающих радионуклидов, а также относительно большой активности -излучателей 90Sr и его дочернего радионуклида 90Y.
Для функциональной оценки ДЭГ их классифицировали по терминам Генной Онтологии и провели анализ функционального обогащения для каждой популяции (Рисунки 7.3 и 7.4).
Выявлено, что общий ответ деревьев P. sylvestris на хроническое облучение связан с контролем клеточного гомеостаза. В отличие от транскриптомных профилей растений, характерных для ответа на острое облучение или острый окислительный стресс, профиль экспрессии генов в представленных данных не был непосредственно связан с элиминацией АФК в ферментных реакциях, что подтверждается и ранее проведённым анализом активности антиоксидантных ферментов в эндоспермах облучённых деревьев (Раздел 5.1). Принимая во внимание сигнальную роль АФК, долговременное снижение концентрации этих молекул может приводить к подавлению роста и развития растений. Данные указывают на то, что для снижения степени окислительных повреждений мембран и макромолекул облучённые растения модулируют процессы, связанные с генерацией АФК, и контролируют ионный гомеостаз, а также активируют антиоксидантную систему, синтез гистонов и белков теплового шока (Рисунки 7.3 и 7.4).
На участке ЗК не выявлено обогащения по определённым терминам GO; при этом на участках Мас и Кул выявлены три схожие тенденции среди ДЭГ с повышенной экспрессией: ответ мембранных органелл клетки, регуляция сборки нуклеосомы и контроль светочувствительных процессов (например, фотосинтеза) (Рисунок 7.3). Процессы, связанные с поглощением света в фотосистемах, сопровождаются производством АФК. Обогащение по терминам GO, связанным с АФК, наблюдается в популяции Кул, в том числе ответ на пероксид водорода и его трансмембранный транспорт (Рисунок 7.3, А). В популяции Мас преобладают процессы, связанные с элиминацией АФК (Рисунок 7.3, В, Duarte et al., 2019), такие как оксалоацетатдекарбоксилазная активность, связанная с конверсией оксалоацетата в пируват, элиминирующий АФК (Kadna et al., 2015). Малатдегидрогеназа конвертирует оксалоацетат в малат и играет роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза клеток (Scheibe et al., 2005). Ещё один паттерн ответа в популяции Кул связан с контролем метаболизма белков, имеющих железосерные кластеры (Рисунок 7.3, В, Duarte et al., 2019) и играющих центральную роль в фотосинтезе, стабильности генома, переносе электронов и окислительно-восстановительных реакциях в клетке (Zhang, 2015).
Для ДЭГ с пониженной экспрессией обнаружили большее количество обогащённых терминов GO, общих для обоих участков (Рисунок 7.4). Эти термины связаны с ионным гомеостазом и ионным транспортом, а также с регуляцией транскрипции, киназной активностью, с ответами на АФК, кадмий, озон, углекислый газ и фитогормоны (например, ауксины и АБК), с регуляцией водного гомеостаза и движениями устьиц (Рисунок 7.4). Учитывая, что хроническое радиационное воздействие может изменять баланс АФК в клетке (Einor et al., 2016), контроль газообмена через устьица может регулировать интенсивность процесса фотосинтеза как одного из главных источников АФК. Воздействие кадмия также приводит к генерации АФК в клетках растений (Gill, Tuteja, 2010), поэтому обогащение по генам, связанным с ответом на кадмиевый стресс, может указывать на схожий характер стрессового ответа.
Для определения специфического профиля транскриптомного ответа на хроническое радиационное воздействие особенное внимание уделили анализу тех молекулярных процессов, которые характеризовались общими транскрипционными изменениями для двух наиболее загрязнённых участков Мас и Кул.
Метаболиты стрессового ответа
Одна из гипотез о фундаментальных основах эффекта гормезиса постулирует, что умеренный (но не нулевой) уровень стрессовых воздействий необходим для оптимального функционирования организма (Agathokleous et al., 2019). Концентрации АФК, немного превышающие физиологический уровень, могут увеличить биологическую пластичность (Agathokleous et al., 2019). В Разделе 8.3 было показано увеличение концентраций пероксида водорода в тканях проростков облучённых семян ячменя. Это увеличение уровней АФК может являться одной из причин стимуляции роста, на что также указывает изменение концентраций метаболитов стрессового ответа. Так, метаболомный анализ выявил увеличение концентраций мио-инозитола в побегах облучённых растений (Таблица 10.1). Отрицательная корреляция между отношением корня к побегу по длине и содержанием данного соединения в побегах (Таблица 10.2) указывает на увеличенные линейные размеры побега при накоплении мио-инозитола. Галактинол и олигосахариды из семейства раффинозы являются метаболитами мио-инозитола и известны как антиоксиданты и сигнальные молекулы (Valluru, Wan den Ende, 2011). Известно, что галактинол ингибирует прорастание семян (de Souza et al., 2016; Jang et al., 2018), поэтому пониженные концентрации галактинола в корнях (Таблица 10.1, Рисунок 10.2) могут отражать его роль в ускоренном развитии проростков облучённых семян. Пониженные концентрации галактинола в корнях также коррелируют с увеличением массы корней (Таблица 10.2).
Концентрации -аланина, также связанного с ответом на стресс, были существенно снижены как в корнях, так и в побегах растений, облучённых стимулирующими дозами (Рисунок 10.2). Содержание этого метаболита в корнях отрицательно коррелировало с длиной побегов и положительно – с отношением корня к побегу (Таблица 10.2). Выделяют несколько функций -аланина, уникальных для растений. Так, он аккумулируется в качестве компонента общего ответа на стресс и связан с защитой растений от экстремальных температур, гипоксии, засухи, воздействия тяжёлых металлов и некоторых биотических стрессоров (Parthasarathy et al., 2019). Косвенно -аланин выступает в качестве предшественника пантотената и коэнзима А, которые вовлечены во множество метаболических процессов (Parthasarathy et al., 2019). Таким образом, низкие концентрации -аланина могут указывать на использование этого соединения в качестве доступного источника коэнзима А, необходимого для работы цикла Кребса.
Длина корня коррелирует со снижением концентраций ликсоната и аскорбата в побегах (Таблица 10.2), что указывает на роль катаболизма аскорбиновой кислоты в морфологических изменениях, наблюдаемых после облучения. Интересно отметить, что повышенные концентрации аскорбата в корнях при дозе 15 Гр сопровождались пониженными концентрациями в побегах (Рисунок 10.2). В целом, скорость восстановления аскорбата из дегидроаскорбата в корнях облучённых растений, по-видимому, превышает контрольную, а в побегах деградация аскорбата становится необратимой через образование L-ликсоната и треоната (Рисунок 10.2, Truffault et al., 2017).
Концентрации дегидроаскорбата в корнях отрицательно коррелируют с массой и длиной побегов (Таблица 10.2) и в целом понижены в корнях после облучения в стимулирующих дозах (Рисунок 10.2). Несмотря на пробелы в расшифровке путей катаболизма аскорбата, было показано, что скорость деградации аскорбата часто положительно коррелирует с ростом клеток растяжением (Truffault et al., 2017). В компетентных клетках зародышевых корешков высокие уровни аскорбата запускают быстрый переход через контрольную точку фазы G1/S (Ortiz-Espn et al., 2017). Изменения в окислительно восстановительном состоянии аскорбата (отношение аскорбата к дегидроаскорбату) наблюдали в процессе клеточного деления (отношение 6-10) и элонгации (отношение 1-3), что указывает на преобладание восстановленной формы аскорбата в процессе деления клетки (Ortiz-Espn et al., 2017). Эти данные хорошо согласуются с предыдущими исследованиями, которые показали 249 отсутствие индукции клеточной пролиферации после облучения в стимулирующих дозах (Волкова и др., 2019). Таким образом, сниженные концентрации дегидроаскорбата в корнях (и, следовательно, более восстановленное состояние аскорбатной системы) могут приводить к удлинению побегов за счёт поддержания подходящих условий для роста клеток растяжением (Рисунок 10.1, Таблица 10.1). Увеличение концентраций аскорбата в корнях облучённых растений хорошо согласуется с данными о снижении концентраций пероксида водорода в корнях на той же стадии развития (Раздел 8.3).
Уровень L-серина в побегах значительно повышается после облучения семян в стимулирующей дозе 15 Гр (Рисунок 10.2). Возможная роль этой аминокислоты в стимулирующем эффекте, наиболее выраженном при облучении в дозе 15 Гр (Рисунок 10.1), может быть связана с её важной ролью в росте и развитии растений. L-серин участвует в биосинтезе нескольких молекул, необходимых для пролиферации клеток, и играет ключевую роль в метаболизме монокарбоновых соединений и в передаче внутриклеточных сигналов, являясь одной из трёх аминокислот, фосфорилируемых киназами (Ros et al., 2014). Есть сведения о накоплении серина в условиях низких температур и повышенной солёности (Ros et al., 2014).
Концентрации глицерата также снижены в корнях облучённых растений (Рисунок 10.2), что может отражать ингибирование фотосинтеза (Раздел 9.2.4): понижение интенсивности фотодыхания приводит к снижению концентраций глицерата (Voss et al., 2012). Снижение концентраций малата и пирувата в корнях коррелирует с увеличением массы корней и побегов (Таблица 10.2). Пируват и малат являются продуктами ассимиляции в условиях активного фотосинтеза (Dinakar et al., 2010), при этом их концентрации в листьях значимо не изменились после облучения в низких дозах и выращивания растений в темноте. Снижение концентраций этих ключевых метаболитов в корнях может быть связано с успешным и своевременным перераспределением запасных веществ эндосперма, что приводит к ускорению метаболизма облучённых растений и, в конце концов, к морфологической стимуляции.
Изменения в концентрациях глицерата, пирувата и малата, а также недостаток макроэргов могут приводить к снижению уровня глицерол-3-фосфата и последующему снижению концентраций пипеколата в корнях (Рисунок 10.2). Пипеколовая кислота является осмопротектором и играет важную роль в индукции системного ответа растений на биотический стресс (Wang et al., 2018). Следует отметить, что облучение в ингибирующей дозе 100 Гр привело к резкому увеличению концентраций пипеколата в побегах (Рисунок 10.2).