Введение к работе
Актуальность темы исследования. Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) – заболевание, характеризующееся ограничением скорости воздушного потока (ОФВ1), которое обычно прогрессирует и связанно с хроническим воспалением в респираторном тракте в ответ на действие патогенных частиц и газов (GOLD, 2014).
Среди различных поллютантов, оказывающих повреждающее воздействие на респираторный тракт и приводящих к развитию персистирующего воспаления дыхательных путей при ХОБЛ, одно из первых мест занимают бактерии и вирусы. В то же время хроническое бронхолегочное воспаление и ограничение скорости воздушного потока создают условия для контаминации дыхательных путей условно-патогенной и патогенной флорой и изменения состава респираторной микробиоты [Чучалин А. Г. и др., 2014; Criner G. J. et al., 2015; Авдеев С. Н., 2016].
В мире уже опубликованы первые данные, подтверждающие важную роль
микробиоты респираторного тракта в развитии ХОБЛ. [Charlson E. S. et al. 2011;
Cabrera-Rubio R. et al., 2012]. M. Hilty с коллегами (2010) и D. C. Chambers с
коллегами (2014) продемонстрировали, что бактериальный состав микробиоты
респираторного тракта у пациентов с ХОБЛ значимо отличается от бактериального
пейзажа дыхательных путей здоровых лиц. Однако ни одно из опубликованных
исследований не приводит клинические ассоциации вариабельности состава
орофарингеальной микробиоты с фенотипом ХОБЛ. Полученные в ходе
проведенных исследований данные не позволяют объяснить механизм и причины
изменений, происходящих в количественном и качественном составе респираторной
микробиоты, связанные с формированием того или иного клинико-
функционального фенотипа ХОБЛ, что необходимо для оценки прогноза течения заболевания и назначения адекватных схем его лечения [Sze M. A. et al., 2014; Авдеев С. Н., 2016].
По данным проведенного нами метаанализа, в настоящее время отсутствуют общепризнанные комплексные прогностические критерии течения ХОБЛ [Agusti А. et al., 2014; Авдеев С. Н., 2016]. Вариабельность микробиоты дыхательных путей
могла бы стать одним из важных критериев, определяющих клинико-функциональные особенности течения и характер прогрессирования ХОБЛ [Hana Yi et al., 2014; Sethi S. et al., 2014].
Таким образом, орофарингеальная микробиота, являясь одним из наиболее
доступных, но недостаточно глубоко и системно проанализированных при ХОБЛ
микробиотических сообществ, представляет собой оптимальную модель
исследования для понимания влияния вариабельности орофарингеальной микробиоты на формирование различных фенотипов заболевания и разработки новых индивидуальных схем лечения этих пациентов.
Степень разработанности темы. Результаты генетических исследований состава респираторной микробиоты больных ХОБЛ, опубликованные в настоящее время, демонстрируют сравнительные особенности бактериального состава микробиоты дыхательных путей и орофарингеальной области здоровых людей и пациентов с ХОБЛ, более значимые при тяжелом течении заболевания [Hana Yi et al., 2014; Sethi S. et al., 2014; Sze M. A. et al., 2014].
Несмотря на новые данные, полученные в ходе исследований микробиоты дыхательных путей с применением молекулярно-генетической идентификации микроорганизмов при различных бронхолегочных заболеваниях (бронхиальная астма, ХОБЛ, муковисцидоз, идиопатический легочный фиброз) [Huang Y. J. et al., 2011; Willner D. et al., 2012; Molyneaux P. L. et al., 2014; Park H. et al., 2014], остаются вопросы о взаимосвязи вариабельности респираторной микробиоты с особенностями течения ХОБЛ, включая частоту обострений, наличие коморбидной патологии и динамику течения болезни. Только недавно появились новые методы мокулярно-генетических исследований, основанные на генетической идентификации микроорганизмов, в том числе секвенировании консервативных участков бактериальных генов 16S pPHK. Появление этих методик изменило представления о составе респираторного микробиома [The Human Microbiome Project, 2007]. Так, оказалось, что бронхиальное дерево от орофарингеальной области до альвеол колонизировано бактериями, качественный и количественный состав которых изменяется при заболеваниях органов дыхания [Charlson E. S. et al., 2011;
D. C. et al., 2014; Wang Z. et al., 2016]. Однако роль вариабельности респираторной (орофарингеальной) микробиоты в развитии бронхолегочной патологии окончательно не ясна, системное представление о закономерностях его бактериального состава у пациентов с различными фенотипами ХОБЛ отсутствует D. C. et al., 2014; Hana Yi et al., 2014].
Цель исследования. Установить состав орофарингеальной микробиоты при стабильном течении ХОБЛ и определить его особенности при разных фенотипах болезни, ассоциированных с прогнозом течения.
Задачи исследования:
-
Установить особенности качественного и количественного состава орофарингеальной микробиоты у больных ХОБЛ в стабильный период с учетом тяжести заболевания и наличия коморбидной патологии.
-
Охарактеризовать прогностическое значение особенностей таксономического состава орофарингеальной микробиоты у пациентов с ХОБЛ в отношении динамики течения заболевания и выраженности отдельных клинических симптомов.
-
Идентифицировать микробиологические орофарингеальные паттерны у больных ХОБЛ с фенотипами «эмфизема», «хронический бронхит» и «смешанный» в стабильный период заболевания.
-
Выявить особенности состава орофарингеальной микробиоты в зависимости от сопутствующей патологии, предрасполагающей к формированию определенного источника микроаспирации в группах с различными фенотипами ХОБЛ.
5. Охарактеризовать вклад гастроэзофагеальной рефлюксной болезни (ГЭРБ)
и хронической инфекционной патологии верхних дыхательных путей, как
потенциальных источников бактериальной микроаспирации, в формирование
клинико-функциональных фенотипов ХОБЛ.
Научная новизна. Впервые в результате научно-исследовательской работы, сочетающей молекулярно-генетический и биоинформационный анализы состава орофарингеальной микробиоты у больных ХОБЛ с расширенной клинико-анамнестической и функциональной характеристикой получены данные о представленности таксонов в орофарингеальной микробиоте, которые были
сопоставлены с клинико-функциональными особенностями заболевания, данными анамнеза (включая частоту обострений, характер проводимой терапии, наличие коморбидной патологии), после чего выполнено сравнение с клиническими параметрами у групп с различной динамикой заболевания.
Новыми являются данные о том, что орофарингеальная микробиота больных ХОБЛ с различными фенотипами сохраняет относительную стабильность состава по высокопредставленным таксонам, демонстрируя при этом ряд существенных различий в отношении низкопредставленных.
Приоритетными являются данные, демонстрирующие, что вариабельность
состава орофарингеальной микробиоты взаимосвязана не только с тяжестью ХОБЛ,
но и с его клиническим фенотипом. Впервые установлены три микробиологических
орофарингеальных паттерна, соответствующих определенному фенотипу
заболевания. Первый микробиологический паттерн, характеризующийся высокой
представленностью орофарингеальной клинически значимой условно-патогенной
флоры (роды Leptotrichia, Prevotella, Bulleidia, Veillonela) и кластером бактерий
(Fusobacterium + Prevotella + Mycoplasma + Bulleidia), участвующих в формировании
гнойно-воспалительных процессов в носоглотке и ротовой полости, ассоциирован
с фенотипом «хронический бронхит». Второй паттерн, характеризующийся высокой
представленностью желудочно-кишечных бактерий (виды Ruminococcus bromii,
Bacteroides fragilis) и наличием бактериального кластера (тип Firmicutes и роды
Actinobacteria + Enterococcus) – с фенотипом «эмфизема». Третий
микробиологический паттерн, характеризующийся высоким содержанием в
орофарингеальных мазках бактерий – представителей желудочно-кишечной
микробиоты (роды Paraprevotella. Leuconostoc, Enterococcus), клинически значимой
условно-патогенной орофарингеальной флоры (бактериальный кластер:
Porphyromonas + Prevotella + Streptococcus minor) и низким видовым бактериальным разнообразием, характерен для пациентов со «смешанным» фенотипом.
Результаты данного исследования впервые продемонстрировали, что
вариабельность орофарингеальной микробиоты связана с источником
микроаспирации (желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) или носоглотка), приводящей
к замещению нормобиотических микроорганизмов определенными клинически значимыми условно-патогенными бактериями с формированием микробиологических орофарингеальных паттернов.
Впервые показано, что клинико-функциональный фенотип ХОБЛ и соответствующий ему микробиологический паттерн определяют характер и прогноз течения заболевания.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные позволяют с новых научных позиций объяснять и прогнозировать характер и определить механизмы формирования клинико-функциональных особенностей течения ХОБЛ. Так, персистирующее бронхолегочное воспаление, приводящее к ограничению скорости воздушного потока, создает условия для трансформации микробиоты дыхательных путей, а бактерии, попадающие в дыхательные пути при эпизодах микроаспирации, участвуют в формировании новых микробиологических паттернов. Их таксономический состав зависит от источника микроаспирации – ЖКТ или носоглотки. При этом вид источника аспирации определяется клинико-функциональными особенностями течения ХОБЛ. Так, у пациентов с фенотипом «хронический бронхит» источниками являются полость рта и верхние дыхательные пути, у пациентов с фенотипом «эмфизема» – верхние отделы ЖКТ, а у пациентов со «смешанным» фенотипом имеют место оба источника микроаспирации.
Результаты данного исследования позволят привлечь внимание врачей и ученых к проблеме формирования определенных паттернов респираторной микробиоты в зависимости от фенотипов ХОБЛ. Это поможет уже на ранних стадиях заболевания выявлять пациентов с наиболее неблагоприятным, прогрессирующим течением болезни, позволит создавать персонализированные программы ведения болезни, направленные на предотвращение обострений ХОБЛ. Так, у больных с фенотипом «эмфизема» необходимо прицельно выявлять жалобы на наличие у них ГЭРБ и назначать патогенетическую терапию. У пациентов с фенотипом «хронический бронхит» особое внимание следует уделять заболеваниям верхних дыхательных путей и полости рта. При наличии у больных «смешанного» фенотипа ХОБЛ врачу необходимо обратить внимание не только на признаки ГЭРБ,
воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей и полости рта, но также выявить и провести лечение нарушений в системе иммунного ответа с целью своевременного предотвращения тяжелого прогрессирующего течения заболевания, наиболее характерного для данного фенотипа.
Внедрение результатов исследования. Результаты научно-исследовательской
работы включены в учебные программы сертификационных циклов
профессиональной переподготовки и повышения квалификации врачей-терапевтов и пульмонологов. Они могут стать основой для разработки персонифицированных терапевтических схем лечения пациентов с ХОБЛ в период стабильного течения и обострения.
Полученные результаты используются в работе отделений терапии больницы Центросоюза РФ (г. Москва), ГБУЗ «Госпиталь для ветеранов войн №3» Департамента здравоохранения г. Москвы, отделении пульмонологии ФНКЦ специализированных видов медицинской помощи и медицинских технологий ФМБА России (г. Москва). Материалы проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре фтизиатрии и пульмонологии ФГБОУ ВО МГМСУ им. А. И. Евдокимова (г. Москва) для врачей терапевтов и пульмонологов на сертификационных циклах и циклах тематического повышения квалификации, на кафедре госпитальной терапии №2 ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России (г. Москва) для студентов, интернов и ординаторов, на кафедре терапии факультета постдипломного образования БУ «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия» для интернов, ординаторов, для врачей общей практики и терапевтов на сертификационных циклах и на циклах тематического повышения квалификации.
Методология и методы исследования. На базе поликлиники
Минэкономразвития России №2 (г. Москва) и больницы Центросоюза РФ (г. Москва) проведено проспективное неинтервенционное исследование по протоколу, разработанному в соответствии со стандартами «Надлежащей клинической практики». Исследование одобренно локальным комитетом по этике ФГБОУ ВО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова Минздрава России.
В рамках протокола на первом этапе исследования предусмотрены два визита. При первом визите составлена клиническо-анамнестическая характеристика больных, проведена сравнительная оценка клинико-функциональных показателей, осуществлено взятие пробы орофарингеальных мазков для исследования микробиоты. Методом случайной выборки для части больных было выполнено расширенное инструментальное обследование.
Второй визит состоялся через 12 месяцев после первого только для пациентов, которым во время первого визита провели расширенное обследование. Собран анамнез, проведены клинико-функциональное обследование и комплексная оценка динамики заболевания.
На втором этапе диссертационной работы с применением методов 16S рРНК секвенирования проведена генетическая идентификация состава орофарингеального метагенома больных ХОБЛ. Исследование проведено на базе ФГБУН «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины» ФМБА России (г. Москва).
На третьем этапе выполнен сравнительный анализ состава орофарингеального метагенома больных ХОБЛ в зависимости от степени тяжести, клинико-анамнестических данных и фенотипа заболевания.
Положения, выносимые на защиту:
1. Орофарингеальная микробиота больных ХОБЛ вне зависимости от тяжести заболевания сохраняет относительную стабильность качественного состава. Среди бактериальных родов со значением представленности 10% и более в структуре орофарингеальных метагеномов у всех больных ХОБЛ зарегистрированы роды Streptococcus, Prevotella, Veillonella. В орофарингеальной микробиоте пациентов с тяжелым течением ХОБЛ выявляется более высокое содержание клинически значимых условно-патогенных бактерий Prevotella melaninogenica, Neisseria, Haemophilus, Leptotrichia, в сравнении с образцами пациентов с более легким течением (p < 0,05). Особенности состава орофарингеальной микробиоты у больных ХОБЛ ассоциированы с частыми обострениями и выраженностью отдельных клинических симптомов.
-
Фенотипы ХОБЛ – «хронический бронхит», «эмфизема» и «смешанный» – ассоциированы с составом орофарингеальной микробиотой и представлены: при фенотипе «хронический бронхит» – типы Actinobacteria, Bacteroidedetes, Fusobacterium, Proteobacteria и Firmicutes (виды и роды, традиционно рассматривающиеся как возбудители хронических воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей у человека); при фенотипе «эмфизема» – типы Firmicutes, Actinobacteria, Bacteroidetes (виды и роды, качественный и количественный состав представленности которых соответствует таксономическому составу бактерий, выявляемому методом 16S РНК секвенирования в ротоглоте здоровых людей, и представители верхних отделов ЖКТ); при «смешанном» фенотипе – типы Bacteroidedetes, Firmicutes (виды и роды, традиционно рассматривающиеся как возбудители хронических воспалительных заболеваний верхних дыхательных путей у человека, и представители верхних отделов ЖКТ). Изменение состава орофарингеальной микробиоты является значимым фактором прогрессирования заболевания.
-
Характер микроаспирации (ЖКТ или носоглотка) связан с формированием микробиологических паттернов орофарингеальной микробиоты у больных ХОБЛ. Наиболее представленными родами микроорганизмов у больных с фенотипом «эмфизема» являются резидентная флора верхних отделов ЖКТ, выявляемая у здоровых людей; с фенотипом «хронический бронхит» – клинически значимая условно-патогенная флора полости рта и верхних дыхательных путей, традиционно рассматривающаяся как вобудитель хронических инфекционных заболеваний; у пациентов со «смешанным» фенотипом – бактерии желудочно-кишечной и клинически значимой условно-патогенной орофарингеальной микрофлоры.
Степень достоверности и апробация результатов. Высокая степень
достоверности данных, полученных в ходе проведенного исследования,
подтверждается разработанным протоколом клинического исследования,
достаточным объемом клинического и биологического материала, проведением
расширенного клинико-функционального обследования с использованием
современной аппаратуры в ведущих клинико-диагностических центрах,
обеспечением взятия пробы орофарингеальных образцов с соблюдением
утвержденных методик сбора и хранения биологического материала,
использованием омиксных технологий, включающих молекулярно-генетические методы исследования метагенома с применением секвенирования по 16S рРНК для идентификации состава орофарингеальной микробиоты, а также применением современных методов статистического анализа и обработки результатов.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на XXVI Национальном конгрессе по болезням органов дыхания Российского респираторного общества (Москва, 2016), ХI Национальном конгрессе терапевтов (Москва, 2016), XXIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2017), VIII Международной научной конференции SCIENCE4HEALTH (Москва, 2017).
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № НК 13-04-01854 и федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы» (ГК № 14.604.21.0075, уникальный идентификатор RFMEFI60414X0075).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 работ (из них 15 статей в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в том числе 4 полнотекстовых статьи в журналах, входящих в международную базу цитирования Scopus).
Личное участие автора. При непосредственном участии автора проведены
предварительные исследования и проектирование протокола научно-
исследовательской работы. Автор активно участвовал в обследовании больных: проводил исследование функции внешнего дыхания (ФВД) с бронхолитической пробой, осуществлял расшифровку и интерпретацию данных, полученных при проведении бодиплетизмографии, исследовании диффузионной способности легких, выполнении эхокардиографии (ЭХО КГ) и мультиспиральной компьютерной томографии органов грудной клетки (МСКТ ОГК) (с последующей обработкой результатов с использованием программы Pulmo СТ9). Для обеспечения высокой степени достоверности данных работы автор самостоятельно, согласно разработанной методике, забирал орофарингеальные мазки и в течение часа в день
взятия пробы в специальных контейнерах транспортировал их в лабораторию для экстракции ДНК. Автор принимал участие в исследовании биологического материала с дальнейшей статистической обработкой клинико-функциональных параметров и в проведении биоинформационного анализа полученных данных. Автор активно участвовал в обсуждении и публикации результатов проведенного исследования. Таким образом, автор принимал непосредственное участие в проведении научно-исследовательской работы на всех этапах: при проектировании работы, проведении исследования, обсуждении и публикации полученных результатов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 5 глав, заключения, списка сокращений и условных обозначений, списка источников цитируемой литературы. Диссертация представлена на 240 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 24 рисунками и 44 таблицами. Список литературы включает в себя 253 работы, из которых 28 принадлежат отечественным и 225 зарубежным авторам.