Нарушение функции нейтрофилов как один из механизмов формирования воспаления у больных бронхиальной астмой, хронической обструктивной болезнью легких и внебольничной пневмонией Негруца Катрина Владимировна

Введение к работе

Актуальность темы исследования

БА, ХОБЛ, БА в сочетании с ХОБЛ, ВП относятся к числу широко распространенных
заболеваний. Болезни респираторных органов являются глобальной проблемой

здравоохранения и приводят к весьма существенному экономическому и социальному ущербу (Чучалин А.Г., Синопальников А.И., Козлов Р.С. [и др.], 2010; Чучалин А.Г., Авдеев С.Н, Айсанов З.Р. [и др.], 2014; GOLD, 2015; GINA, 2017).

Основным патогенетическим механизмом вышеуказанных заболеваний является воспаление, которое у больных с данными нозологическими формами отличается гетерогенностью как по этиологии, так и патогенезу (Mac Nee W., Tuder R.M., 2009). Воспаление – универсальная, генетически запрограммированная реакция организма (Черешнев В.А., 2002), которая развивается при повреждении и воспалительной реакции эндотелиоцитов, плазменных и клеточных факторов крови (нейтрофилов, системы гемостаза и комплемента), стромальных клеток периваскулярной соединительной ткани (Симонова И.И., Антонюк М.В., Веремчук Л.В. [и др.], 2016).

Нейтрофилы (НФ) обеспечивают и поддерживают гомеостаз организма в целом, и играют первостепенную роль в противоинфекционной защите (Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007; Segal A.W., 2005). Одной из основных причин хронически протекающего воспалительного процесса может быть их дисфункция. Реагируя на различные патогенные факторы, НФ выделяют в окружающую среду активные метаболиты кислорода, протеолитические ферменты, превращаясь, с одной стороны, в действенный инструмент санации очага воспаления, а с другой – в «мощное оружие», приводящее к деструкции собственных тканей.

Негативные влияния НФ, участвующих в патогенезе БА, ХОБЛ и ВП, хорошо известны. Нейтрофильный фенотип БА ассоциируется с выраженной деструкцией тканей, развитием обструкции дыхательных путей, низким ответом на глюкокортикостероиды (ГКС) и, как следствие, тяжелым, труднокурабельным течением заболевания (Геренг Е.А., Суходоло И.В., Огородова Л.М. [и др.], 2009). Одним из проявлений нейтрофильного компонента воспаления при тяжелой астме является повышение эластазной активности. Возможно, именно избытком нейтрофильной эластазы (НЭ) определяются некоторые элементы ремоделирования при тяжелом течении БА. Кроме того, наблюдаемое при тяжелом течении БА снижение эластичности легочной ткани может быть объяснено дисбалансом в системе «оксидант-антиоксидант» и «протеолиз – антипротеолиз», сопровождающимся усилением активности НЭ. Типовая реакция развития дисбаланса в системе «оксидант-антиоксидант» и «протеолиз – антипротеолиз» при БА проявляется также при ХОБЛ и ВП (Mac Nee W., 2001). НЭ является регулятором воспаления, причем в разных ситуациях НЭ может выступать и как провоспалительный, и как противовоспалительный агент. Инактивация НЭ осуществляется преимущественно 1-антитрипсином (ААТ) (Аверьянов А.В., Поливанова А.Э., 2007). Физиологическая роль ААТ состоит в предотвращении повреждения паренхимы легких протеазами и ингибирование их избытка. Защитная реакция антипротеаз направлена на предотвращение пневмофиброза, эмфиземы, ремоделирования бронхов, сосудов, деструкции легочной ткани и на подавление избыточного воспалительного ответа (Агапова Ю.Р., Гулин А.В., 2013).

Помимо нарушений в системе «оксидант-антиоксидант» и «протеолиз – антипротеолиз» при бронхолегочных заболеваниях наблюдается нарушение фагоцитарной активности (ФГЦ). В результате длительного воспалительного процесса происходит истощение функциональной активности фагоцитов. Чем более выражен воспалительный процесс, тем сильнее страдает функциональная активность НФ. Все это приводит к развитию эмфиземы и фиброзированию легких.

Учитывая изложенное выше, необходимо исследование функционального состояния НФ, изучение условий, при которых у больных БА, ХОБЛ и ВП они выступают как «защитники» организма, и в каких ситуациях они оказывают повреждающее действие.

Степень разработанности темы

Многочисленные исследования отечественных и зарубежных ученых свидетельствуют о неотъемлемой роли НФ в обеспечении и поддержании гомеостаза организма, а также в обеспечении противоинфекционной защиты. Широко изучены показатели, характеризующие функциональное состояние НФ, такие как НЭ, ФГЦ, кислородный взрыв (КВЗ) и ААТ. Однако, характеристика этих показателей для больных БА, БА+ХОБЛ, ХОБЛ и ВП, их комплексное исследование требует дальнейшего изучения.

В настоящее время достигнуты значительные результаты в диагностике и выборе терапии таких заболеваний как БА, ХОБЛ и ВП, которые свидетельствуют о многоликости этих заболеваний, особенно БА. Однако, необходимо дальнейшее изучение этой проблемы в разных клинических ситуациях с целью разработки более эффективных методов диагностики и персонализированной терапии. Особенно это касается изучения НЭ, ААТ, ФГЦ, КВЗ и возможности коррекции их измененной функции.

Цель работы

Определить функциональное состояние НФ и их роль в формировании воспаления бронхов и легких у больных БА, ХОБЛ, БА в сочетании с ХОБЛ, ВП для расширения возможностей диагностики этих заболеваний.

Задачи исследования

1. Оценить показатели, характеризующие функциональное состояние НФ у больных БА, ХОБЛ, БА+ХОБЛ, ВП по сравнению со здоровыми.

2. Установить наличие и степень выраженности связей функционального состояния НФ с признаками воспаления на местном уровне (цитограммой спонтанной мокроты, оксидом азота в выдыхаемом воздухе).

3. Оценить взаимосвязь функционального состояния НФ с признаками системного воспаления (СРБ, СОЭ, лейкоцитоз, цитокиновый профиль) и ФВД.

4. Изучить динамику показателей функционального состояния НФ в разные фазы заболевания у обследованных всех групп.

Научная новизна

5. Впервые у больных Б А, ХОБЛ, БА в сочетании с ХОБЛ в фазу обострения заболевания и ВП, а также в динамике на фоне стихания активности воспаления проведен анализ функционального состояния НФ.

6. Впервые изучен комплекс признаков, характеризующих наличие и выраженность местного и системного воспаления у больных БА, ХОБЛ, БА в сочетании с ХОБЛ, ВП, включающий НЭ, ААТ, ФГЦ.

7. Установлены показатели, характеризующие функциональное состояние НФ, позволяющие дифференцировать этапность, характер и выраженность воспаления.

8. На основании полученных данных установлены лабораторные критерии для оценки динамики воспаления на фоне лечения у больных БА, ХОБЛ, БА в сочетании с ХОБЛ, ВП.

Теоретическая и практическая значимость исследования

В настоящей работе изучено функциональное состояние НФ у больных с бронхолегочной патологией (БА, БА+ХОБЛ, ХОБЛ и ВП). Разработаны критерии, позволяющие оценивать в дополнение к клиническим данным этапность, характер и степень выраженности воспалительного процесса у больных БА, БА в сочетании с ХОБЛ, ХОБЛ и ВП, а также для оценки динамики воспаления на фоне терапии.

Теоретический интерес представляют следующие установленные факты, которые требуют дополнительного изучения и объяснения:

Корреляция между НЭ и ААТ.

ФГЦ у больных БА и БА в сочетании с ХОБЛ.

Отсутствие зависимости показателей, связанных с функцией НФ, от клинических признаков аллергии.

Различные роли НФ и ЭОЗ, МФ и НФ на разных этапах воспаления.

Наличие инфекционного (бактериального) воспаления, которое сочетается с ухудшением ФВД, маркируется ААТ у больных БА в сочетании с ХОБЛ и отсутствует у больных БА и ХОБЛ.

Результаты проведенных исследований внедрены в лечебную практику пульмонологического отделения клиники НИИ Ревматологии и Аллергологии ФГБОУ ВО “ПСПбГМУ имени И.П. Павлова” МЗ РФ.

Методология и методы исследования

Выборка пациентов, клиническое и лабораторное обследование больных осуществлялось на базе клиники НИИ Ревматологии и Аллергологии (заведующий кафедрой В.И. Трофимов, д.м.н., профессор) и в отделении лабораторной диагностики ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им. акад.И.П. Павлова (заведующий лабораторией В.Л. Эммануэль, д.м.н., профессор) после получения письменного добровольного согласия на обследование.

Клиническая характеристика обследованных больных

Всего обследовано 217 человек в возрасте от 18 до 85 лет. Сформированы следующие группы исследуемых: 1 группа - больные Б А (78 человек), 2 группа - больные ХОБЛ (38 человек), 3 группа - больные, у которых сочетание Б А и ХОБЛ (39 человек), 4 группа -больные ВП (17 человек). Контрольная группа представлена 2 группами сравнения: больные гипертонической болезнью и ИБС (25 человек в возрасте от 31 до 85 лет) и практически здоровые лица (20 человек в возрасте от 23 до 55 лет). Обследованные контрольных групп не имели в анамнезе аллергических, онкологических заболеваний, заболеваний бронхо-легочной системы, тяжелых форм сахарного диабета, почечной и печеночной недостаточности, а сопутствующие заболевания были в фазе устойчивой ремиссии. Все исследования выполнялись дважды - до лечения в фазу обострения заболевания и после лечения в фазу затихающего обострения. Распределение больных на группы осуществлялось с учетом диагноза и тяжести заболевания БА, ХОБЛ, БА+ХОБЛ, которые устанавливались в соответствии с критериями международных руководств (GINA, GOLD: 2011-2015 гг., испанские критерии 2012).

В исследование было включено 93 мужчины (42,9%) и 124 женщины (57,1%). Возраст обследованных находился в пределах от 18 до 85 лет и в среднем составил 50,5±18,0 лет. В группе БА преобладали пациенты со средней тяжестью течения заболевания (50%), тогда как в группе ХОБЛ заболевания со средней и тяжелой степенью тяжести встречались практически с одинаковой частотой (42,11% и 47,37% соответственно). Отягощенная наследственность по аллергическим заболеваниям была выявлена в 50% случаев в группах БА с легкой и средней тяжестью течения заболевания, а также в группе БА+ХОБЛ. В группе больных ХОБЛ составляла 18,42%, у больных ВП - 6%. У всех больных БА и БА в сочетании с ХОБЛ диагностирован смешанный фенотип заболевания. Распределение по клинико-патогенетическим фенотипам в группах представлено в таблице 1.

Таблица 1 – Распределение по клинико-патогенетическим фенотипам

Методы исследования

У всех обследованных после сбора жалоб, анамнеза заболевания и жизни, полного физикального осмотра, оценивались: клинический анализ крови+СОЭ, с-реактивный белок, уровень НЭ, ААТ сыворотки крови, ФГЦ, КВЗ, цитологическое исследование спонтанной мокроты с подсчетом процентного содержания клеток и определением степени воспаления, цитокиновый профиль: ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИНФ- и ФНО- в сыворотке крови, иммуноглобулины (Ig) E и G к инфекционным антигенам: S. Pneumoniae, N. perflava, H. influenzae, S.aureus, и IgE к неинфекционным антигенам: D. Pteronissinus, домашней пыли, миксту луговых трав, пыльце деревьев, сорных трав, цветов, оксид азота в выдыхаемом воздухе, функция внешнего дыхания.

Определение в сыворотке крови ФГЦ и КВЗ выполнено методом проточной цитометрии. Исследование проводилось на проточном цитометре Cytomics FC500 Beckman Coulter с использованием набора FagoFlowEx Кit фирмы Exbio (Чехия). Для определения уровня НЭ использовался набор Human PMN-Elastase Platinum ELISA фирмы eВioscience (США). Исследование проводилось методом иммуноферментного анализа в соответствии с рекомендациями производителя. Постановка реакций выполнялась методом парных сывороток. Содержание ААТ в сыворотке крови определялось методом кинетической нефелометрии. Исследование проводилось при помощи анализатор Immage 800 с использование набора для определения ААТ фирмы Beckman Coulter (США). Определение цитокинов (ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-17, ИНФ- и ФНО-) в сыворотке крови проводилось методом твердофазного неконкурентного непрямого иммуноферментного анализа с использованием набора Вектор-Бест (Россия). Определение в сыворотке крови IgE и IgG к S. Pneumoniae, N. perflava, H. influenzae, S.aureus, Ig E к D. Pteronissinus, домашней пыли, миксту луговых трав, пыльце деревьев, сорных трав, цветов было выполнено методом твердофазного неконкурентного непрямого иммуноферментного анализа с использованием наборов реагентов Иммунотэкс (Россия).

В ходе цитологического исследования спонтанной мокроты исследовалась собранная в утренние часы мокрота, нативный, окрашенный гематоксилин-эозином препарат. Производился подсчет клеточных элементов в 20 полях, подсчитывалось 200–300 клеток. При составлении цитограммы учитывалось процентное содержание каждого вида клеток: эпителия бронхов, макрофагов и лейкоцитов (нейтрофилы, эозинофилы, лимфоциты, моноциты). Анализ цитологических данных осуществлялся по среднему проценту содержания данной клетки.

Для измерения FeNO использовался портативный газовый анализатор NObreath (Bedfont Scientific Limited, Великобритания), который позволяет определить долю FeNO в единицах ppb (parts per billion – объем газообразного вещества в 109 объема выдыхаемого воздуха). Перед исследованием всем обследованным проводился обучающий дыхательный тренинг, также выполнялось измерение оксида азота в окружающей среде (кабинет). Затем проводилось троекратное определение содержания FeNO с регистрацией максимального результата в индивидуальной карте. Исследование FeNO осуществлялось не ранее, чем через час после последнего приема пищи или жидкости, курения и исследований ФВД. Интерпретация результатов производилась исходя из рекомендаций [122].

Исследование ФВД проводилось в лаборатории физиологии внешнего дыхания на базе клиники НИИ Ревматологии и аллергологии НКИЦ (заведующая лабораторией Ю.Д. Рабик). Оценка параметров ФВД проводилась при помощи спирографии с регистрацией «поток-объем», которая выполнялась на приборе MasterScreen фирмы CareFusion (торговая марка Erich Jaeger, Германия). У всех обследованных регистрация показателей ФВД проводилась в соответствие c кpитepиями ATS/ERS до и после ингaляции caльбутaмoлa/фенотерола для выявлeния нaличия бpoнxooбcтpукции и ee xapaктepa. Спирометрическое исследование проводилось в утренние часы в период с 9:00 до 11:00 утра. При проведении исследования проводилось не менее 5 попыток, из которых обязательно 3 должны были быть воспроизводимыми, с разницей не более 150 мл по ОФВ₁. Нами оценивались следующие

показатели до и после бронхолитика: объем форсированного выдоха за 1 секунду – ОФВ₁, индекс Тиффно – отношение ОФВ₁/ЖЕЛ, пиковая объемная скорость ПОС), мгновенные объёмные скорости потока после выдоха 50 и 75% форсированной жизненной ёмкости лёгких (МОС50, МОС75), средняя объемная скорость потока кривой в интервалах от 25 до 75% (МОС25-75) форсированной жизненной ёмкости лёгких. Величины показателей ФВД выражали в процентах по отношению к должной величине, зависящей от возраста и роста. Для определения степени нарушений ФВД использовали рекомендации, принятые в отделении функциональной диагностики легких клиники НИИ Ревматологии и аллергологии НКИЦ.

Положения, выносимые на защиту

9. При наличии выраженного воспалительного процесса в бронхолегочном аппарате повышены уровни НЭ и ААТ сыворотки крови, преимущественно у больных ХОБЛ и ВП. Особенностью больных БА и БА в сочетании с ХОБЛ является повышение ФГЦ. Достоверных отличий выраженности КВЗ у больных БА, БА в сочетании с ХОБЛ, ХОБЛ и ВП не выявлено.

10. Отсутствуют корреляционные связи показателей, характеризующих функциональное состояние НФ с цитологическими фенотипами мокроты.

11. Корреляционные связи нейтрофилов и макрофагов в мокроте с ОФВ₁ и СОЭ у больных ХОБЛ свидетельствуют об этапности участия этих клеток в воспалительном процессе.

12. Показатели, характеризующие функциональное состояние НФ коррелируют с нарушениями бронхиальной проходимости и скоростными показателями.

13. Воспаление у больных БА в сочетании с ХОБЛ связано с бактериальной инфекцией, маркируется ААТ и наличием обструкции бронхов.

14. Комплексное исследование, включающее процентное содержание НФ в цитограмме мокроты, уровни FeNO и результаты исследования ФВД у больных БА, БА в сочетании с ХОБЛ, ХОБЛ и ВП, может быть использовано для дифференциальной диагностики этих заболеваний и оценки выраженности воспаления бронхолегочного аппарата.

15. Для оценки динамики воспаления можно использовать уровни НФ, ААТ сыворотки крови и FeNO.

Апробация работы

Изложенные в диссертации данные были представлены на II Петербургском форуме оториноларингологов России, 2013 г.; научной конференции молодых ученых «Булатовские чтения» (2013, 2014, 2016, 2017 годах); VIII Национальном Конгрессе терапевтов, 2013 г.; Северо-Западной конференции «Аллергические и воспалительные заболевания верхних и нижних дыхательных путей», 2013 г.; XXIII Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания в г. Казани, 2013 г.; XXIV Национальном Конгрессе по болезням органов дыхания, 2014 г.; Всероссийском межрегиональном Конгрессе «Балтийский медицинский Форум», 2014 г; IX Национальном Конгрессе терапевтов, 2014 г.; VI Российской научно-практической конференции, 2014 г.; X Евразийской научной конференции, 2014 г.; VIII Научно-практической конференции – «Воронцовские чтения Санкт-Петербург – 2015», IV Всероссийском межрегиональном Конгрессе «Балтийский медицинский Форум», 2015 г; IX Научно-практической конференции, «Воронцовские чтения. Санкт-Петербург – 2016»; Всероссийской научно-практической конференции «избранные вопросы внутренней медицины», 2016 г.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Автором лично были осуществлены все этапы работы, за исключением общеклинических лабораторных и инструментальных исследований. Определение оксида азота в выдыхаемом воздухе осуществлялось лично автором.

Обоснованность и достоверность результатов исследования

Высокая степень обоснованности и достоверности результатов исследования определяется репрезентативным объемом выборки обследованных, использованием современных методов исследования и наиболее статистически значимых связей.

Соответствие диссертации Паспорту научной специальности

Приведенные в диссертации научные положения соответствуют области исследования по пунктам 1-5 паспорта специальности 14.01.25 – Пульмонология по номенклатуре паспортов научных специальностей Высшей Аттестационной Комиссии (ВАК).

Публикации результатов исследования

По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, из них 5 статей в журнале, рекомендованном ВАК, 4 статьи опубликованы в зарубежных журналах.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 202 источника (отечественных – 97, иностранных – 105). Работа содержит 59 таблиц и иллюстрирована 25 рисунками и 2 графиками.