Введение к работе
Актуальность темы диссертационного исследования
Бронхиальная астма (БА) и хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) являются наиболее распространенными хроническими бронхообструктивными заболеваниями во всём мире. При наличии типичной клинической картины провести дифференциальную диагностику этих патологических состояний не составляет труда, однако по мере увеличения возраста пациентов и при воздействии неблагоприятных экзогенных факторов симптомы заболеваний меняются, и постановка диагноза вызывает трудности, а также меняется ответ пациентов на стандартную терапию. В последние годы активно обсуждается фенотип, представляющий собой сочетание БА, особенно в пожилом возрасте и/или при наличии факта табакокурения, с ХОБЛ. В настоящее время актуальной задачей является активное выявление пациентов с сочетанием БА и ХОБЛ и изучение специфики данного фенотипа с целью обнаружения предикторов развития этого состояния, индивидуализации лечения, улучшения прогноза и качества жизни пациентов.
Благодаря выраженному противовоспалительному эффекту глюкокортикостероидов (ГКС), использование их в качестве базисной терапии многих воспалительных заболеваний общепризнано. Ингаляционные ГКС (ИГКС) рекомендуются документом Global Initiative for Asthma (GINA) при БА для купирования эозинофильного воспаления дыхательных путей (GINA, 2017). При ХОБЛ доминирует нейтрофильное воспаление, что в большинстве случаев ассоциировано со снижением стероидочувствительности (Piras B. et al., 2012). Однако обратимость бронхообструкции и появление эозинофилии мокроты, особенно при обострениях ХОБЛ, служат показаниями для назначения ГКС в комбинации с длительно действующими 2-агонистами (ДДБА) у этой категории пациентов (GOLD, 2017).
При прогрессировании ХОБЛ и формировании диффузной эмфиземы с низкой толерантностью к физической нагрузке или гигантских булл у этой категории больных при неэффективности терапии, в том числе ИГКС, используют оперативное лечение – хирургическую редукцию объёма лёгких.
При эмфиземе легких, возникающей у молодых некурящих пациентов, не
подвергавшихся воздействию продуктов сгорания органического топлива или
профессиональных вредностей, в патогенезе которой большое значение придают эндогенным факторам, в первую очередь гомозиготной форме врождённой недостаточности 1-антитрипсина, а также врождённым дефектам структурных гликопротеинов, вследствие изменения эластичности лёгочной ткани также может возникать бронхиальная обструкция (Овчаренко С. И. и соавт., 2011). У этих больных при возникновении спонтанного пневмоторакса (СП) в результате разрыва булл в тканях лёгкого используется хирургическое лечение. При наличии одышки и кашля с трудноотделяемой мокротой в послеоперационном периоде назначают терапию, рекомендуемую пациентам с ХОБЛ (Гембицкая Т.Е., 2015). Несмотря на то, что данные по применению ИГКС у больных с первичной эмфиземой неоднозначны, вероятно, их использование целесообразно у пациентов с доказанной обратимой бронхообструкцией для достижения контроля над воспалением дыхательных путей. Таким образом, у этих больных актуально изучение маркеров стероидочувствительности для дифференцированного назначения ГКС. В нашем исследовании пациенты с первичной эмфиземой не имели бронхообструктивных изменений, не получали терапию ГКС и рассматривались как группа сравнения.
ГКС осуществляют противовоспалительный эффект через глюкокортикоидный рецептор (ГР), который кодируется геном NR3C1. В результате альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК) гена NR3C1 формируются изоформы ГР, из которых наиболее изучены ГР и ГР. ГР реализует противовоспалительный эффект ГКС, а ГР является её естественным ингибитором. При воспалении синтез ГР усиливается, что приводит к подавлению экспрессии ГР, к развитию стероидорезистентности и, в итоге, к снижению противовоспалительного эффекта ГКС (Lu N., 2004). Кроме того, изоформа ГР способна ингибировать деацетилазу 2
гистонов (HDAC2), которая реализует противовоспалительный эффект, подавляя транскрипцию провоспалительных генов (Kelly A., 2008). В единичных зарубежных исследованиях была выявлена тканеспецифическая экспрессия ГР в различных органах человеческого организма и в эксперименте на животных (Schaaf M., 2008; Torrego A., 2002). Изучение различий в экспрессии изоформ ГР и ГР в крови и в тканях лёгких является актуальной задачей, поскольку открывает перспективы использования малоинвазивных методов диагностики стероидорезистентности у больных ХОБЛ тяжёлой степени и минимизации побочных эффектов ГКС.
В настоящее время является актуальным изучение эпигенетического регулирования (изменения экспрессию генов, не сопровождающегося изменением последовательности ДНК) при БА и ХОБЛ, одним из механизмов которого является изменение деацетилирования гистонов, то есть влияние на уровне протеома.
При ХОБЛ и БА тяжёлого течения окислительный и нитратный стрессы, возникающие в результате воздействия экзогенных факторов, таких как курение и воздушные ирританты, через формирование пероксинитритов приводят к снижению деацетилирования гистонов и развитию стероидорезистентности (Barnes P., 2013). Кроме того, окислительный стресс активирует фосфоинозитид-3-киназу (PI3K) , что приводит к фосфорилированию и инактивации HDAC2. Таким образом, окислительный стресс может быть важным механизмом формирования стероидорезистентности у пациентов с ХОБЛ, БА тяжёлого течения, особенно у курильщиков, и, возможно, у пациентов с перекрёстным синдромом БА-ХОБЛ (ПС).
Назначение ГКС приводит к повышению экспрессии HDAC2 и к транскрипционной репрессии провоспалительных генов. В связи с этим актуальным является изучение HDAC2 как маркера стероидорезистентности для диагностики и назначения таргетной терапии у больных БА, ХОБЛ и ПС.
Таким образом, представляется актуальным изучение механизмов развития
стероидорезистентности (оценка уровней мРНК PI3K, HDAC2, изоформ ГР и ГР) у больных БА, ХОБЛ и ПС. Это позволит выявить генетические маркеры для прогнозирования стероидочувствительности и стероидорезистентности, для создания фармакогенетического профиля у больных ПС и пациентов с ХОБЛ тяжёлого течения, что будет способствовать усовершенствованию принципов индивидуальной противовоспалительной терапии с оптимальным соотношением «эффективность-безопасность». Кроме того, изучение экспрессии генов открывает возможности для выявления новых мишеней лекарственного воздействия, что является перспективным направлением персонализированной медицины.
Степень разработанности научной проблемы
Пациенты с сочетанием БА и ХОБЛ, до 2017 года именовавшиеся как больные с ПС, имеют патофизиологические, клинические и терапевтические особенности по сравнению с пациентами с изолированными БА, ХОБЛ, и выделение таких больных в особую группу представляется обоснованным и целесообразным. С 2017 года, согласно очередному пересмотру документа GINA, используется терминология «сочетание БА и ХОБЛ» (GOLD 2017). Необходимо отметить, что ПС изучен недостаточно. Это обусловлено тем, что пациенты данной группы ранее исключались из большинства исследований, поскольку не удовлетворяли критериям выборки. До сих пор не выявлены чёткие клинические и патофизиологические признаки этого патологического состояния. Одной из важнейших целей изучения ПС является поиск предикторов его развития.
Для постановки диагноза ПС, согласно испанским рекомендациям 2012 года, пациент с БА должен соответствовать двум большим критериям или одному большому и двум малым критериям (Soler-Cataluna J., 2012). В 2014 году опубликован совместный документ GINA-GOLD, рекомендующий постановку диагноза ПС при наличии у одного больного одинакового количества признаков, типичных для БА и ХОБЛ (GINA-GOLD, 2014). Однако данная патология до сих пор мало изучена с точки зрения молекулярных механизмов её формирования и особенностей терапии.
Сведения по применению ИГКС у больных ПС неоднозначны. Несмотря на имеющиеся данные о большей стероидочувствительности у пациентов с ПС по сравнению с ХОБЛ, больные ПС схарактеризуются частыми трудно купируемыми обострениями, имеют низкое качество жизни и высокую смертность.
Практически не определён вклад экспрессии HDAC2, PI3K, изоформ ГР и ГР в формирование и тяжесть течения ПС, а также нет информации о том, ассоциирована ли экспрессия данных генов с эффективностью ГКС у этих пациентов. Кроме того, органоспецифическая экспрессия HDAC2, PI3K, изоформ ГР и ГР при ХОБЛ не изучалась.
Цель работы
Установить роль экспрессии изоформ глюкокортикоидного рецептора и , HDAC2, PI3K в патогенезе бронхиальной астмы в сочетании с ХОБЛ и чувствительности к терапии глюкокортикостероидами у этих больных.
Задачи исследования
-
Изучить клинические и молекулярно-генетические особенности ПС у жителей СевероЗападного региона Российской Федерации.
-
Определить экспрессию ГР, ГР, HDAC2, PI3K в периферической крови у больных ПС, больных бронхиальной астмой лёгкой степени (ЛБА), больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени, больных первичной эмфиземой, осложненной спонтанным пневмотораксом (СП), а также ассоциацию экспрессии с клиническими и патогенетическими признаками.
-
Определить экспрессию ГР, ГР, HDAC2, PI3K в биоптатах лёгкого у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени, у больных СП, а также ассоциацию экспрессии с клиническими и патогенетическими признаками.
-
Оценить корреляцию экспрессии ГР, ГР, HDAC2, PI3K в периферической крови и в биоптатах легкого у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени, а также у больных СП.
-
Разработать маркерный профиль стероидочувствительности на основе анализа экспрессии ГР, ГР, HDAC2, PI3K у больных ПС, а также у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени.
Личный вклад автора в проведённое исследование
Автором лично были осуществлены все этапы данной работы за исключением общеклинических лабораторных и инструментальных исследований, а также проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Подготовительный этап данного исследования (стабилизация РНК и её выделение из биоматериала), а также математическая обработка полученных результатов также были выполнены автором.
Научная новизна результатов исследования
-
Впервые разработан маркерный профиль стероидочувствительности на основе анализа экспрессии ГР, ГР, HDAC2, PI3K у больных с ПС и у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени, и показана связь экспрессии изучаемых генов с клиническими особенностями, дозой и длительностью ГКС-терапии.
-
Впервые оценена органоспецифическая экспрессия ГР, ГР, HDAC2, PI3K в лёгких у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени, а также у больных СП, и показана связь патофизиологических механизмов на системном и локальном уровнях регуляции у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени.
-
Впервые показана роль экспрессии ГР, ГР, HDAC2, PI3K в патогенезе СП.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Сочетание БА и ХОБЛ гетерогенно по гендерному и возрастному составу, по характеру воспаления и ответу на ГКС-терапию.
-
У больных ПС показателями эффективности ГКС-терапии являются повышение экспрессии ГР и HDAC2.
-
У больных с ПС и ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени экспрессия ГР, ГР, HDAC2, PI3K ассоциирована со степенью тяжести заболевания.
-
У больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени имеется связь патофизиологических механизмов на системном и локальном уровнях регуляции, а именно снижение экспрессии ГР и повышение экспрессии ГР как в периферической крови, так и в тканях лёгких.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Разработан персонифицированный подход к больным ПС, а также к больным ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени на основе комплексной оценки клинической картины, экспрессии ГР, ГР, HDAC2, PI3K и ответа на ГКС-терапию. Также разработан диагностический подход с целью минимизации инвазивных исследований для оценки прогрессирования основного заболевания и прогнозирования эффективности ГКС-терапии у больных ХОБЛ тяжёлой и крайне тяжёлой степени на основе анализа экспрессии ГР и ГР в периферической крови.
Результаты исследования внедрены в лечебную практику клиники НИИ ревматологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова» МЗ РФ (197022, СПб, ул. Льва Толстого, д. 6-8, тел. +7 (812) 338-71-32, ). Теоретические и практические положения, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе кафедры госпитальной терапии с курсом аллергологии и иммунологии им. акад. М.В. Черноруцкого с клиникой в программах обучения студентов ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, а также слушателей циклов последипломного образования.
Апробация работы
Данная работа стала победителем конкурса научных работ молодых учёных ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (приказ ректора №331 от 18.05.2015г.), удостоена диплома II степени на VI Международном молодёжном медицинском конгрессе в 2015 году (г. Санкт-Петербург) и диплома I степени на конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины» в 2016 году (г. Санкт-Петербург), а также стала лауреатом сессии молодых ученых XXVII Национального Конгресса по болезням органов дыхания в 2017 году (г. Санкт-Петербург).
Результаты диссертации доложены на конференциях «Булатовские чтения: актуальные вопросы пульмонологии и клинической аллергологии» в 2015 и 2017 годах (г. Санкт-Петербург), конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» в 2016 году (г. Санкт-Петербург), а также ежегодных конгрессах Европейского Респираторного Общества в 2016 (г. Лондон) и 2017 (г. Милан) годах.
Методология и методы исследования
Отбор и обследование больных проводились на базе кафедры терапии госпитальной им. акад. М.В. Черноруцкого с клиникой (зав. каф. д.м.н. профессор В.И. Трофимов) и отдела хирургической пульмонологии ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (руководитель отдела д.м.н. профессор А.Л. Акопов).
Всем больным проводилось комплексное клинико-лабораторное и инструментальное обследование, включающее общеклинические методы, цитологическое исследование мокроты, исследование функции внешнего дыхания (ФВД), по показаниям – фибробронхоскопию, компьютерную томографию органов грудной клетки, эхокардиографию (ЭХОКГ), а также
аллергологическое, гормональное и гистологическое исследование биоптатов легкого. У больных, имеющих факт табакокурения в анамнезе, рассчитывался индекс курильщика.
Молекулярно-генетические исследования проводились на базе отдела молекулярно-генетических и нанобиологических технологий Научно-исследовательского центра ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (руководитель отдела академик РАН М.В. Дубина, зав. лаб. медицинской генетики д.б.н. С.Н. Пчелина), а также кафедры клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины (зав. каф. директор научно-методического центра Минздрава России по молекулярной медицине д.м.н. профессор В.Л. Эмануэль, исследование проводилось при содействии д.м.н. профессора М.И. Зарайского).
Экспрессия исследуемых генов определялась в периферической крови у всех больных и у лиц контрольной группы. У пациентов с ХОБЛ и СП, получавших хирургическое лечение, экспрессия изучаемых генов определялась также и в биоптатах лёгких.
Стабилизацию профиля экспрессии внутриклеточной мРНК в крови производили с помощью реагента «Среда-РНК» (АмплиСенс, Россия, кат. ном. 981). Биоптаты лёгких забирали непосредственно во время оперативного вмешательства в пробирки с реагентом RNAlater (Ambion, США, кат. ном. 7020) для стабилизации профиля экспрессии внутриклеточной мРНК. Общую РНК выделяли из крови с помощью набора реагентов «РИБО-золь-В» (АмплиСенс, Россия, кат. ном. K2-3-100). Для выделения общей РНК из тканей лёгких использовали набор реагентов RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия, кат. ном. 74104). ПЦР в режиме реального времени использовалась для оценки относительной нормализованной экспрессии генов HDAC2 (OMIM 605164), PIK3CD (OMIM 602839), а также изоформ и гена NR3C1 (OMIM 138040). ПЦР в режиме реального времени проводили в объеме 25 мкл в приборе CFX96 Touch (Bio-Rad Laboratories, США). В качестве эндогенного внутреннего контроля использовали гены GNB2L1 (OMIM 176981) и GAPDH (OMIM 138400).
Результаты исследования обрабатывали с помощью компьютерной программы SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Statistics 22.0 (IBM, США). Уровень значимости p принимали равным 0,050. Все количественные переменные были проверены на нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка, а также на однородность дисперсии с помощью критерия Левина. При логнормальном распределении исходных данных использовали логарифмирование для приближения распределения к нормальному виду.
Сравнение выборок по показателям, соответствующим критериям нормального
распределения, производилось методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). В
случае выявления статистически значимых различий осуществлялись попарные сравнения с
помощью t-критерия Стьюдента и поправки Бонферрони. Для сравнения групп по показателям,
не соответствующим критериям нормального распределения, использовались
непараметрические критерии Манна-Уитни (при сравнении двух независимых выборок) и Крускала-Уоллеса (при сравнении более двух независимых выборок).
Номинативные (категориальные) переменные сравнивались методом составления таблиц сопряжённости и вычисления критерия 2 либо точного критерия Фишера. Кроме того, использовался корреляционный анализ (парные сравнения). Для выявления субгрупп ПС применялась кластеризация К-средними.
Обоснованность и достоверность результатов исследования
Высокая степень обоснованности и достоверности результатов исследования определяется репрезентативным объёмом выборки обследованных лиц, использованием современных методов исследования, применением для анализа общепризнанных «жёстких» статистических критериев, использованием наиболее статистически значимых связей и применением нескольких математических методов для обоснования каждого из полученных выводов.
Соответствие диссертации Паспорту научной специальности
Отражённые в диссертации научные положения соответствуют области исследования, по пунктам 1 – 5 паспорта специальностей 14.01.25 – Пульмонология и 14.03.10 – Клиническая лабораторная диагностика по номенклатуре паспортов научных специальностей Высшей Аттестационной Комиссии (ВАК).
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 в зарубежных изданиях, и 3 статьи в журналах, входящих в Перечень Высшей Аттестационной Комиссии.
Структура диссертации
Диссертация представляет собой рукопись объёмом 130 страниц машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, главы обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, списка сокращений. Библиографический указатель включает 102 источника, из них 15 – отечественных и 87 – зарубежных. Работа иллюстрирована 36 таблицами, 53 рисунками.