Введение к работе
Актуальность темы диссертационного исследования
Хроническая обструктивная болезнь лёгких (ХОБЛ) и Бронхиальная астма (БА) относятся к группе мультифакторных заболеваний. Патогенез этих заболеваний ассоциирован с различными функционально взаимосвязанными генами, включающими наряду с главными генами, ответственными за начало болезни, второстепенные гены, так называемые гены-модификаторы, эффекты которых во многом определяются внешними факторами (Yick C.Y., 2014, GINA-2015, GOLD-2015).
Благодаря многочисленным противовоспалительным эффектам
глюкокортикостероидных гормонов (ГКС), использование их в качестве базисной терапии БА в настоящее время считается общепризнанным, а изучение способов повышения их эффективности является одним из лидирующих направлений борьбы с данным заболеванием. Известно, что до 60% больных БА не отвечают на ингаляционные глюкокортикостероиды (ИГКС) в достаточной степени. У большинства пациентов с ХОБЛ наблюдается сниженная стероидочувствительность (СЧ). Роль ГКС в терапии ХОБЛ неоднозначна и продолжает пересматриваться (Quon B.S., 2008, Agarwal R., 2010).
В клинической практике нередко наблюдается сочетание классических признаков БА и ХОБЛ, получившее название «перекрёстный синдром» (ПС) («Overlap Syndrome», “asthmalike COPD” (chronic obstructive pulmonary disease), “eosinophilic COPD” и др.). Этот фенотип наиболее характерен для пациентов пожилого возраста и обусловливает сложности в подборе терапии, возможно, из-за развития вторичной стероидорезистентности, а также ГКС-асcоциированных осложнений (Schuetz P., 2008). Это определяет актуальность изучения патофизиологии ПС, механизмов стероидорезистентности при ПС и способов её преодоления.
Противовоспалительный эффект ГКС реализуется через взаимодействие с глюкокортикоидным рецептором (ГР) и ядерную транслокацию комплекса ГКС-ГР, что приводит к изменению экспрессии генов, ассоциированных с воспалением (Barnes P.J., 2014). В результате альтернативного сплайсинга матричной РНК (мРНК) гена ГР (NR3C1), наряду с изоформой ГР, опосредующей основные эффекты ГКС, формируется изоформа ГР, которая является естественным ингибитором ГР. По некоторым данным при развитии воспаления в клетке активируется синтез ГР, что приводит к подавлению ГР и, соответственно, к снижению эффекта терапии ГКС (ГКТ). Также известно об ингибирующем воздействии ГР на деацетилазу-2 гистонов (HDAC-2), которая вовлечена в ведущий механизм трансрепрессии провоспалительных генов глюкокортикостероидами, особенно у курящих больных БА, ХОБЛ (Kelly A., 2008). Увеличение экспрессии ГР при нейтрофильном типе воспаления приводит к уменьшению апоптоза нейтрофилов и, соответственно, к снижению эффективности ГКС (Strickland I., 2001). В настоящее время изоформы глюкокортикоидного рецептора рассматриваются как важные мишени для создания новых противовоспалительных лекарственных препаратов, что определяет актуальность изучения ГР у больных БА, ХОБЛ и ПС, учитывая необходимость преодоления сниженной СЧ у большого количества пациентов с данными заболеваниями.
Актуальным также является изучение механизма генетического контроля транспорта ГКС и связанных с ним различий в СЧ. Ген мультилекарственной устойчивости (MDR1) кодирует транспортный белок P гликопротеин-170 (Pgp-170), который осуществляет эффлюкс липофильных молекул, в том числе ГКС. Однонуклеотидные полиморфизмы MDR1, способные модулировать активность гена, такие как C3435T, значимо влияют на развитие БА и чувствительность к ГКТ. Это позволяет рассматривать их в качестве маркёров стероидорезистентности при данном заболевании, а также делает актуальным изучение их при ХОБЛ и ПС
Таким образом, представляется целесообразным изучение аллельных вариантов С3435Т гена MDR1, экспрессии мРНК изоформ ГР и и проведение оценки вклада вышеуказанных детерминант в формирование СЧ и терапевтической резистентности у больных ХОБЛ, БА и ПС.
Степень разработанности научной проблемы
На сегодняшний день существуют разные точки зрения о ПС. Согласно «Британской гипотезе» БА и ХОБЛ представляют собой два различных заболевания и имеют собственные патогенетические механизмы. Согласно «Голландской гипотезе» БА и гиперреактивность бронхов предрасполагают к появлению ХОБЛ в более позднем возрасте, что характеризует эти состояния как проявления одного заболевания и подтверждается общностью их генетической основы, а также последовательностью развития данных состояний (GINA-2015, GOLD-2015).
В настоящее время очевидна важность выделения в клинической практике группы пациентов с сочетанием БА и ХОБЛ, так как эти больные требуют специального диагностического и лечебного подхода. Однако, необходимо отметить, что ПС изучен недостаточно. Это обусловлено тем, что пациенты данной группы ранее исключались из большинства исследований, поскольку не удовлетворяли критериям выборки. Так, например, нет длительных наблюдений за течением заболевания, особенностями клинической картины, таких как качество жизни, частота обострений, летальность и т.д. С диагностической точки зрения необходимо уточнение того, насколько применимы предложенные критерии на практике и не требуют ли они дополнений. Для разработки рекомендаций по лечению ПС крайне важно изучить профиль воспаления, а также особенности ответа на проводимую терапию.
Практически не изучено влияние ГКС на уровень экспрессии изоформ ГР, не определён вклад экспрессии изоформ ГР в формирование и тяжесть течения БА, ХОБЛ, нет данных о том, ассоциирована ли экспрессия изоформы ГР с эффективностью ГКС у стероидочувствительных пациентов. Кроме того, экспрессия изоформ ГР при ПС не изучалась.
Исследования по изучению гена MDR1 при ХОБЛ единичны, а публикаций при ПС в доступной литературе мы не нашли.
Объект и предмет исследования
Объектом исследования является социально значимая хроническая
бронхобструктивная патология органов дыхания, представленная БА, ХОБЛ и официально признанным с 2014 года ПС. Предмет исследования – чувствительность к глюкокортикоидной терапии у пациентов, страдающих этими заболеваниями.
Цель работы
Оценить роль фармакогенетических факторов: глюкокортикоидных рецепторов и , аллельных вариантов C3435T гена MDR1 в формировании стероидочувствительности с целью создания маркёрного профиля эффективности терапии глюкокортикостероидами у больных БА, ПС, ХОБЛ.
Задачи исследования
-
Изучить особенности клинической картины, диагностики, терапии ПС.
-
Определить уровень экспрессии мРНК ГР и мРНК ГР у больных БА, ПС, ХОБЛ до и после терапии внутривенными ГКС в фазе обострения.
-
Определить частоту встречаемости аллельных вариантов C3435T гена MDR1 у пациентов с БА, ПС, ХОБЛ.
4. Выявить связь аллельных вариантов C3435T гена MDR1, изоформ ГР и ГР с
патофизиологическими, клиническими признаками БА, ПС, ХОБЛ, а также их ассоциацию с
ответом на терапию ГКС.
5. Разработать маркёрный профиль стероидочувствительности у больных БА, ПС, ХОБЛ.
Личный вклад автора в проведённое исследование
Автором лично были осуществлены все этапы данной работы за исключением общеклинических лабораторных и инструментальных исследований, а также – проведения ПЦР в реальном времени. При этом подготовительный этап данного исследования и последующая математическая обработка первичных данных также выполнялись автором.
Научная новизна результатов исследования
-
Впервые описаны два подтипа ПС: 1) пациенты с неблагоприятным прогнозом заболевания, среднего возраста с большим стажем курения и резко выраженной бронхообструкцией 2) пациенты с благоприятным прогнозом, пожилого возраста, некурящие или малокурящие со значительной бронхообструкцией.
-
Впервые у больных БА, ПС и ХОБЛ выявлена ассоциация экспрессии мРНК изоформ ГР/ с основными патогенетическими фенотипами (эозинофильным и нейтрофильным воспалением в дыхательных путях), показателями функции внешнего дыхания, клиническими особенностями, длительностью и дозами глюкокортикостероидной терапии в динамике.
3. Впервые разработан маркёрный профиль эффективности терапии ГКС, включающий
активность глюкокортикоидного рецептора и аллельных вариантов C3435T гена
мультилекарственной устойчивости у больных с БА, ПС, ХОБЛ.
Теоретическая и практическая значимость исследования
В настоящей работе дана детальная характеристика ПС с учётом комплексной оценки молекулярно-генетических маркёров, патогенеза и клинических признаков, а также создан маркёрный профиль, детерминирующий стероидочувствительность и позволяющий проводить дифференциальную диагностику с БА и ХОБЛ, прогнозировать эффективность ГКТ и обеспечивать персонификацию терапии.
Результаты работы внедрены в лечебную практику пульмонологического отделения №2, терапевтического отделения №2 клиники НИИ ревматологии и аллергологии ФГБОУ ВО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова» МЗ РФ (197022, СПб, ул. Льва Толстого, д. 6-8, тел. (812) 338-71-32, http: // .
Теоретические и практические положения, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе кафедры госпитальной терапии с курсом аллергологии и иммунологии имени академика М.В.Черноруцкого с клиникой в программах обучения студентов ПСПбГМУ им. академика И.П. Павлова, а также слушателей циклов последипломного образования.
Апробация работы
Настоящая работа стала победителем конкурса научных работ молодых учёных ПСПбГМУ им. акад. И.П.Павлова (приказ и.о. ректора №139 от 12.04.2012г.) и финалистом конкурса Комитета по науке и высшей школе Правительства Санкт-Петербурга «Молодые, дерзкие, перспективные – 2014», удостоена диплома II степени на III Международном молодёжном конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения – 2009» и диплома I степени на LXX научно-практической конференции «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины – 2009» (Санкт-Петербург).
Результаты диссертации доложены на ежегодном конгрессе Европейского Респираторного Общества в 2011 году (г. Амстердам), 2014 году (г. Мюнхен) и в 2015 году (г. Амстердам), а также – на XXV Национальном конгрессе по болезням органов дыхания в 2015 году (г. Москва), где работа была удостоена диплома первой степени.
Теоретическая и методологическая основа исследования
Теоретический базис настоящей работы – это две общепризнанные и конкурирующие теории, описывающие БА и ХОБЛ как различные заболевания («британская» гипотеза) или как различные проявления генетически и молекулярно единой патологии («голландская» гипотеза). Существующие в настоящее время научные данные о механизмах эффективности ГКС также составляют теоретическую основу данного исследования.
Методологическая база настоящей работы включает в себя как философский уровень (диалектический метод), так и общенаучные (анализ, синтез, моделирование, индукция), и частные научные методы (описание, счёт, измерение, сравнение и другие).
Клиническое и лабораторное обследование больных осуществлялось на базе клиники госпитальной терапии ФГБОУ ВО ПСПбГМУ им.акад. И.П.Павлова МЗ РФ после получения письменного согласия на проведение исследования. Во всех группах проводилась оценка клинико-функциональных показателей, лабораторно-инструментальных исследований.
Клинико-физикальное обследование включало сбор анамнеза и жалоб пациента, оценку объективных данных. Проведено анкетирование: оценка одышки по шкалам mMRC (Dispnea scale), клинических опросников ХОБЛ и БА (CAT, AST). У каждого больного был рассчитан индекс курильщика и индекс BODE. Постановка диагноза и обследование пациентов проводилось по плану пульмонологического больного в соответствии с рекомендациями GOLD и GINA 2011-2015 и включало клинический и биохимический анализы крови, цитологический анализ мокроты и посев её на флору, коагулограмму. Всем пациентам выполнялась ЭКГ, рентгенограмма грудной клетки в двух проекциях, исследовалась функция внешнего дыхания.
Молекулярно-генетическое исследование было выполнено в Отделе молекулярно-генетических и нанобиологических технологий (ОМГНТ) научно-исследовательского центра ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова (руководитель отдела член-корр. РАН М.В. Дубина, заведующая лабораторией медицинской генетики ОМГНТ НИЦ ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова д.б.н. С.Н. Пчелина) при непосредственном методическом содействии старшего научного сотрудника к.м.н. А.С. Улитиной, а также в лаборатории молекулярной диагностики Научно-Методического центра по молекулярной медицине МЗ и СР РФ (руководитель д.м.н., профессор В.Л.Эмануэль, заведующий лабораторией д.м.н. профессор М.И. Зарайский) при непосредственном методическом содействии д.м.н. профессора А.А. Сазанова.
Выделение геномной ДНК из крови пациентов производилось стандартным фенол-хлороформным методом. Для генотипирования применялась ПЦР с рестрикционным анализом. Стабилизация тотальной РНК производилась химическим методом с использованием реагента «среда РНК» (ФГУН «ЦНИИЭ Роспотребнадзора», Россия). Тотальную РНК выделяли из клеток крови с помощью модифицированного фенол-гуанидинтиоцианат-хлороформного метода П. Хомчинского. Определение экспрессии изоформ ГР выполнено методом ПЦР в реальном времени.
Результаты исследования обрабатывали с помощью компьютерной программы SPSS (Statistical Package for the Social Sciences) Statistics 22.0 (IBM). Уровень значимости p принимали равным 0,050. Значения p в пределах 0,051 – 0,099 расценивались как статистическая значимость на уровне тенденции.
Все количественные (метрические) данные были проверены на нормальность распределения с использованием критерия Шапиро-Уилка, учитывая размеры групп; а также на однородность дисперсии с использованием критерия Левина. При логнормальном распределении исходных данных использовали логарифмирование для приближения распределения к нормальному виду.
Сравнение выборок по показателям, соответствующим критериям нормального распределения и однородности выборки, производилось методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). В случае выявления значимых различий осуществлялись парные сравнения с использованием обычного t-критерия и сложные сравнения (по типу:
группа 1 + группа 2 против группы 3) методом контрастов. При проведении парных сравнений post factum вводилась поправка Бонферони.
Для сравнения групп по показателям, не соответствующим критериям нормального распределения или однородности дисперсии, использовались непараметрические критерии: Крускала-Уоллеса, Манна-Уитни, Вилкоксона.
Номинативные (категориальные) переменные и некоторые непрерывные, но разбитые на интервалы, переменные (например, возрастные группы) сравнивались методом составления таблиц сопряжённости и вычисления критерия 2, либо точного критерия Фишера. Также, при формировании таблиц 22, в некоторых случаях определялось отношение шансов (OR), рассчитанное с 95% интервалом (CI).
Кроме того, в данной работе широко использовался корреляционный анализ (парные сравнения) и его модификации (парные сравнения со включением ковариат), а также метод простой линейной регрессии и дискриминантный анализ. Для выявления подгрупп ПС применён кластерный анализ (кластеризация К-средними).
Обоснованность и достоверность результатов исследования
Высокая степень обоснованности и достоверности результатов исследования определяется репрезентативным объёмом выборки обследованных лиц, использованием современных методов исследования, применением для анализа общепризнанных «жёстких» статистических критериев, использованием наиболее статистически значимых связей и применением нескольких математических методов для обоснования каждого из полученных выводов.
Соответствие диссертации Паспорту научной специальности
Отражённые в диссертации научные положения соответствуют области исследования, по пунктам 1 – 5 паспорта специальности 14.01.25 – Пульмонология по номенклатуре паспортов научных специальностей Высшей Аттестационной Комиссии (ВАК).
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 20 работ, в том числе 8 в зарубежных изданиях и 3 – в журналах Перечня Высшей аттестационной комиссии РФ.
Структура диссертации
Диссертация представляет собой рукопись объёмом 175 страниц машинописного текста и состоит из введения, глав обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, главы обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, списков таблиц, рисунков, сокращений и 1 приложения. Библиографический указатель включает 209 источников, из них 11 – отечественных и 198 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 47 таблицами, 24 рисунками.