Содержание к диссертации
Введение
1. Экологическая роль закиси азота 8
1.1.Глобальные источники и стоки закиси азота 8
1.2. Биологические пути образования и поглощения закиси азота в почвах 16
2. Образование и поглощение закиси азота под влиянием факторов внешней среды 24
3. Микробная трансформация закиси азота в засоленных почвах 30
3.1 .Микробные сообщества засоленных почв 30
3.2.Влиякие солей на процессы азотного цикла в почвах 40
4. Тяжелые металлы как фактор воздействия на почвенную микробиоту 46
4.1 .Влияние тяжелых металлов на численность и структуру комплекса почвенных микроорганизмов 49
4.2.Влияние тяжелых металлов на биологическую активность почв 52
5. Воздействие пестицидов на почвенные микроорганизмы 56
5.1 .Пестициды как токсиканты окружающей среды 57
5.2.Влияние пестицидов на активность микробиологических процессов в почвах 61
5.3.Влияние пестицидов на активность отдельных систематических групп микроорганизмов 63
6. Микробная трансформация закиси азота внутри почвенных агрегатов 67
6.1 .Распределение и активность микроорганизмов внутри почвенных агрегатов 67
6.2.Образование и поглощение газов в почвенных агрегатах 69
6.3.Модели формирования анаэробных зон внутри почвенных агрегатов 71
6.4.Влияние агрегатного состава на эмиссию закиси азота из почв 74
Экспериментальная часть
7. Объекты и методы исследования 78
7.1.Почвы 78
7.2.Методы определения концентрации газов 78
7.3. Проведение полевых, вегетационных и лизиметрических исследований 81
7.4.Методы выделения дешприфшгирующих бактерий 86
7.5.Определение денитрифицирующей активности выделенных штаммов 87
7.6.Количественный учет бактерий и грибов в почвенных агрегатах 88
7.7.Определение агрегатного состава почв 89
7.8.Выделение водопрочных агрегатов 89
7.9.Методы изучения микробной трансформации азота в засоленных почвах 90
7.9.1.Методы исследования воздействия у-излучения на активность денитрифицирующих бактерий в почвах 90
Результаты и обсуждение
8. Образование и поглощение закиси азота в почвах разных типов 99
8.1 .Выделение и поглощение закиси азота денитрифицирующими бактериями в основных типах почв Европейской части России 102
8.2.Интенсивность образования и поглощения закиси азота в полевых условиях 106
8.3.Биомасса денитрифицирующих бактерий, осуществляющих выделение и поглощение
закиси азота в почвах 109
8.4.Микробное поглощение закиси азота в почвах 111
9. Микробная трансформация закиси азота в засоленных почвах 122
9.1.Активность денитрификации и биомасса денитрификаторов в засоленных почвах 122
9.2.Интенсивность дыхания и микробная биомасса в засоленных почвах 122
9.3.Соотношение численности галотолерантных и галофильных бактерий в засоленных почвах 128
9.4.Влияние солей на образование и поглощение закиси азота денитрифицирующими бактериями 130
9.5. Влияние засоления на процессы образования и поглощения закиси азота в зональных типах почв 132
9.6.Микробная трансформация закиси азота в условиях солевого стресса 138
10. Образование и поглощение закиси азота в почвах под влиянием антропогенных факторов 147
10.1.Влияние минеральных азотных удобрений на эмиссию закиси азота из почв 147
10.2.Влияние пестицидов на образование и поглощение закиси азота в почвах 153
10.3.Влияние солей тяжелых металлов на образование и поглощение закиси азота в почвах 156
10.4 Влияние тяжелых металлов на активность чистых культур денитрифицирующих бактерий 159
10.5.Влияние у-излучения на активность денитрифицирующих бактерий в почвах 165
Ю.б.Особенности трансформации закиси азота
в древнеокультуренных погребенных почвах 171
11. Влияние увлажнения на образование и поглощение закиси азота в почвах 178
12. Особенности трансформации закиси азота в почвенных агрегатах 190
12.1.Анаэробные процессы в почвенных агрегатах малого диаметра 190
12.1.1 .Выделение С02 из агрегатов малого диаметра 190
12.1.2.0бразованиеМ20 в почвенных агрегатах 191
12.1.3.Эмиссия метана в зависимости от диаметра почвенных агрегатов 192
12.2. Особенности образования и поглощения закиси азота в водопрочных агрегатах 194
12.3.Распределение микроорганизмов внутрипочвенных агрегатов 200
12.4.Структура комплекса денитрифицирующих бактерий в агрегатах разных типов почв 205
Заключение 211
Выводы 214
Литература 218
- Биологические пути образования и поглощения закиси азота в почвах
- Проведение полевых, вегетационных и лизиметрических исследований
- Влияние засоления на процессы образования и поглощения закиси азота в зональных типах почв
- Особенности образования и поглощения закиси азота в водопрочных агрегатах
Введение к работе
Атуальность проблемы. Изменение микрокомпонентного состава атмосферы, происходящее в настоящий период времени, по своим экологическим последствиям может быть отнесено к наиболее значимым факторам, воздействующим на состояние биосферы.
Важнейшие компоненты современной атмосферы, относящиеся к "парниковым газам" и определяющие процесс глобального изменение климата (С02, СКЦ, N20), на 70-90% имеют биологическое происхождение и вовлекаются в биогеохимический круговорот в основном почвенным покровом планеты (Bouwman, 1990; Conrad, 1996). Поэтому актуальной задачей почвоведения и почвенной микробиологии становится изучение роли почв в формировании состава атмосферы, процессов выделения, поглощения, газообмена и трансформации почвешюй биотой этих газов, среди которых особое место занимает закись азота -N20 или монооксид азота I.
Экологическая роль закиси азота определяется тем, что являясь относительно инертной, в атмосфере она претерпевает ряд фотохимических превращений с образованием промежуточных продуктов, приводящих к деградации стратосферного озона. Помимо этого, закись азота, обладая высокой способностью к экранированию инфракрасного излучения, отраженного с поверхности Земли (в 150 раз больше, чем СОг), вносит свой вклад в глобальное явление саморазогрева атмосферы, известное как "парниковый эффект". На сегодняшний день этот вклад оценивается в 4-6% (Bouwman, 1990) но, учитывая ежегодный прирост ее концеїгграции в воздухе на 0.2-0.3% и большую устойчивость в атмосфере (до 200 лет), предполагается, что она будет играть все большую роль.
Другой важной особенностью закиси азота является ее преимущественно биологическое происхождение, причем именно почвы играют ведущую роль в этом процессе (Khalil, Rasmussen, 1992; Conrad, 1996). Источниками закиси азота в
почвах служат разнообразные процессы микробной трансформации соединений азота - денитрификация, диссимиляционное восстановление нитратов в аммоний, автотрофная и гетеротрофная нитрификация, процессы взаимодействия нитритов с аминокислотами (реакции Van Slyke), хсмоденитрификация и некоторые другие. Важным источником закиси азота в биосфере являются также лесные пожары и сжигание ископаемого топлива (Кудеяров, 1999).
В отличие от разнообразия источников закиси азота, пути ее биологического поглощения весьма ограшгэены, поскольку она не может быть ассимилирована растениями, грибами и почвенными животными (Davidson, 1994). В качестве единственных путей микробной трансформации N20 в почвах рассматриваются два процесса - восстановление закиси азота денитрифиціфующими и азотфиксирующими бактериями (Умаров, 1999). Предполагается, что наибольшее значение имеет денитрификация, а именно - этап восстановления закиси азота в молекулярный азот за счет функционирования специализированного фермента -ЫгО-редуктазы. Несмотря на большую значимость, этот процесс остается мало изученным.
Скорость восстановления закиси азота в почвах может зависеть от концентрации минеральных соединений азота, содержания органического вещества, присутствия растений и других факторов. Поэтому существенное изменение активности этого процесса следует ожидать под влиянием антропогенного воздействия на почвы, например, при внесении минеральных и органических удобрений; распашке почв; искусственном орошении и, часто связанных с этим, разрушением структуры почвенных агрегатов-, засолением и избыточным переувлажнением почв; при использовании средств защиты растений (гербицидов); вследствие аккумуляции в почвах тяжелых металлов и радионуклидов; вьтадении кислотных осадков и других воздействиях. Величина эмиссии закиси азота из почв в атмосферу в значительной мере определяется соотношением между процессами ее образования и поглощения в почвах.
Целью настоящей работы было выяснение особенностей микробной трансформации (образования и поглощения) закиси азота в почвах; исследование комплекса микроорганизмов, участвующих в этих процессах; оценка антропогенных воздействий на восстановление закиси азота в почвах.
Задачи исследования:
1. Изучение образования и поглощения закиси азота денитрифицирующими
бактериями в почвах основных биоклиматических зон Европейской части России и
некоторых стран СНГ.
2. Определение численности и биомассы денитрифицирующих бактерий,
способных к выделению и поглощению N20 в разных типах почв.
3. Исследование таксономического разнообразия дешггрифицирующих бактерий,
осуществляющих выделение и поглощение закиси азота в почвах основных типов.
-
Выяснение особенности образования и восстановления закиси азота в почвенных агрегатах.
-
Изучение процесса восстановления закиси азота в почвах под влиянием антропогенных факторов: применения минеральных удобрений, средств защиты растений, загрязнения почв тяжелыми металлами, процессов засолеїшя и при разрушении почвенных агрегатов.
Защищаемые положения.
1. Денитрификация представляет основной, экологически значимый путь
микробной трансформации (выделения и поглощения) закиси азота в почвах.
-
Процесс восстановления закиси азота тормозится при разрушении почвенных агрегатов и увеличении степени засоления почв.
-
Возрастание потока закиси азота из почв является следствием нарушения дшгамического равновесия между процессами ее образования и поглощения в почвах под влиянием антропогенных воздействий: применения мішеральньїх
азотных удобрений и средств защиты растений (пестицидов); загрязнения почв тяжелыми металлами; эрозионных процессов, приводящих к разрушению почвенных агрегатов; засоления почв. Научная новизна.
1.Исследование процессов микробной трансформации (образования и поглощения) закиси азота в почвах основных биоклиматических зон Европейской части России показало, что потенциал восстановления закиси азота в ненарушенных почвах обычно превышает масштабы ее образования, вследствие чего конечным продуктом денитрификации в зональных типах почв является молекулярный азот.
2. Впервые выявлен особый характер протекания денитрификации в
интразональных засоленных почвах (солончаки сулъфатно-хлоридного типа
засоления), для которых характерно преимущественное образование закиси азота.
Установлено, что этап восстановления закиси азота является наиболее
чувствительным звеном в цепи денитрификации по отношению к повышенной
концентрации солей.
-
Существешюе влияние на процесс денитрификации оказывает агрегатный состав почв - разрушение почвенной структуры, уменьшение размеров почвешіьіх агрегатов приводит к увеличению доли закиси азота в продуктах денитрификации.
-
В агроценозах эмиссия N20 увеличивается пропорционально дозе вносимого азота, достигая наибольшей величины при использовании минеральных азотных удобрений в аммонийной и амидной формах, а не в нитратной, как предполагалось ранее. Впервые установлено, что использование медлеішодействующих мочевшю-формальдегидных удобрений (МФУ) не приводит к снижению газообразных потерь адота за счет денитрификации по сравнению с внесением мочевины в тех же дозах. .
5. Антропогенные воздействия на почву (нарушение технологии применения
минеральных азотных удобрений и гербицидов, загрязнение почв тяжелыми
металлами, засоление почв и другие) приводят к снижению скорости
восстановления закиси азота в почвах. Вследствие этого, биогеохимический цикл
азота в антропогенно-измененных почвах нарушается и часто сопровождается
повышенной эмиссией закиси азота из почв в атмосферу.
Место проведення работы.
Работа осуществлялась на кафедре биологии почв факультета почвоведения МГУ и
соответствовала плановой тематике кафедры.
Автор благодарит своих учителей заведующего кафедрой профессора Д.Г.Звягинцева и профессора ММУмарова за ценные советы и поддержку; своих коллег И.П.Бабьеву, Б.А.Бызова, А_В.Головченко, В.С.Гузева, Т.Г.Добровольскую, Г.М.Зенову, П.А.Кожевина, А.В.Куракова, Л.В.Лысак, О.Е.Марфенину, Л.М.Полянскую, И.КСкворцову, И.Ю.Чернова, а также весь коллектив кафедры биологии почв за доброжелательные и ценные замечания при выполнении работы.
Автор глубоко признателен своим ученикам и соавторам Н.В.Костиной, М.Кромке, Н.А.Манучаровой, О.В.Меняйло, КС.Горбовской, А.Ю.Гранковой, Н.В.Дурихиной, В.В.Новикову за помощь на разных этапах исследования.
Автор блогодарен профессорам и сотрудникам факультета за обсуждение отдельных вопросов диссертации А.С.Владыченскому, Е.В.Шеину, Л.А.Воробьевой, И.И.Судницину, Г.С.Кусту, Н.В.Можаровой, Е.И.Дорофеевой. Личный вклад автора.
Автор принимал личное участие на всех этапах исследования, ему принадлежит постановка задачи, планирование экспериментов, участие в сборе значительной части полевого материала, выполнении экспериментальной работы, обобщеіше и интерпретация полученных результатов. В работе использованы материалы полученные в соавторстве с аспирантами и студентами, проводившими исследования под его руководством.
Практическое зііачевне работы.
Разработаны новые методы (Свидетельство об изобретении № 1370134 от 01.10.1986) для дифференцированной оценки скорости выделения и поглощения закиси азота микробным комплексом в разных типах почв. Предложены методические подходы для оценки общей биомассы денитрифицирующих бактерий в почвах и части микробной популяции, осуществляющей разные этапы процесса денитрификации в почвах, в зависимости от сочетания разных экологических факторов и различного характера антропогенного воздействия на почвы (12,26,29,30).
Сформулировано представление о конкурентном характере восстановления газообразных окисленных соединений азота в процессе денитрификации, что позволило разработать новое направление в биотехнологии, связанное с использованием денитрифицирующих бактерий для очистки воздуха от токсичных продуктов сгорания топлива - окислов азота (51).
Дана количественная оценка эмиссии закиси азота из почв разного генетического происхождения в зависимости от давления почвенной влаги, что позволяет прогнозировать величшгу газообразных потерь азота из почв в зависимости от степени увлажнения (44).
Результаты исследований и методические рекомендации включены в учебные пособия "Методы почвенной микробиологии и биохимии" (М.;МГУ. 1990) и "Микроорганизмы и охрана почв" (М.;МГУ. 1989), а также используются в лекционных курсах по биологии почв и по микробной трансформации азота в почвах на факультете почвоведения МГУ. Апробация работы.
Результаты исследования были представлены на Всесоюзной научной конференции "Современные методы исследования почв" (Москва, 1983); Всесоюзно*
симпозиуме "Биодинамика почв" (Таллин, 1988); Международном совещании "Структура и функции почвенных организмов при антропогенном воздействии" (Ceske Budejovice, 1990);Всесоюзной научной конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1992); XI Международном симпозиуме по биогеохимии окружающей среды (Salamanca, Spain, 1993); Международном конгрессе по микробиологии и микологии (Prague, Czech Republic, 1994); Первой международной конференции по биострессу (Darmstadt, Germany, 1995); ГХ Международном совещании "Азот в почвах" (Braunschweig, Germany, 1996); II Съезде общества почвоведов (С.-Петербург, 1996); Теоретическом семинаре по современным проблемам почвоведения под руководством Г.В. Добровольского (Москва, 1997); XVI Всемирном конгрессе почвоведов (Montpellier, France, 1998); Международной конференции по биотехнологии термофилов (Brest, France, 1998); Международной конференции по почвенной энзимологии (Granada, Spain, 1999); X Международном совещании "Азот в почвах" (Copengagen, Denmark, 1999); Ломоносовских чтениях (Москва, 2000); III Съезде Докучаевского общества почвоведов (Суздаль, 2000).
Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 78 научных работах, опубликованных в российских и зарубежных научных изданиях, включая разделы в учебном пособии (25) и двух коллективных монографиях (14, 18), а также заказной обзор в Applied Biochemistry and Biotechnology (51).
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, // глав и выводов, она изложена на ИЬ таблиц. Список литературы насчитывает %?() работ, из них на иностранных языках.
Биологические пути образования и поглощения закиси азота в почвах
Денитрификация рассматривается как способность аэробных бактерий окислять органическое вещество в отсутствие кислорода с использованием нитратов в качестве конечных акцепторов электронов, поэтому процесс часто называют нитратным дыханием. В результате происходит окисление органического вещества до диоксида углерода и восстановление нитратов через стадии образования промежуточных продуктов (N02\ NO, N20) до молекулярного азота.
5(СЯ 20)п + 4NO; + 4Н+ = 5 С02 + 7 Н20 + 2N2 + энергия
Последовательное восстановление окисленных соединений азота осуществляется ферментами: диссимиляционной нитратредуктазой, нитритредуктазой, редуктазой окиси азота и редуктазой закиси азота. Полная цепь нитратного дыхания имеется лишь у ограниченного числа микроорганизмов, так называемых, истинных денитрификаторов (Львов, 1989). К ним, например, относятся некоторые виды родов Paracoccus, Pseudomonas, Alcaligenes, Bacillus, Thiobacillus. Часто диссимиляционное восстановление нитратов в почве протекает в усеченной форме -только до нитритов (например, у представителей родов Spirillum, Corynebacterium, Propionibacterium) или заканчиваться на стадии образования закиси азота (pp. Pseudomonas, Aquaspirillum, Azospirillum) (Ingraham, 1981; Zumft, 1990). Следует отметить, что приведенное разграничение весьма условно, так как один и тот же организм в зависимости от условий может, по-видимому, осуществлять полный или "укороченный" процесс нитратного дыхания.
Большинство почвенных бактерий, по всей видимости, способно к денитрификации, но при этом используют разнообразные пути неполного восстановления. Процесс денитрификации, протекающий с образованием N20 , обычно осуществляется в условиях более маргинальных относительно продуцирования N2 (например, низкая температура, высокая кислотность, присутствие кислорода). Таким образом, N20 является преимущественным продуктом реакции при крайних (маргинальных) условиях.
Некоторые бактерии могут получать энергию, используя нитраты для окисления неорганических соединений, например S"2 , Fe+2 (т.н. автотрофная денитрификация). Это может происходить там, где нитраты поступают в зоны, богатые сульфидом железа (Каравайко, 1984). Тем не менее, гетеротрофная денитрификация рассматривается как один из наиболее важных источников закиси азота в почвах.
Денитрификация считается бактериальным процессом, однако способность образовывать закись азота присуща многим грибам (Bleakley, Tiedje, 1982; Shoun et al., 1992). Выделение закиси азота грибами в условиях пониженой концентрации кислорода связано с функционированием цитохрома Р-450 dNir, отличающегося от бактериального: 1) по количеству активных центров (один, вместо трех); 2) по способности акцептировать электроны с NADH (т.е. не участвует в дыхательной цепи); 3) по месту локализации (не связан с мембраной) (Nakahara et ai., 1993). Таким образом, способность к истинной денитрификации у грибов следует считать не доказанной. Об этом свидетельствует также отсутствие влияния ацетилена на активность образования закиси азота грибами (Пахненко, 1999). Этот процесс можно рассматривать с т.з. эволюции митохондрий, как приспособление грибов к детоксикации нитритов, накапливающихся в процессе гетеротрофной нитрификации. Способность осуществлять гетеротрофную нитрификацию очень широко распространена среди почвенных микромицетов. Указанные особенности позволяют объяснить низкую активность выделения закиси азота грибами - на несколько порядков ниже по сравнению с денитрифицирующими бактериями (Кураков с соавт., 1997). По-видимому, этот источник закиси азота в почвах следует рассматривать как малозначимый.
Способность к диссимиляционному восстановлению нитратов в аммоний (ДВНА) широко распространена среди почвенных бактерий (Stepanov, Ignatov, 1993). Часто этот процесс сопровождается выделением закиси азота: N20 N03" N02" -- NH4+
С физиологической т.з. ДВНА рассматривается как сток электронов в условиях избытка окисляемого субстрата (органического вещества) и недостатка акцепторов электронов (кислорода). Предполагается, что этот процесс является способом детоксикации нитритов, образующихся в результате восстановления нитратов. Это предположение подтверждается тем, что АТФ образуется только на первом этапе реакции, а затем нитрит служит акцептором электронов и восстанавливается до аммония без синтеза АТФ. Наиболее активно ДВНА обычно протекает в переувлажненных почвах при соотношении C/N 20 (Kester, 1997).
В нижних горизонтах почв (подстилающих породах) отсутствие или недостаток разлагаемого органического материала может стать причиной, ограничивающей процесс гетеротрофной денитрификапии. В этих условиях следует ожидать протекания хемоденитрификации - абиогенного источника закиси азота. Нитриты могут вступать в реакцию с органическими компонентами, например, с аминокислотами, образуя N2O (Bremner, Blackmer, 1980). Закись азота может выделяться в реакциях между NO2" и некоторыми солями железа и меди (Granli, Bockman, 1994). Такие процессы, по всей видимости, имеют низкую скорость и могут протекать в подземных водах.
Нитрификация - процесс аэробного окисления восстановленных (аммоний, мочевина) и слабоокисленных (нитриты) соединений азота, осуществляемый хемолитотрофными и гетеротрофными микрооргангизмами. Автотрофные нитрификаторы используют углекислый газ в качестве источника углерода и получают энергию за счет окисления NH4+. Автотрофная нитрификация осуществляется в две фазы:
1. N1V + 0,5 02 = N02" + 2Н+ + Н20, где промежуточным продуктом реакции являются NH2OH и N20. Далее нитрит окисляется до нитрата (вторая фаза нитрификации).
2. N02" + 0,5 02 = N03"
Механизм образования закиси азота в процессе нитрификации является предметом дискуссии. Сейчас все более широко признается, что, вероятно, оба процесса ответственны за его образование (Groffman, 1991), а именно:
- бактерии, окисляющие аммоний, могут использовать N02" в качестве альтернативного электродного акцептора, когда мало кислорода и при этом продуцируется N20 (Abeliovich, 1987; 1992; Bock et al, 1995). Поэтому этот процесс принято называть "нитрификационной денитрификацией"
- промежуточные продукты реакций между NH/ и N02" (гидроксиламин) могут химическим путем разложиться до N20, особенно в кислых условиях среды (по типу хемоденитрификации).
Проведение полевых, вегетационных и лизиметрических исследований
Изучение влияния минеральных удобрений на процессы образования и поглощения закиси азота в почвах проводили в вегетационных опытах кафедры агрохимии факультета почвоведения МГУ на дерново-подзолистой слабо- и среднеокультуренной почве. Агрохимическая характеристика почв приведена в табл. 2. Изучение динамики денитрифицирующей активности почвы осуществляли в течение двух вегетационных периодов под посевами ячменя (сорт Московский-121) и тимофеевки (Phleum pratense) при внесении различных минеральных удобрений.
В первый год исследования азотные удобрения вносили по схеме 1 (табл. 3). На второй год проводили исследования по расширенной схеме 2 (табл.3) с использованием в качестве азотных удобрений, кроме мочевины и мочевино-формальдегидного удобрения (МФУ), нитрата кальция и хлористого аммония. Во всех вариантах опыта азотные удобрения вносили сбалансированно с фосфорно-калийными.
Растения выращивали в стандартных сосудах емкостью 6,9 и 30 кг почвы. На дно сосудов помещали слой гранитной крошки, сообщающейся с атмосферой стеклянной трубкой (для лучшего газообмена) и набивали почвой по общепринятой методике.
Изучение влияния гербицидов на дешт ифицирующую активность почв проводили в полевом опыте на дерново-луговой легкосуглинистой среднеокультуренной почве (рН - 5,6; гумус -2,1%) на опытных участках кафедры земледелия факультета почвоведения МГУ (Московская обл., Звенигородский район, территория биостанции МГУ). Изучение динамики денитрифицирующей активности вели в образцах, отобранных в течение вегетационного периода под посевом овса. Весной после вспашки участка и боронования проводили разбивку делянок и посев овса. Через два дня вносили гербициды по схеме (табл. 4). Смешанные образцы почв (из трех точек на делянке) отбирали до внесения гербицидов, сразу после внесения и на 5, 15, 30, 60 и 90 сутки.
Исследования проводили в течение двух вегетационных периодов (1998-1999 гг.) на лизиметрах опытной станции ВНИПТІІХИМ (внутренний диаметр 1м) с дерново-подзолистой среднесугликистой почвой, засеянной кукурузой. Мощность почвенного слоя в лизиметрах составляла 0,5 м (серия лизиметров I) и 1м (серия лизиметров II). В серии лизиметров I (всего 12, по 3 на каждый вариант) удобрения вносили по следующей схеме:
1. Контроль (без удобрений).
2. Р70К440
3. P70K140N90
4. P70K140N210 Азот вносили в форме аммиачной селитры, фосфор и калий - в составе фосфорно-калийного удобрения (двойной суперфосфат и хлористый калий).
В серии лизиметров II (всего 9 лизиметров, по 3 на каждый вариант) опыт закладывался по схеме:
1. Р70К140
2. P70K140N150
3. P7oKi4oN15onac
Азот вносили в форме аммиачной селитры (вариант 2) или в виде модифицированной цеолитом аммиачной селитры (цеолитоаммиачной селитры) (вариант 3). Фосфор - в составе двойного суперфосфата, калий - в виде хлористого калия. Для анализов в каждом из вариантов отбирали 30 образцов (по 10 проб из каждого лизиметра).
Образцы почвы отбирали ежедекадно, начиная с момента внесения удобрений (до посева) с помощью бура из пахотного горизонта (0-20 см) непосредственно из-под корней растений (ризосферная почва) и из междурядий (неризосферная почва). Определение эмиссии закиси азота из почв. Для проведения анализа отобранные микробуром свежие образцы почвы (20г) в трехкратной повторности при естественной влажности и без внесения дополнительных источников углерода помещали во флаконы (50 мл), закрывали резиновыми пробками и герметизировали стальными зажимами. В часть флаконов вводили по 1 мл ацетилена и через 20 час инкубации проводили анализ газов в лабораторных условиях. Интенсивность образования и поглощения закиси азота оценивали по разнице в скорости накопления N20 во флаконах с ацетиленом (ингибитор редуктазы N20) и без ацетилена.
Для выявления спектра дещприфріщфующих бактерий применяли новый подход, состоящий в последовательном выделении чистых культур денитрифшгирующих бактерий, появляющихся в ходе сукцессии. Использование такого метода позволило расширить родовой спектр бактерий, способных к выделению и поглощению закиси азота. Для инициации сукцессии навеску почвы (5г) помещали в пенициллиновые флаконы и добавляли 1мл раствора глюкозы (2,5 мг/г почвы) и нитрата калия (0,4 мг N(Vr почвы). Влажность почвы доводили до 50% от веса воздушно-сухой почвы. Флаконы герметично закрывали и инкубировали при температуре 27С. Анализ изменения структуры комплекса денитрифицирующих бактерий в ходе сукцессии проводили на 1-е, 7-е, 15-е и 30-е сутки. Для этого готовили почвенную суспензию, которую обрабатывали на ультразвуковой установке (УЗДН-1, 22 кГц, 44 А, 2 мин.). Почвенной суспензией инокулировали серию пробирок с жидкими питательными средами следующего состава (г/л): К2НР04 - 1.6; КН2Р04 - 1; MgS04 - 0.3; NaCl - 0.5; KN03 - 3; дрожжевой экстракт - 0.1; агар-агар - 20. В качестве источника углерода в питательной среде в различных вариантах опыта использовали следующие субстраты: сахароза (10 г/л); крахмал (бг/л), пептон (бг/л). После недельной инкубации при комнатной температуре полученные накопительные культуры высевали на плотные питательные среды соответствующего состава для выделения чистых культур бактерий. Высев проводили чашечным методом в 5-ти кратной повторности. Для ингибирования грибов в питательные среды вносили 50 мг нистатина на 0,5 л среды. Учет проводили через 2 недели культивирования при комнатной температуре. Данные по общей численности бактерий выражали в колоний-образующих единицах (КОЕ) на грамм почвы. Кроме того, проводили дифференцированный учет бактерий разных таксономических групп. Для этого первоначально на каждой чашке выделяли макроморфологические типы колоний и подсчитывали колонии каждого типа. По 3-5 представителей каждого типа колоний выделяли в чистую культуру. Идентификацию выделенных штаммов проводили на основании микроморфологических признаков (форма и размеры клеток, подвижность, особенности цикла развития, образование мицелия, способ деления и обособление клеток, наличие кокковидных клеток в старых культурах, характер образования спор), и физиолого-биохимичсских признаков, руководствуясь определителем Берги (Определитель бактерий Берги, 1997) и методическим пособием (Добровольская с соавт., 1989).
Актиномицеты (стрептомицеты) выделяли из почв методом посева на традиционно используемые среды (Гаузе и др., 1983).
Влияние засоления на процессы образования и поглощения закиси азота в зональных типах почв
Данные по влиянию искусственного засоления на эмиссию закиси азота из каштановой почвы представлены на рис. 17. Под влиянием солей изменилась динамика образования и поглощения N20 в почве. В контроле (без внесения NaCl), а также при минимальной концентрации соли в почве закись азота не накапливалась в газовой фазе, что свидетельствует о ее быстром поглощении денитрифицирующими бактериями. Повышение уровня засоления почвы приводило к постепенному увеличению доли N20 в конечных продуктах денитрификации, причем максимум накопления закиси азота был отмечен при наибольшей концентрации вносимой соли. В этом варианте поглощение N20 практически не наблюдалось, что однозначно свидетельствует о полном ингибировании редуктазы закиси азота. Таким образом, подтверждено высказанное нами ранее предположение, что доминирование закиси азота в конечных продуктах денитрификации в засоленных почвах определяется снижением скорости поглощения закиси азота в этих условиях.
Моделирование процесса засоления в почвах других типов (черноземе и сероземе) показало (рис.18 ), что степень ингибирования солями О-редуктазной активности в почвах разных типов неодинакова. Это определяется разной буферностью почв - т.е. их устойчивостью к засолению. Тем не менее, общая картина изменения состава конечных продуктов денитрификации (N20 и N2) во всех трех почвах была сходной - засоление способствовало возрастанию доли закиси азота в продуктах денитрификации.
Высказанное нами предположение, что доминирование закиси азота в конечных продуктах денитрификации в засоленных почвах связано с ингибированием последнего звена в цепи денитрификации, а именно процесса восстановления закиси азота в молекулярный азот, по-видимому, не распространяется на солончаки содового засоления. В этих местообитаниях обнаружены алкалофильные бактерии, способные активно поглощать закись азота (Сорокин с со-авт., 1996).
В заключение следует отметить, что сульфатно-хлоридное засоление почв не только снижает их хозяйственную ценность, но и способствует торможению процесса денитрификации на стадии образования закиси азота. Учитывая тенденцию аридизации суши, роста площадей, подверженных засолению, можно полагать, что эти процессы помимо уже известных негативных экологических последствий, будут способствовать повышенной эмиссии одного из парниковых газов (закиси азота) из почв в атмосферу.
Особенности образования и поглощения закиси азота в водопрочных агрегатах
Как известно, почвенные агрегаты различаются на водопрочные и неводопрочные, разрушающиеся под действием воды, например, при переувлажнении. При этом агрегаты большого диаметра, как правило, состоят из водопрочных агрегатов меньшего размера, которые в течение длительного времени сохраняют свою форму и являются одним из диагностических признаков почв. Весьма вероятно, что именно водопрочные агрегаты являются основными центрами в почве, где осуществляется процесс денитрификации. С целью выяснения их роли в образовании и потреблении N20 в почвах нами были выделены водопрочные агрегаты из почв разных типов.
Изучение образования конечных продуктов денитрификации в водопрочных агрегатах показало, что сразу после внесения глюкозы основным продуктом денитрификации является закись азота (рис. 47) и лишь через 3-6 суток, в зависимости от типа почвы, содержание ее начинало снижаться и возрастала доля молекулярного азота. Так, концентрация N20 достигала минимального уровня в черноземе и серой лесной почве к 3-5 суткам, а в дерново-подзолистой почве - лишь к 23 суткам. В буроземе закись азота оставалась доминирующим продуктом денитрификации на протяжении всего эксперимента, где на ее долю приходилось не менее 40% от общей величины газообразных потерь азота в процессе денитрификации даже к 25 суткам опыта.
Динамика выделения молекулярного азота из почвенных агрегатов носила иной характер. Так, выделение N2 в течение первых двух-трех суток не наблюдалось ни в одном варианте опыта. Затем, по мере восстановления закиси азота денитрифицирующими бактериями, происходило накопление молекулярного азота в газовой фазе. В черноземе, серой лесной и дерново-подзолистой почвах закись азота полностью восстанавливалась в N2 на третьи, пятые и двадцать пятые сутки, соответственно (рис.47). Исключением являлись образцы бурозема, где закись азота не восстанавливалась до конца и постоянно присутствовала в газовой фазе.
Изучение соотношения продуктов денитрификации - закиси азота и молекулярного азота, выделяющихся из водопрочных агрегатов, показало, что прослеживается четкая зависимость между диаметром агрегатов и составом газообразных потерь азота за счет денитрификации (рис.48). Так, с увеличением размера агрегатов возрастала доля молекулярного азота и сокращалось количество закиси азота в конечных продуктах дешггрификации.
В целом, для водопрочных агрегатов диаметром 0,25-3,0 мм основным продуктом денитрификации была закись азота, в то время как для агрегатов 3-5 мм в диаметре - молекулярный азот (за исключением бурозема). Вероятно, это обусловлено низким значением рН (3,7-4.0), при котором происходит ингибирование редуктазы закиси азота, осуществляющей восстановление N20 до молекулярного азота.
Характерно, что кислая реакция этой почвы, по всей видимости, обусловила и особый характер выделения окиси азота (N0). Как отмечалось, в силу своей высокой активности, окись азота является соединением, регулирующим многие жизненно важные процессы метаболизма шікроорганизмов, растений и животных (Ogden, Moore, 1995). Считается, что в почве она быстро перехватывается микробным сообществом почв и поэтому почти не выделяется в атмосферу (Kester,1997). Как показали результаты наших исследований, выделение N0 наблюдшюсь только из кислых почв - бурозема, причем с увеличением размера агрегатов доля окиси азота сокращалась (рис. 49). В то же время в почвах других типов эмиссию окиси азота нам обнаружить не удалось, даже с использованием очень чувствительного хеми люминесцентного детектора.
Таким образом, можно заключить, что разрушение почвенной структуры или распыление почв будет сопровождаться возрастанием доли закиси азота, а в некоторых случаях и окиси азота в газообразных продуктах денитрификации.
Объяснение этому явлению может состоять в следующем: в мелких агрегатах размер анаэробной зоны настолько мал, что, проходя через нее, закись азота не успевает восстановиться в молекулярную форму и выделяется в атмосферу.
Этот вывод, основанный на данных лабораторных экспериментов, был подтвержден в лизиметрическом опыте ВНИПТИХИМ. Исследуемая дерново-подзолистая почва лизиметров, засеянная кукурузой, на 66% состояла из агрегатов диаметром менее 0.25 мм (рис.50), в то время как агрономически ценной структурой являются агрегаты диаметром 1-3 мм (Воронин, 1986). Наши исследования показали, что процесс деншрификации в этой почве проходил преимущественно до закиси азота, причем внесение азотных удобрений приводило лишь к возрастанию общей активности дешггрификации, в то время как соотношение газообразных продуктов этого процесса оставалось постоянным (рис.51).