Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Черноземы, их свойства, биологическая активность, устойчивость экосистемы черноземов при интенсивном сельскохозяйственном использовании (Обзор литературы, современное состояние проблемы) 8
1.1. Трансформация свойств черноземов и их биологической активности в условиях интенсивного сельскохозяйственного производства 8
1.2. Микроорганизмы, как активный компонент почвы 27
1.3. Метагеном прокариотного сообщества почв 37
ГЛАВА 2. Природные условия и почвенный покров каменной степи 46
ГЛАВА 3. Объекты и методы исследований 52
3.1. Объекты исследования 52
3.2. Методы исследований
3.2.1. Отбор почвенных образцов 61
3.2.2. Определение форм углерода и азота 61
3.2.3. Определение численности микроорганизмов 61
3.2.4. Приготовление препарата почвенной ДНК 63
3.2.5. Проведение количественной ПЦР 63
3.2.6. Секвенирование нуклеотидных последовательностей 65
3.2.7. Обработка результатов секвенирования 65
ГЛАВА 4. Результаты и обсуждение
4.1. Взаимосвязь численности почвенных микроорганизмов эколого-трофических групп и форм углерода и азота 67
4.2. Количественная оценка различных групп микроорганизмов по данным метода ПЦР Real Time 81
4.3. Почвенный метагеном прокариотного сообщества черноземов Каменной Степи 4.4. Сезонная динамика почвенного микробиома агрочерноземов 104
4.5. Анализ биологического разнообразия таксономической структуры микробного сообщества 107
Заключение 112
Основные выводы 113
Список литературы 116
- Микроорганизмы, как активный компонент почвы
- Метагеном прокариотного сообщества почв
- Определение форм углерода и азота
- Количественная оценка различных групп микроорганизмов по данным метода ПЦР Real Time
Введение к работе
Актуальность исследований. Современный практический и теоретический уровень агрохимических исследований, направленный на получении высоких урожаев и оптимального качества растениеводческой продукции, сохраняя при этом экологические функции и «здоровье» почвы, требует нового, более глубокого научного подхода к изучению микробных сообществ агроценозов.
Для почв сельскохозяйственного использования, постоянно испытывающих антропогенные нагрузки, важно знать, как они влияют на интенсивность и направленность микробиологических процессов, причастных к почвенному плодородию (Микробное..., 2001).
Однако, несмотря на достаточно большое количество публикаций по
изучению действия минеральных органических удобрений на
микробиологические процессы в почвах, до настоящего времени остается мало разработанным вопрос о регулирующей и оптимизирующей роли агрохимических средств в гомеостатическом, сбалансированном состоянии микробного сообщества почв агроценоза, жизнедеятельность которого обеспечивает поддержание плодородия агроэкосистем (Верховцева и др., 2006).
Поскольку черноземы представляют собой основной ресурс
высокоплодородных чв России, обладающих высоким уровнем
биологического разнообразия и адаптивного потенциала, исследования влияния интенсивности антропогенной нагрузки, связанной с внесением различных доз минеральных удобрений на изменение состава прокариотного сообщества почв, являются актуальными и могут внести вклад в изучение проблем эволюции и преобразования агрочерноземов.
Ландшафтный стационар «Каменная Степь» служит базовой моделью комплексных и разносторонних исследований вот уже более 100 лет, поэтому представляет интерес использование современных методов для более детального описания определенных свойств и процессов, протекающих в черноземах.
Применение методов молекулярной биологии, частности, изучение количественных показателей компонентов микробного сообщества, а также исследование таксономического состава и оценка биоразнообразия почв, занятых в интенсивном сельскохозяйственном производстве, переводят исследования микробиологических свойств почвы на новый уровень, что
является чрезвычайно актуальным и важным на современном этапе. Кроме того, преимуществом молекулярных-генетических методов вляется учт микроорганизмов, культивирование которых невозможно на элективных средах чашечными методами. Известно, что большую чсть в составе почвенных микроорганизмов составляют именно некультивируемые виды (Metagenomics, 2010; Delmont, 2011) и возможность их изучения появилась только с применением в почвенной микробиологии молекулярных методов (Rondon et al., 1999).
В результате секвенирования и расшифровки последовательностей
структур ДНК всего разнообразия прокариотного сообщества почв, образуется
огромные массивы метаданных. Обработка такого материала входит в область
биоинформатики, является необходимым условием молекулярно-
биологических исследованиях и соответствует мировому тренду развития почвенной микробиологии.
Цель исследований. Оценить влияние минеральных удобрений на трансформацию метагенома прокариотного сообщества интенсивность почвенно-биологических процессов в агроэкосистеме черноземных почв.
Задачи исследований.
-
Исследовать взаимосвязь почвенных микроорганизмов эколого-трофических групп и различных форм улерода и аота в некоторых системах землепользования Каменной Степи.
-
Определить численность прокариотных и эукариотных микроорганизмов по количеству выделенной ДНК методом ПЦР Реал-Тайм в различных вариантах полевого опыта.
-
Описать почвенный метагеном прокариотного сообщества черноземов Каменной Степи методом высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S рРНК; становить коровый (консервативный) и аксессорный (лабильный) компоненты почв, выявить микроорганизмы-индикаторы изменения черноземов под воздействием высоких доз минеральных удобрений.
-
Выявить сезонную динамику таксономической структуры микробного сообщества черноземных почв.
-
Провести анализ нуклеотидных последовательностей ампликонных библиотек и оценить биоразнообразие при длительном применении минеральных удобрений.
Научная новизна. Впервые методами молекулярной биологии получены
данные по составу метагенома прокариотного сообщества черноземных почв с
различной антропогенной нагрузкой, а также проведено исследование
сезонной изменчивости таксономической структуры микробиомов при
помощи секвенирования гена 16S рРНК. Выявлены семейства-маркеры,
характеризующие пахотные почвы, внесение удобрений, а также особенности
почв залежи. Впервые показано присутствие корового (консервативного) и
аксессорного (лабильного, связанного почвенными процессами или
условиями среды обитания микроорганизмов) компонентов черноземных
почв. Методом qPCR-Real Time дана количественная оценка отдельных
филогенетических групп почвенных микроорганизмов (бактерий, архей,
микромицетов) в черноземных почвах различных систем землепользования.
Методами классической микробиологии выявлена связь некоторых форм
углерода азота с физиологическими группами микроорганизмов в
агрочерноземах Каменной Степи и почвенно-биологическими процессами, проводимых ими.
Практическая значимость. Работа удостоена премии Правительства РФ 2015 года в области науки и техники для молодых ученых.
Показатели численности эколого-трофических групп микроорганизмов
могут характеризовать почву, занятую в сельскохозяйственном производстве,
с точки зрения ее «здоровья», экологической устойчивости. Выявленные с
использованием высокопроизводительного секвенирования генов 16S рРНК
семейства-маркеры могут быть использованы для идентификации процессов
восстановления почвы ее биоразнообразия после вывода из
сельскохозяйственного производства, идентификации агрочерноземов, а также внесения минеральных удобрений.
Апробация. Материалы диссертации были представлены на конференциях: «Экология и биология почв» (Ростов-на-Дону, 2007, 2014), «V съезд Всероссийского общества почвоведов им. В.В. Докучаева» (Ростов-на-Дону, 2008), «Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием к 85-летию Почвенного института им. В.В. Докучаева» (Москва, 2012), «Современное состояние чернозёмов» (Ростов-на-Дону, 2013); "Современные методы исследований почв и почвенного покрова» (Москва, 2015); на международных конференциях: «Европейский союз наук о Земле, Генеральная Ассамблея» (Австрия, 2013, 2014, 2015), 9-й Международный
конгресс почвоведов «The Soul of Soiland Civilization» (Турция, 2014), 13th symposium on bacterial genetics and ecology (Италия, 2015), «Генетическая интеграция про- и эукариот: фундаментальные исследования и современные агротехнологии» (Санкт-Петербург, 2015).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 4 статьи в журналах рекомендованных ВАК для опубликования основных научных результатов диссертации.
Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 143 страницах, содержат 12 таблиц, 25 рисунков. Работа состоит из введения, литературного обзора, главы «Природные условия и объекты исследования», главы «Объекты и методы исследований», пяти экспериментальных глав, заключения и выводов. Список литературы включает 249 источников, в том числе 121 зарубежных.
Автор выражает благодарность Кутовой О.В., Фриду А.С., Хитрову Н.Б., Холодову В.А., Чернову Т.И. за организацию полевых исследований, помощь в анализе результатов и конструктивную критику.
Микроорганизмы, как активный компонент почвы
Микробное сообщество быстро адаптируется к условиям окружающей среды и, тем самым может их характеризовать. Кроме того, показано, что биологические и биохимические свойства почвы чувствительны к незначительным изменениям, происходящим в почве под действием любых агентов (Nannipieri et al., 1990; Yakovchenko et al., 1996). Таким образом, микробное сообщество почвы играет ключевую роль в ее функционировании и может служить индикатором устойчивости экосистем, в том числе при различных антропогенных нагрузках.
Микробная биомасса составляет лишь несколько процентов от содержания органического углерода почвы, но это «ушко от иголки» (Jenkinson., 1977), через которое проходит весь органический материал, поступающий в почву. Содержание микробной биомассы в почвах зависит от их физико-химических свойств, климатических и гидротермических условий, растительности, а также внесенных веществ. Поэтому такой показатель как содержание микробной биомассы используют часто как наиболее чувствительный индикатор изменения окружающей среды (Anderson, Domsch, 1986; 1989; Jordan et al., 1995; Hargreaves et al., 2003), качества почвы (Gil-Sotres et al., 2005), в том числе и под действием антропогенных факторов (Jenkinson., 1977; Diaz-Ravina et al., 1988; Wardle, 1992; Martens, 1995), и продуктивности растений (Nogueira et al., 2006). Некоторые исследователи отмечают, что живая часть органического углерода почвы, микробная биомасса, является более чувствительной к различным воздействиям и нарушениям, чем органическое вещество в целом (Powlson, Jenkinson, 1981;
Anderson, Gray, 1989; Wardle, 1992; Powlson, 1994). Исследования показывают тесную зависимость между почвенным плодородием, микробной биомассой, содержанием органического углерода, скоростью разложения органического вещества и минерализацией азота (Smith, Paul, 1990; Carter et al., 1999; OECD, 2003). Активность микробного сообщества так же широко используют в качестве индикатора устойчивости почв к внешним воздействиям (Bezdicek et al., 1996; Seybold et al., 1999).
Для микробиологических процессов в почвах отмечают высокую пространственную вариабельность (Богоев, Гильманов, 1982; Зайцева, Звягинцев, 1978; Ruess, Seagle, 1994; Saetre, 1999; Yan et al, 2003)
Рядом исследователей (Кононков, Умаров, 1982; Разгулин, 1995) отмечалась большая пространственная изменчивость активности азотфиксации в естественных условиях. Авторами отмечено, если в момент определения азотфиксация была на высоком уровне, то она, как правило, была высокой на всех опытных площадках и, наоборот, при спаде ее активности она везде имела низкие показатели, что позволяет при рассмотрении динамики активности азотфиксации пользоваться средними значениями.
При использовании обобщенной линейной регрессии для создания карты пространственной организации микробных сообществ было показано, что распределение бактерий может быть хорошо структурировано, что представляется возможным на относительно однородном участке пашни (Franklin, Mills, 2003). Также авторами отмечается разноплановое распределение отдельных представителей микробного сообщества, что связано с гетерогенностью почвы и многообразием индивидуальных откликов бактерий на неоднородность почвенных микросред.
В некоторых исследованиях наряду с горизонтальной неоднородностью изучалось вертикальное распределение бактерий и рассматривались показатели структуры сообщества. Анизотропность распределения миркоорганизмов, связанная с горизонтальной локализацией, была гораздо менее выражена, чем с вертикальной. Таким образом, авторы отмечают иерархию пространственных масштабов в организации микробного сообщества и подчеркивают влияние различающихся экологических параметров в вертикальном распределении по сравнению с горизонтальным (Franklin et al., 2002; najdr et al., 2008). Многие исследователи показали значительное влияние типа растительности на пространственную вариабельность состава микробного сообщества, за счет чего возникает возможность контролировать и управлять биологическим разнообразием почвы, занятой под пастбища (Sayer et al., 2013; Buckley, Schmidt, 2001; Lauber et al., 2008). Также есть предположение, что пятнистое распределение микромицетов в почве может поддерживать пространственную неоднородность растительности путем создания локальных точек доступных ресурсов и установления взаимодействия в системе почва-микромицеты-растения (Ettema, Wardle, 2002; Reynolds et al., 2003). Распределение грибной биомассы по генетическим горизонтам А.Д. Железова с соавторами (Железова и др., 2015) также объясняют трофической связью микромицетов с подземной корневой массой древесных растений, отсутствием конкурентов за трофические ресурсы в нижних почвенных горизонтах, а также возможной консервацией ДНК грибов из-за низкой интенсивности биологических процессов.
Одной из причин вертикальной неоднородности биогенности почвенного профиля может быть изменение водно-физических свойств, в частности, уменьшение с глубиной черноземных почв количества внутриагрегатной капиллярно-подвешенной и увеличение пленочно-подвешенной влаги (Королев и др., 2012; Шеин и др., 2012).
Многие авторы показали вертикальную неоднородность биологической активности в лесной почве и кумуляцию грибной биомассы в подстилке и верхней части горизонта А (najdr et al., 2008; Fierer et al., 2003; Baldrian et al., 2013). Верхние горизонты (L) содержали в 4 раза больше микробной биомассы и в 7 раз больше грибной биомассы по сравнению с нижними горизонтами (H), в то время как количество актиномицетов с глубиной увеличивалось (najdr et al., 2008). Некоторые исследователи отмечали равномерное распределение грибных спор и ДНК микромицетов по профилю серой лесной почвы (Железова и др., 2015; Полянская и др., 1995). Внеклеточные лигниноцеллюлозо-разрушающие ферменты, ответственные за превращение органического вещества в лесных почвах, преимущественно локализовались в верхней части горизонта Н (najdr et al., 2008).
Пространственно-временная пятнистость в почвенной среде, как полагают Martirosyana с соавторами (Martirosyana et al., 2013), имеет решающее значение для поддержания биоразнообразия почвы, обеспечивая различные микросреды обитания, которые тесно переплетаются для совместного использования ресурсов.
Таким образом, пространственный подход к экологии почв может позволить идентификацию факторов, которые управляют неоднородностью населения и деятельностью почвенных организмов в различных масштабах. Кроме того, появляется все больше доказательств, что пространственная экология почвы может привести к новому пониманию факторов, которые поддерживают и регулируют биоразнообразия почв, а также о том, как пространственное распределение почвенных организмов влияет на рост растений и структуру растительных сообществ.
Метагеном прокариотного сообщества почв
Много копролитов, горизонт рыхлый, не вскипает. Переход заметный по сложению, граница ровная. AU, 30-50 см. Зернистая структура собранная в призмовидные непрочные отдельности, есть корни, в том числе вертикальные ходы. AUB, 50-65(67) см. По окраске на срезе приобретает буроватый оттенок на срезе (10YR 3/1), внешние грани - 2/1. Встречаются редкие кротовины, корни, ходы, в том числе вертикальные (d = 3-7мм.). Переход резкий по вскипанию, граница слабоволнистая. AUBCazoo, 65(67)-84 см. Неоднородный по цвету за счет ходов, заполнен разным материалом: черным, желто-бурым, бурым и смешанным. Степень зоогенной обработки – 70%. Вскипает бурно. Выделений карбонатов практически нет, за исключением лабильных прожилок карбонатов в кротовинах. BCAmc, 84-100(105) см. Окраска во влажном состоянии - 7,5YR 5/4, в сухом 10,5YR 7/4. Глинистый, свежий, структура призматическая. Карбонаты в виде прожилок, бурное вскипание, вертикальная цилиндрическая скважность d=0,5-1 мм. Кротовины, заполненные серым материалом. Открытые вертикальные ходы d=6-8 мм. Встречаются трещины, заполнены темным материалом, переход постепенный по обилию карбонатного мицелия и появлению примазок. BCAmcq, 100(105)-155 см. Отличие от предыдущего в мелких бурых примазках 0,25-0,5 мм., в наличии кротовин и часто встречающегося мицелия. Химические показатели исследуемых объектов представлены в табл.1. Таблица 1 Основные агрохимические свойства исследуемых почв Каменной Степи Почвы Землепользов ание, дозы удобрений С орг, % рНводн. Nобщ.% Р2О5 мг/кг К2О Ca2+мг/кг ммольэкв/100 г Mg2+ммольэкв/100г Агрочернозем сегрегационный глубоко квазиглееватый маломощный глинистый на двучленных глинистых отложениях NPK-0 3,90 7,0 0,48 5,6 7,4 25,47 3,51 NPK средние дозы 3,91 6,9 0,49 17,8 12,1 24,8 3,65 NPKповышенныедозы 3,95 7,0 0,46 16,8 7,6 23,8 3,66 Чернозем миграционно-мицелярный постагрогенный глубоко квазиглееватый среднемощный глинистый на лессовидных глинах Залежь с 1882г. 3,82 7,0 0,43 46 16,5 32,5 7,5
Агрохимический опыт, на котором были отобраны образцы, заложен на территории стационара осенью 1991 года на трех фонах обеспеченности чернозема обыкновенного элементами минерального питания (среднем, повышенном и высоком) с целью изучения влияния насыщения севооборота рекомендованными нормами удобрений под культуры и фосфогипса, внесенного в запас с мелиоративными целями (Эффективность…, 2005). Факториальная схема проведения исследований представлена в табл. 2. Таблица 2 Факториальная схема проведения исследований (Эффективность…, 2005) Фактор А (уровни обеспеченности почвыэлементами минерального питания) Фактор В (применениекальцийсодержащегомелиоранта) Фактор С (уровни удобренности севооборота) 1. Средний2. Повышенный3. Высокий 1. Без мелиоранта2. С мелиорантом(фосфогипс) 1. Без удобрений2. Под 1 культуру3. Под 5 культур4. Под все культуры Опытный участок был разбит на десять полей для одновременного развертывания в пространстве всех культур 10-польного севооборота. На каждом опытном поле в 4-кратной повторности путем внесения в запас расчетных норм азотных, фосфорных и калийных удобрений были сформированы три уровня обеспеченности почвы элементами минерального питания (УОПЭП): средний, повышенный и высокий. На среднем уровне обеспеченности почвы элементами питания удобрения не вносились. Количество подвижных форм P2O5 и K2O здесь колебалось в пределах 7,5-8,5 и 8,0-8,5 мг/100 г почвы.
При создании повышенного уровня обеспеченности почвы элементами питания в почву было внесено с минеральными удобрениями в запас 200 кг/га азота, 300 кг/га фосфора, и 300 кг/га калия, а создании высокого уровня – соответственно 300 кг/га азота, 600 кг/га фосфора, и 600 кг/га калия.
Таким образом, были сформированы три уровня обеспеченности почвы элементами питания: средний с содержанием подвижного фосфора около 8 мг, повышенный – около 12 мг и высокий – около 16 мг на 100 г почвы и соответствующих количеств азота и калия.
Площадь делянок первого порядка составляет 320 м2 (20 м 16 м). Между ними на каждом поле предусмотрены 2-х-метровые защитные полосы.
Вторым фактором 3-х-факторного опыта является фосфогипс в почве с разным уровнем обеспеченности почвы элементами минерального питания и при различных УУС (уровни удобренности севооборота) минеральными удобрениями. В схеме 2 варианта: без внесения и с внесением фосфогипса из расчета 3 т/га.
Площадь делянок второго порядка составляла 160 м2 (10 м 16 м). Третий фактор, изучение которого осуществляется в опыте, – уровни удобренности почвы севооборота минеральными удобрениями. В схему включено четыре варианта с числом удобряемых культур в севообороте, равным 0, 1, 5 и 10 (табл. 2). При этом под каждую культуру вносились рекомендуемые нормы удобрений (табл. 3). Площадь делянок третьего порядка составляла 40 м2 (10 м 4 м). Площадь учетных делянок – 20 м2 (10 м 2 м). Таблица 3 Нормы применения удобрений и уровни удобренности севооборота (УУС) (Эффективность…, 2005). Севооборот Варианты УУС 1-й 2-й 3-й 4-й Горох 0 0 0 N30P60K40 Озимая пшеница 0 0 N6oP6oK4o N6oP6oK4o Сахарная свекла 0 NIOSPIOSKJOS NIOSPIOSKJOS NIOSPIOSKJOS Ячмень 0 0 0 NeoPeoKeo Кукуруза на зерно 0 0 NeoPeoKeo NeoPeoKeo Горох 0 0 0 NsoPeoKeo Тритикале 0 0 N60P60K40 N60P60K40 Просо 0 0 0 N40P40K40 Ячмень 0 0 0 NeoPeoKeo Кукуруза на зерно 0 0 NeoPeoKeo NeoPeoKeo УУС (среднее на 0 Nio.5Pl0.5K10.5 N34.5P34.5K3o.5 N56.5P62.5K58.5 культуру) NPK на культуру 0 31,5 99,5 177,5 Отбор образцов произведен весной 2006 и весной 2007 года с опытных делянок со средним уровнем обеспеченности почвы элементами минерального питания (данный УОПЭП идентичен природному уровню обеспеченности почвы), без внесения мелиоранта, на контрастных по уровню удобренности севооборота вариантах: 1 – без внесения удобрений; 2 – N10.5P10.5K10.5; 4 – N56.5P62.5K58.5.
Весной 2012 и 2013, весной, летом и осенью 2014 года для описания почвенного метагенома и выявления сезонной динамики таксономической структуры прокариотного сообщества черноземных почв под влиянием длительного применения минеральных удобрений были отобраны образцы с полевого опыта, заложенного на территории отдела кормопроизводства ФГБНУ НИИСХ им. В.В. Докучаева.
Опыт был заложен в 1981 с целью разработки мероприятий по повышению продуктивности кормовых культур с учетом сохранения плодородия обыкновенного чернозема в условиях юго-востока ЦЧЗ (центральной черноземной зоны) и изучению агромелиоративных приемов на урожайность культур и качество продукции в 7-польном кормовом севообороте:
Определение форм углерода и азота
При сравнении таксономической структуры микробного сообщества залежи и агрочерноземов на данном филогенетическом уровне было выделено несколько групп семейств микроорганизмов-индикаторов, которые мы относим к аксессорному компоненту. Аксессорный компонент почвенного микробиома, вероятно, связан с условиями среды обитания микроорганизмов и, возможно, именно среди таксонов аксессорного компонента будут найдены микроорганизмы-индикаторы почв, процессов или условий.
В первую группу вошли семейства, доля которых уменьшается в пахотных почвах по сравнению с почвой косимой степи (залежь) (рис. 19).
Микроорганизмы-индикаторы почв залежи (уменьшение доли встречаемости в пахотных почвах по сравнению с почвами залежи). В первую группу вошли семейства: Conexibacteraceae, Patulibacteraceae, Hyphomicrobiaceae, Syntrophobacteraceae, EB1017 и неатрибутируемые семейства филумов Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria. По долевому участию этих семейств в функционировании сообщества почвенных микроорганизмов можно говорить об агрогенном воздействии на почву (в случае уменьшения их доли) или восстановления почвы после выведения ее из сельскохозяйственного оборота (в случае увеличения их доли).
Ко второй группе мы отнесли семейства, доля которых в залежных почвах меньше чем в пахотных (рис. 20). %
Микроорганизмы-индикаторы почв, занятых в сельскохозяйственном использовании (увеличение доли в пахотных почвах по сравнению с почвами залежи).
Вторая группа представлена семействами: Geodermatophilaceae, Micrococcaceae, Rhodospirillaceae, Sphingomonadaceae, Ellin5301 и неатрибутируемые семейства филумов Acidobacteria, Gemmatimonadetes. Все семейства принадлежат только к четырем филумам: Acidobacteria, Actinobacteria, Gemmatimonadetes и Proteobacteria, при этом все семейства Gemmatimonadetes вошли в состав исключительно второй группы. Бактерии, принадлежащие к типу Gemmatimonadetes, представленные 3-мя семействами и наибольшим относительным содержанием, являются обычными в почвах и составляют примерно 2% от почвенных бактериальных сообществ (Janssen, 2006), однако наиболее часто встречаются именно в пахотных почвах. В исследуемых нами почвах их относительное содержание было максимальным в пахотных почвах с внесением высоких доз минеральных удобрений и составило 4,34%. Использование технологии Noill (или прямой посев) приводит к уменьшению относительного содержания Gemmatimonadetes в образцах (Fawaz, 2013). При этом традиционная система земледелия инициирует их развитие (DeBruyn et al., 2011). Кроме того, ДеБрейн с соавторами (DeBruyn et al., 2011) отмечала адаптивность Gemmatimonadetes к низкой почвенной влажности, что является актуальным на территории Каменной Степи.
Микроорганизмы второй группы являются «антагонистами» бактерий из группы 1: увеличение численности одних приводит к уменьшению численности других, и наоборот. Прямой корреляционный анализ, представленный в табл. 8, показал обратную зависимость их относительного количества.
Таки образом, комплексный анализ долей прокариот первой и второй групп позволит делать заключения о сельскохозяйственном использовании почв и/или стадии восстановления природного сообщества после перевода почвы под залежь. Таблица 8
Коэффициент корреляции (R) между долевым участием в сообществе микроорганизмов первой и второй группы (микроорганизмы-индикаторы сельскохозяственного использования почвы) .
Микроорганизмы-индикаторы внесения минеральных удобрений (уменьшение в вариантах с внесением удобрений по сравнению с почвами контрольного варианта и почвами залежи). уменьшается только в вариантах с удобрениями, может считаться индикатором внесения минеральных удобрений. Однако уменьшение численности этих семейств в микробном сообществе не пропорционально дозам внесения удобрений, поэтому невозможно говорить об интенсивности антропогенного воздействия. Можно лишь констатировать, что на данные семейства внесение минеральных удобрений влияет негативно.
Микроорганизмы, негативно реагирующие на внесение минеральных удобрений принадлежат к следующим семействам: AKIW874, Solirubrobacteraceae, Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae, Gaiellaceae и NA семейство порядка Myxococcales. В четвертую группу вошли семейства, доля сиквенсов которых увеличивается только в вариантах с удобрениями (рис. 22). 20,63 p_Bacteroidetes; p_Firmicutes; p_Firmicutes; p_Crenarchaeota; c_[Saprospirae]; с Bacilli; с Bacilli; c_Thaumarchaeota; o_[Saprospirales]; o_Bacillales; o_Bacillales; o_Nitrososphaerales; f_Chitinophagaceae f_ f_Bacillaceae f_Nitrososphaeraceae NPK-0 NPK-60 NPK-120 Залежь Рис. 22. Группа 4: Микроорганизмы-индикаторы внесения минеральных удобрений (увеличение в вариантах с внесением удобрений по сравнению с почвами контрольного варианта и почвами залежи). Микроорганизмы-индикаторы позитивного влияния минеральных удобрений относятся к 3-м семействам бактерий: Chitinophagaceae, Bacillaceae, и неатрибутируемое семейство филума Firmicutes. Кроме того, в состав этой группы вошли архей из филума Crenarchaeota, принадлежащие к семейству Nitrososphaeraceae. Доля архей в этом списке значительно выше, что связано с их экологической функцией в процессах азотного цикла. Археи осуществляют азотный цикл как в процессах ассимиляции азота – усвоение нитратов, фиксации N2, так и обратные процессы – такие как нитратное дыхание и денитрификация (Cabello et al., 2004). Звено азотного цикла, связанное с окислением аммиака, также может проходить с участием архей, к которым относится обнаруженное нами семейство Nitrososphaeraceae. Они способны продуцировать нитриты, которые окисляются другими микроорганизмами в нитраты, а те, в свою очередь, потребляются растениями (Leininger et al., 2006). Возможно, именно с метаболизмом неорганического азота архей связана высокая биологическая активность варианта с внесением средних доз минеральных удобрений. Бактерии филума Firmicutes обнаружены нами только в составе 4-ой группы, относительная доля которых составляет до 8%. Это, вероятно связано с тем, что большинство фирмикут образуют споры, основной функцией которых является обеспечение выживания бактерий в периоды высокой нагрузки на окружающую среду (Teixeira et al., 2010), что в нашей работе представляет сельскохозяйственное использование почвы с внесением минеральных удобрений.
Прокариотные организмы 4-ой группы являются «антагонистами» группы 3, поскольку количество их сиквенсов в микробном сообществе обратно пропорционально; внесение удобрений действует отрицательно на микроорганизмы из группы 3 и благоприятно из группы 4. Корреляционный анализ, результаты которого представлены в табл. 9, показал четкую обратную зависимость (от R = – 0,79 до R = – 0,99) численности микроорганизмов 3 и 4 групп.
Количественная оценка различных групп микроорганизмов по данным метода ПЦР Real Time
Несмотря на то, что в некоторых исследованиях отмечается падение микробиологической активности и численности бактерий при длительном сельскохозяйственном использовании чернозема (Даденко и др., 2014; Хасанова и др., 2014), микробное разнообразие при этом, по видимому, практически не меняется. Другими авторами (Suleiman et al., 2013) также отмечается отсутствие различий в биологическом разнообразии прокариотного сообщества между близко расположенными участками разного землепользования при имеющихся различиях в филогенетической структуре сообществ. Таким образом, по индексам биологического разнообразия не выявлено значительных отличий как по вариантам опыта, так и по системам землепользования черноземных почв. Однако зафиксирована тенденция увеличения значений индексов биоразнообразия в период активной вегетации растений – лето и осень по сравнению с весенними образцами во всех вариантах опыта.
Оценка бета разнообразия (схожесть сообществ). Результаты анализа weighted UniFrac представлены в виде трехмерной диаграммы по методу главных компонент (рис. 25), маркерами отмечены микробиомы конкретных образцов, расстояние между маркерами соответствует различию филогенетической структуры микробиомов. Проанализированные микробиомы заметно различаются по сезонам, причем осенние образцы ближе к весенним, чем летние. Это свидетельствует о том, что сезонные различия микробиомов – не просто постепенные временные изменения, а влияние экологических факторов, приводящее к перемене филогенетической структуры прокариотных сообществ. Так как сезонный сдвиг в одинаковой степени выражен и для микробиомов поля, и для микробиомов залежи, логично предположить, что он вызван общими для двух систем землепользования факторами. Учитывая, что осенние образцы на диаграмме ближе к весенним, чем летние, этими факторами, предположительно, являются влажность и температура (в весенний и осенний периоды влажность почвы повышена за счет продуктивной влаги весенних талых вод и осенних осадков, средняя ежемесячная температура в эти периоды ниже летней, также весной и осенью снижена испаряемость по сравнению с летними месяцами). Необходимо, однако, отметить, что осадки и температура могут влиять на микробные сообщества опосредованно – через изменение pH, ОВП (окислительно-восстановительного потенциала), доступности питательных веществ и других факторов активности почвенных микроорганизмов. Также отмечается четкое разделение микробиомов залежи и поля (крупные и мелкие маркеры на рис. 25), показывающее, что тип землепользования существенно влияет на структуру микробного сообщества.
Анализ схожести микробиомов по методу weighted UniFrac, трехмерная диаграмма по методу главных компонент (три главные компоненты, объясняющие 51, 14 и 8 % вариабельности соответственно).
Микробиомы разных сезонов разделяются преимущественно по оси первой главной компоненты (объясняющей 51% вариабельности), а микробиомы пахотных и залежных почв – по второй (объясняющей 14% вариабельности), то есть, различия структуры прокариотных микробиомов в разное время года оказались более значительными, чем различия между системами землепользования. Примечательно, что анализом UniFrac практически не выявляются различий между образцами пахотных почв с внесением разных доз и без внесения минеральных удобрений – эта разница оказывается трудноотличимой от естественной неоднородности между повторностями. Ранее проведенное исследование на данном агрохимическом опыте, касающееся сравнения общей концентрации ДНК и численности различных групп культивируемых микроорганизмов (Tkhakakhova et al., 2014) также продемонстрировало крайне малую дифференциацию опытных площадок по этим параметрам. Хотя в похожих исследованиях отмечается влияние внесения минеральных удобрений на структуру микробиома, в частности, на филум Actinobacteria (Pan et al., 2014). Вероятно, это связано с высокой буферностью и высоким адаптивным потенциалом черноземов. В данном опыте, даже учитывая его 30-летнюю историю, внесение удобрений является гораздо менее значимым фактором структуры микробиома, чем тип землепользования или сезонные климатические изменения.
Микробное сообщество почвы, являясь неотъемлемой и обязательной частью любого биоценоза, в том числе агроценоза, играет ключевую роль в функционировании почвы и может служить универсальным и очень чувствительным индикатором ее состояния, устойчивости экосистем, в том числе при различных антропогенных нагрузках и оптимизации систем земледелия. Использование методов молекулярной биологии и анализ метагенома прокариотного сообщества черноземных почв позволил выявить реальные количественные показатели биогенности почв по выделенной ДНК микроорганизмов различных групп (бактерии, археи, микромицеты), а также тенденции трансформации биогенома при интенсивном использовании агрочерноземов. Результаты, полученные в нашей работе, предполагают дальнейшее развитие исследований, связанных с изучением количественных показателей не только основных групп микробного сообщества почвы, но и их функциональной значимости, то есть изучение функциональных генов.
Методами пиросеквенирования и дальнейшим анализом биоразнообразия микробных сообществ показано наличие корового (общего для различных почв, консервативного) и аксессорного (лабильного, связанного с условиями окружающей среды и процессами в почвах) компонентов микробиомов. На основе аксессорного компонента выделены микроорганизмы-индикаторы сельскохозяйственного использования почв и восстановления почвы после выведения ее из сельскохозяйственного оборота, а также микроорганизмы-индикаторы внесения минеральных удобрений. Таким образом, при анализе таксономической структуры микробного сообщества агрочерноземов можно получить сведения об экологическом статусе исследуемого объекта, его биоразнообразии и, в конечном итоге, о «здоровье» данной почвы, что представляет практический интерес в сохранении черноземов Каменной Степи.