Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Видовой состав, распространенность и вредоносность основных вирусов плодовых и ягодных культур 16
1.2. Методы диагностики вирусных болезней 51
1.2.1. Визуальная диагностика 52
1.2.2. Тестирование на индикаторах 53
1.2.3. Иммуноферментный анализ 59
1.2.4. Полимеразная цепная реакция 64
1.2.5. Электронная микроскопия 68
1.3. Методы оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов 71
1.3.1. Суховоздушная термотерапия 71
1.3.2. Культура меристем 75
1.4. Применение биотехнологических приемов в системе
производства оздоровленного посадочного материала 87
Глава 2. Материалы, методы и объекты исследований . 9 5
2.1. Время и место проведения исследований 95
2.2. Метеорологические условия в годы проведения экспериментов 95
2.3. Объекты исследований 96
2.4. Методика исследований
2.4.1. Методы вирусологических исследований 97
2.4.2. Методы биотехнологических исследований 100
2.4.3. Элементы учета, наблюдений и анализ результатов исследований 101
Глава 3. Анализ распространенности вирусных болезней 103
3.1. Распространенность вирусов на плодовых культурах 103
3.2. Распространенность вирусов на ягодных культурах 123
Глава 4. Изучение вредоносности вирусных болезней 143
4.1. Вредоносность вирусов в условиях открытого и защищенного грунта 143
4.2. Вредоносность вирусов при культивировании растений in vitro 151
Глава 5. Совершенствование методов диагностики вирусов садовых культур .155
5.1. Повышение эффективности индикаторного метода 155
5.2. Оптимизация метода иммуноферментного анализа
5.2.1. Влияние распределения вирусов в органах растений и подбора оптимального вида образца на результаты диагностики 160
5.2.2. Выявление оптимальных сроков тестирования 176
5.2.3. Повышение чувствительности ИФА путем подбора экстрагирующего буфера 185
5.3. Применение метода полимеразной цепной реакции 190
Глава 6. Совершенствование методов оздоровления садовых растений от вирусных болезней 201
6.1. Особенности сортовой устойчивости при проведении суховоздушной термотерапии 202
6.2. Зависимость эффективности оздоровления методом культуры меристем от величины экспланта 204
6.3. Повышение эффективности оздоровления от вирусов при сочетании термотерапии и культуры меристем 211
6.4. Использование экологически безопасных препаратов при оздоровлении методом хемотерапии 215
6.5. Разработка метода магнитотерапии in vitro для оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов 224
Глава 7. Ускоренное размножение оздоровленных растений in vitro 245
7.1. Совершенствование минерального состава питательной среды 245
7.1.1. Оптимизация питательной среды для размножения с использованием методов математического моделирования 245
7.1.2. Концепция повышения эффективности микроразмножения на основе чередования питательных сред 263
7.1.3. Оптимизация состава питательной среды для укоренения на основании листовой диагностики 270
7.2. Совершенствование органического состава питательной среды 274
7.2.1. Действие углеводов и заменителей агар-агара на эффективность микроразмножения 274
7.2.2. Влияние регуляторов роста на регенерационную способность эксплантов 288
7.3. Изучение действия физических факторов на ускорение микроразмножения растений 320
7.3.1. Спектральный состав света 320
7.3.2. Магнитно-импульсное воздействие 325
7.4. Повышение адаптационной способности микрорастений в
нестерильных условиях и получение стандартных саженцев 332
Глава 8. Экономическая оценка современных способов тестирования и оздоровления садовых растений 346
Выводы 354
Рекомендации производству 357
Список литературы
- Визуальная диагностика
- Метеорологические условия в годы проведения экспериментов
- Распространенность вирусов на ягодных культурах
- Вредоносность вирусов при культивировании растений in vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. В связи с необходимостью интенсификации садоводства все большее значение приобретает разработка высокоэффективных технологий производства оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур.
В настоящее время в условиях антропогенных систем распространенность и вредоносность вирусов вследствие появления новых штаммов и размножения неоздоровленного посадочного материала, как правило, существенно возрастают (Романенко, Перевертин и др., 2006). Наиболее вредоносные вирусы способны приводить к потерям 20-70 % урожая (Вердеревская, Маринеску, 1985; Clever, Stehr, 1996; Белошапкина, 2005; Лукьянова, 2007). Поэтому анализ распространенности вирусных болезней, прогноз их развития, уничтожение очагов карантинных объектов и создание безвирусного питомниководства плодовых и ягодных культур являются актуальными задачами защиты растений. Видовой состав и распространённость вирусов на груше, рябине, жимолости, ежевике, малине чёрной, малино-ежевичном гибриде, лимоннике, актинидии в условиях России изучены недостаточно, нуждаются в научном обобщении и анализе.
«Концепцией развития аграрной науки и научного обеспечения АПК России до 2025 г.», принятой МСХ в 2007 г., в качестве важной задачи в области защиты растений определено создание новых методов фитосанитарной диагностики. В настоящее время отечественными и зарубежными учеными широкое применение методов молекулярного анализа рассматривается как стратегическое направление эпидемиологии вирусов (Kummert et al., 2001; Балашова, Пивоваров, 2003; Jelkmann, 2004).
При оздоровлении растений от вирусов актуальным является совершенствование методов суховоздушной термотерапии, культуры меристем, хемотерапии, а также разработка новых высокоэффективных способов оздоровления плодовых и ягодных культур от вирусов.
Для успешного оздоровления и последующего микроразмножения растений необходимо совершенствование существующих биотехнологических методов и разработка новых технологических приемов, направленных на увеличение выхода здоровых растений.
Целью исследований является изучение распространенности и вредоносности основных вирусных болезней плодовых и ягодных культур и разработка современной научно обоснованной технологии оздоровления.
Задачи исследований:
1. Определить видовой состав и установить закономерности распространения вирусов на ряде плодовых и ягодных культур в Нечерноземной зоне России.
2. Оценить вредоносность основных вирусов и обосновать необходимость оздоровления посадочного материала.
3. Усовершенствовать основные методы диагностики вирусов (индикаторный метод, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция).
4. Установить закономерности оздоровления садовых растений от вредоносных вирусов.
5. Изучить антивирусную активность фенольных соединений при хемотерапии.
6. Выявить влияние магнитного поля на некоторые вирусы растений.
7. Изучить действие различных факторов на регенерационные процессы при ускоренном размножении оздоровленных растений.
8. Оценить экономическую эффективность получения здорового посадочного материала с применением разработанной технологии.
Методология исследований заключается в поиске путей решения проблемы снижения вредоносности вирусов, разработке оптимальных методов диагностики и комплекса оздоровительных мероприятий, позволяющих на основе использования современных вирусологических и биотехнологических приемов ускорить получение здорового посадочного материала ягодных и плодовых культур.
Научная новизна результатов исследований. Разработана и научно обоснована современная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от основных вредоносных вирусов. Впервые предложена теория оздоровления растений от вирусов, в основе которой лежит постулат о взаимодействии вируса, растения-хозяина и окружающей среды.
Установлены закономерности распространения вирусов разной этиологии в различных насаждениях ряда плодовых и ягодных культур в зависимости от возраста и местоположения плантации, сортовых особенностей, способа размножения и условий выращивания. В результате серомониторинга в Нечерноземной зоне России выявлено широкое распространение вирусных болезней (в среднем от 21 до 51 %) с преобладанием комплекса из 2 (реже из 3-5) вирусов. Впервые дана оценка уровня изменчивости распространенности разных видов вирусных патогенов.
Показано отрицательное влияние латентных вирусов на генеративную продуктивность и биохимические показатели у груши; неповирусов и вируса SLRSV – на генеративную и вегетативную продуктивность ежевики и малино-ежевичного гибрида. Установлено, что некоторые вирусы способны ингибировать процессы органогенеза при микроразмножении и размножении стеблевыми черенками.
Впервые применительно к биологическим особенностям изученных культур усовершенствованы методы диагностики вирусов (индикаторный метод, ИФА, ПЦР) с применением гидроксипроизводного бензойной кислоты (патенты № 2147173, 2389795).
Предложена научно обоснованная концепция оздоровления растений. Определена зависимость эффективности оздоровления от вида вируса, генетических особенностей растений, способа оздоровления, типа и величины инициальных эксплантов. Впервые при использовании культуры тканей доказана возможность увеличения размера апекса до 1 мм без существенного снижения эффекта оздоровления от основных вредоносных вирусов.
Разработан эффективный способ хемотерапии in vitro зараженных вирусами растений с использованием экологически безопасных гидроксибензойных кислот (патент № 2233579).
Впервые предложена концепция магнитотерапии вирусов растений и установлено антивирусное действие импульсного магнитного поля в отношении латентных вирусов на груше, вирусов кустистой карликовости малины и черной кольцевой пятнистости томата – на малино-ежевичном гибриде (патенты № 2277771, 2310318).
Разработаны приемы ускоренного размножения оздоровленного посадочного материала плодовых и ягодных культур на основе концепции чередования питательных сред, оптимизации состава среды, использования экологически безопасных фенольных соединений и регуляторов роста нового поколения, магнитно-импульсной обработки и модификации спектрального состава света.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Специфичность видового состава и закономерности распространения вирусов в насаждениях ряда плодовых и ягодных культур.
2. Преимущества ИФА и ПЦР в современной системе диагностики вирусов.
3. Концепция оздоровления растений с применением биологических, физических и химических методов.
4. Принципы использования фенольных соединений в системе диагностики, оздоровления от вирусов и ускоренного размножения здоровых растений.
5. Научно обоснованные приемы ускоренного размножения плодовых и ягодных культур в системе производства здорового посадочного материала.
Предметом исследований являются закономерности распространения и локализации вирусов в растениях, диагностики вирусных патогенов и оздоровления растений.
Практическая значимость исследований. Разработана современная технология оздоровления плодовых и ягодных культур от основных вредоносных вирусов, включающая инновационные методы диагностики и эффективные вирусологические и биотехнологические приемы получения здорового посадочного материала, что позволяет повысить достоверность диагностики и выявляемость вирусов до 90-100 %, увеличить выход здорового материала в 1,7-2,1 раза на ягодных культурах и в 3,5-10,5 раза на плодовых культурах, снизить себестоимость базисных растений в 1,2-1,8 раза.
Испытания предложенной технологии были проведены в НПЦ биотехнологии «Фитогенетика» (г. Тула) в условиях лаборатории биотехнологии и зимней теплицы, где получены положительные результаты от применения предложенного заменителя агар-агара на ряде ягодных и плодовых культур.
Изобретения «Питательная среда для выращивания растений in vitro» (патент № 2039428) и «Способ размножения садовых растений» (патент № 2183057) регулярно использовались в лаборатории вирусологии ВСТИСП при получении оздоровленного посадочного материала ягодных и плодовых культур.
Разработанный способ диагностики внедрен и применяется в условиях лаборатории вирусологии ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, а также прошел успешные испытания в ООО «АгроДиагностика», где показано повышение эффективности выявления вирусов на 25 % при выполнении ОТ-ПЦР по предложенному способу в сравнении с известным.
Эффективность магнитно-импульсной обработки при ускоренном размножении здорового посадочного материала плодовых и ягодных культур подтверждена результатами испытаний, проведенных специалистами ФГНУ «Росинформагротех».
Показано положительное действие иммуностимуляторов на продуктивность деревьев груши в условиях промышленных насаждений ГНУ ВСТИСП (2006-2008 гг.).
Оздоровленным посадочным материалом плодовых и ягодных культур, полученным диссертантом, заложены маточные насаждения в 18 хозяйствах 15 областей. Всего за период с 1992 по 2010 гг. получено около 80 тысяч здоровых растений плодовых и ягодных культур.
Работа отмечена 1 золотой и 2 серебряными медалями ВВЦ, награждена дипломом за лучшую завершенную научную разработку 2006 года.
Результаты исследований были использованы при разработке национальных стандартов ГОСТ Р 53135-2008 «Посадочный материал плодовых, ягодных, субтропических, орехоплодных, цитрусовых культур и чая. Технические условия» и ГОСТ Р 54051-2010 «Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия», а также при составлении 6 методических указаний.
Личный вклад автора. Постановка проблемы, формулировка цели и задач исследований, разработка программы и методологии исследований, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично. Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75 %) с профессором В.А. Высоцким, в. н. с. В.И. Донецких, зав. ОНТИ Г.В. Бешновым, к. с.-х. н. А.А. Томилиным, в. н. с. Г.Ю. Упадышевой, зав. лабораторией вирусологии Н.Н. Мельниковой, с. н. с. О.Ю. Сурковой, аспирантами А.Д. Петровой, Е.А. Туть, П.А. Походенко, И.И. Сауниной (ГНУ ВСТИСП), зав. лабораторией биохимии А.В. Гуськовым (ИФР РАН).
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были представлены на международных конференциях: II и VIII конференциях «Биология культивируемых клеток растений и биотехнология» (Алматы, 1993; Саратов, 2003), III, IV и V конференциях «Регуляторы роста и развития растений» (Москва, 1995, 1997, 1999), «Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур» (Москва, 2001), 9 конференции по садоводству «Fruit growing and viticulture II. Floriculture and medicinal plants and other general themes» (Ледница, 2001), «Современное плодоводство: состояние и перспективы развития» (Самохваловичи, 2005), «Мониторинг и методика исследований в садоводстве в нестабильных экологических условиях» (Москва, 2005), «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов» (Москва, 2006), 2-ом «Форуме возрождения китайской северо-восточной старой промышленной базы: научно техническое сотрудничество Китая и СНГ» (Харбин, 2006), «Состояние и перспективы развития культуры жимолости в современных условиях» (Мичуринск, 2009), «Инновационные технологии в питомниководстве» (Самохваловичи, 2009), «Оценка состояния и резервы повышения эффективности производства продукции садоводства и пчеловодства» (Новосибирск, 2010), «Инновационные направления и проблемы в защите садовых культур от вредных организмов на современном этапе» (Москва, 2010); международных симпозиумах: IV, VI, VII и VIII симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001, 2005, 2009; Белгород, 2006), VI и VII симпозиумах по фенольным соединениям (Москва, 2004, 2009); Всероссийских конференциях и совещаниях: «Актуальные проблемы развития питомниководства и научное обеспечение отрасли» (Москва, 1993), Всероссийском съезде по защите растений (Санкт-Петербург, 1995), «Актуальные вопросы теории и практики защиты плодовых и ягодных культур от вредных организмов в условиях многоукладности сельского хозяйства» (Москва, 1998), «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» (Москва, 1999, 2003).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 170 печатных работ, в том числе 31 – в рецензируемых научных журналах списка ВАК, 3 монографии (2 – в соавторстве), 1 книга (в соавторстве), 6 методических указаний, получено 3 авторских свидетельства СССР на изобретения и 17 патентов РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 480 страницах (основной текст на 326 страницах), содержит 117 таблиц, 59 рисунков; состоит из введения, 8 глав, выводов и рекомендаций производству, 12 приложений, списка цитируемой литературы из 816 наименований, в том числе 513 – на иностранных языках.
Визуальная диагностика
Уже в 50-60-е годы XX века широкое распространение вируса ASPV установлено в США (Guengerich, Millikan, 1956), Канаде (Welsh, May, 1967), Германии (Kegler, Schmidt, 1964). Во Франции J. Lemoine (1986) зараженность вирусом ASPV выявлена у 54 % деревьев яблони (из 268 обследованных растений), J.C. Desvignes et al. (1992) — у ЗО % из 400 тестированных сортов. Вирусом ASPV, по данным чешских ученых, было заражено 90 % из 29 тестированных образцов яблони и 44 % из 39 образцов груши (Hassan et al., 2008). В Албании 99 % (из 140 образцов) яблони и 88 % (из 19 образцов) груши были заражены вирусом ASPV (Myrta et al., 2004). О широкой распространенности вируса в условиях Австралии на семечковых культурах (88 % зараженных из 173 образцов) сообщали B.C. Rodoni, F.E. Constable (2008).
В Молдове вирус ASPV встречался у 68-71 % растений яблони и 1 % груши (Вердеревская, 1973; Тулеуов и др., 1984), в Казахстане - у 70 % сор-тообразцов яблони (Долгих и др., 1987). В Крыму и на Северном Кавказе этим вирусом было заражено соответственно 68 и 26 % проверенных сортов яблони (Тулеуов и др., 1984).
В условиях Нечерноземной полосы России вирус ASPV выявлен у 11 % обследованных деревьев яблони и 44 % деревьев груши (Редин, 1999). В условиях Московской области вирус ASPV диагностирован у 21 % деревьев яблони (Бриндаров, 2005) и 22 % деревьев груши (Саунина, 2009).
В ЦЧР вирус ASPV встречался у 42 % промышленных сортов, 56 % маточных деревьев и 30 % клоновых подвоев (Семина, Цуканова, 1995). А.В. Черников (2001) сообщал о том, что более 60 % тест-образцов яблони было инфицировано ASPV. На груше в этом регионе ASPV выявлен у 45 % растений, причем деревья многих сортов были поражены на 60 % (Семина, 2005).
Вредоносность вируса ASPV заключается в повреждениях коры и древесины, ухудшении ростовых процессов, потере товарного качества плодов и снижении урожайности (Вердеревская, Кеглер, 1981). В СІІІА в 14-летнем эксперименте урожайность деревьев яблони, зараженных вирусом ASPV, обусловливалась.формой подвоя: у деревьев, привитых на подвое Virginia crab, она снижалась на 50%, на подвое Florence crab -на 80 % по сравнению со здоровыми деревьями (Rich, 1967).
В Италии при инокуляции? деревьев яблонш сортов Golden Delicious и Stark Delicious вирусом ASPV отмечено снижение: урожайности; соответственно на 36-38 % и 41 -48-% в зависимости от формы подвоя (Canova, 1984):
Вирус ASPV способен вызывать на плодах яблони симптомы зеленой морщинистости и звездчатого растрескивания (Бивол, 1978).Плоды с зеленой морщинистостью содержат меньше фенольных соединений, растворимых сухих веществ и плохо хранятся (Fridlund, Drake, 1987).
Урожай у деревьев груши с симптомами сажистой кольцевой пятнистости снижался в 2,4 раза, каменистости плодов — в 6,1 раза (Campbell et al., 1976), пожелтения жилок - на 30 % (Cropley, Posnette, 1973).
Двухлетние саженцы груши в питомнике, пораженные вирусом ASPV, характеризовались отставанием в росте - высота снижалась на 13-70 %. Инфицированные растения были более чувствительными к зимним повреждениям. Содержание азота, фосфора, кальция, аминокислот в листьях зараженных растений было ниже, а количество Сахаров - в 2 раза выше, чем у безвирусных. Содержание азота падало на 62 %, а аминокислот - в 5 раз. Фотосинтетическая способность листьев зараженных растений груши сорта Red Williams уменьшалась на 51 % (Minoiu et al., 1986).
Вирус мозаики яблони (Apple mosaic virus — ApMV). Относится к роду Ilarvirus семейства Bromoviridae (Murphy et al., 1995; ICTV, 2009). ApMV имеет изометрические вирионы двух размеров: 25,4-26,3 и 27,8-29,0 нм в диаметре. ТТИ — 49 С. ApMV является весьма лабильным вирусом и сохраняет инфекционность в экстрактах сока в течение нескольких минут (Fulton, 1972). Вирус ApMV характеризуется однонитевым смешанно-смысловым РНК-геномом (Pallas et al., 1995). В качестве естественных и экспериментальных хозяев описано 65 видов растений из 19 семейств. Вирус поражает многие виды рода Malus. Восприимчивы к вирусу также виды родов Pyriis, Cydonia, Prunus, Sorbus, Chaenomeles, Crataegus (Kirkpatrick, 1955; Kristensen, Thomsen, 1963; Gilmer et al., 1971; Fulton, 1972; Вердеревская, Маринеску, 1985). ApMV выявлен также на розе, конском каштане и лещине (Cameron, 1977; Cameron, Thomp-son, 1985; Polak, Zieglerova, 1996). А.П. Мишиной (1974) вирус мозаики был перенесен прививкой с яблони на растения рябины, персика, боярышника, розы и груши, на которых развились различные симптомы.
Векторы ApMV не обнаружены. Основным источником распространения вируса является зараженный привойный и подвойный материал (Fulton, 1972; Вердеревская, Маринеску, 1985). Передача вируса с семенами не установлена. В исследованиях Л.Л. Бунцевича (2009) за 6 лет не зафиксировано передачи вируса мозаики яблони из очага на сорте Топаз соседним деревьям.
Симптомы проявляются в виде мозаики листьев, сетки, окаймления жилок, линейного узора, некротических кольцевых пятен и крапчатости. На семядолях огурца Cucumis sativus вирус вызывает формирование хлоротиче-ских пятен, деформацию листьев и остановку роста. Индикаторы.Malus syl-vestris сортов Lord Lambourne и Jonathan реагируют на заражение вирусом ApMV образованием на листьях хлоротичньгх пятен или колец, иногда -бледных пятен на плодах (Fulton, 1972; Вердеревская, Маринеску, 1985).
На груше ApMV обычно находится в латентной форме, хотя некоторые сорта реагируют на инфекцию формированием на листьях светло-зеленых пятен или колец, реже отмечается зональное пожелтение жилок. Кольца и линейный узор на листьях груши при поражении ApMV, по наблюдению Ю.И. Помазкова (1972 а), менее отчетливые, чем в случае заражения ACLSV.
Метеорологические условия в годы проведения экспериментов
Наиболее часто используемыми образцами для ИФА являются листья, хотя некоторые виды вирусов успешнее выявляются в других органах. Например, для диагностики вируса ACLSV на яблоне в экспериментах многих исследователей предпочтительней было использование лепестков цветков по сравнению с листьями и плодами (Barba, Clark, 1986; Desvignes et al., 1992; Редин, 1999; Karesova, Paprstein, 2001; Семина, 2005; Paduch-Cichal et al., 2005). Данный вирус легко выявлялся и в цветочных почках с искусственно пробужденных в зимний период побегов яблони, в то время как покоящиеся вегетативные почки и кора побегов оказались непригодными- видами образцов (Flegg, Clark, 1979). Вирусы ACLSV и ASGV в опытах некоторых исследователей эффективно диагностировались при использовании незрелых плодов и их кожицы (Janecova, Pluhar, 1987; Cieslinska et al., 1995; Редин, 1999; Семина, 2005). P. Gugerli, M.E. Ramel (2004) успешно диагностировали вирус ASPV в семенах яблони и груши, а также в образцах древесины в зимний период. При тестировании груши на вирус ACLSV наряду с листьями в экспериментах М.А. Круглеевского с соавторами (2009) хорошие результаты получены при использовании неодревесневших междоузлий. На вишне лучшими тест-образцами при диагностике иларвирусов PNRSV и PDV являлись лепестки цветков и молодые листья (Метлицкая, 1998). Вирус PPV в условиях Молдовы рано весной легко выявлялся в верхушечных почках побегов, в мае - в молодых листьях и лепестках цветков, в начале лета — в базальных частях листьев, осенью — в коре побегов (Билкей, 1992). На землянике и смородине помимо листьев было возможным использование в качестве образцов цветковых почек, цветков и завязей (Веретенникова, 1998; Метод, указания по экспресс-диагностике вирусов..., 2002).
При использовании листьев в качестве тест-образцов необходимо учитывать неравномерность распределения вирусов по длине побегов и ярусам кроны. Например, вирус ACLSV при тестировании в ранневесенний период был равномерно распределен по ярусам кроны-яблони, а вирус ASGV сосредотачивался преимущественно в почках верхнего яруса (Редин, 1999). Распределение вируса PNRSV в опытах К.В . Метлицкой (1999) на вишне было относительно равномерным, в то время как. PDV - неравномерным. Вирус PPV в растениях персика на протяжении 12 лет после заражения был локализован в основном в нижней части кроны и почти отсутствовал в верхней части (Rankovic, Sutic, 1986). На маточных деревьях, которые регулярно обрезали, концентрация вируса шарки сливы сильно снижалась, а в некоторых побегах вирус полностью отсутствовал (Adams, 1978). И наоборот, после сильной обрезки растений персика и абрикоса в период покоя вирус ACLSV следующей весной интенсивно накапливался в молодых побегах, и заражение растений становилось системным (Cambra et al., 1983).
Концентрация вируса ACLSV на яблоне и абрикосе обычно была выше в листьях у основания побегов по сравнению с верхушечными листьями вследствие медленного распространения вируса по направлению от основания к верхушке в период интенсивного роста (Fridlund, 1982; Barba, Clark, 1986; Cambra et al., 1986). Аналогичная ситуация имела место и в отношении вируса ApMV, причем скорость распространения вируса зависела от восприимчивости сорта яблони (Мишина, 1974; Zawadzka, 1983). На груше наибольшая концентрация вирусов ApMV и ASPV также была отмечена в листьях у основания побега (Упадышев, 2008). Напротив, на некоторых ягодных культурах (малине, смородине, землянике, ежевике, жимолости) предпочтительней использовать для анализа молодые листья (Приходько и др., 1994; Веретенникова, 1998; Упадышев, 2006). При этом имела место и специфика в отношении вида вируса и культуры. Так, на смородине вирус ArMV легче выявлялся в молодых листьях, а вирус RpRSV — в более старых. На крыжовнике листья у основания побегов были более пригодны по сравнению с вер хушечными(Метод, указаншгпоэкспресс-диагностике вирусов..., 2002).
Оптимальным сроком диагностики вирусов на ягодных и плодовых культурах в условиях открытого грунта средней полосы России, как правило, является период с начала мая до конца июня (Суркова, 1994; Приходько, 1995; Семина, 2005). При прохладной погоде было возможным удлинение срока проведения ИФА до середины июля. За рубежом, в условиях Европы, вирусы успешно диагностировались также до начала июля (Llacer et al., 1985; Desvignes et al., 1992; Torrance, 1998). С наступлением жаркой погоды-в июле концентрация вирусов в листьях снижалась, что отражалось на достоверности их выявления. В сентябре - октябре можно было продолжать тестирование методом ИФА большинства ягодных культур. В сентябре - октябре в условиях Чехии удавалось успешно тестировать деревья сливы на наличие вируса PPV (Karesova, Paprstein, 1995).
В условиях зимних теплиц оптимальный срок диагностики вирусов большинства плодовых и ягодных культур методом ИФА приходится на начало вегетации растений — февраль - март (Приходько и др., 1994; Приходько, 1995; Упадышев и др., 2008). На землянике концентрация неповирусов достигала максимума в середине марта — начале апреля (Веретенникова, 1998).
Распространенность вирусов на ягодных культурах
Клональное микроразмножение осуществляли в соответствии с «Методическими указаниями по клональному микроразмножению черной и красной смородины» (1986) и учебным пособием «Клональное микроразмножение плодовых и ягодных культур» (2003).
Для культивирования эксплантов применяли питательные среды Т. Ми-rashige, F. Skoog в модификации В.А. Высоцкого и др. (1976), Е.С.М. Lee, R.A. Fossard (1975) и W.C. Anderson (1980). Оптимизацию минерального состава питательной среды для размножения осуществляли на примере ежевики по усеченной матрице 6-факторного эксперимента (по Малышеву, 1977) с применением компьютерной программы «Эврика», разработанной к. т. н. П.И. Пиленко.
На этапе размножения в питательную среду добавляли 6-бензиламинопурин (6-БАП), тидиазурон, этрел; салициловую, галловую, сиреневую, л-кумаровую, кофейную и феруловую кислоты. На этапе укоренения минеральную и органическую основу базовой среды разбавляли в 2 раза и до 101 бавляли регуляторы роста: ИМК, ИУК, НУК, рибав-экстра, амбиол, этрел, флоридзин в двух препаративных формах (Ф-1 — фирмы Carlo Erbu, Италия; Ф-2 - полученный по технологии Є.А. Острейко и Э.М. Дроздовского, А. с. № 1601829, 1990); салициловую, галловую, сиреневую, и-кумаровую, кофейную, хлорогеновую и феруловую кислоты.
Оптимизацию минерального- состава среды для- укоренения проводили на основании анализа содержания-NPK в тканях микрорастений. Количество аммиачного азота определяли методом отгона на приборе ПС-3, калия - на пламенном фотометре, фосфора - на фотоколориметре ФЭК-М по методике Уманского сельхозинститута (1964) в 4-кратной повторности и с любезной помощью с. н. с. отдела агрохимии ГНУ ВСТИСП Д.Д. Дебеловой. Количество Сахаров (в %) в микрорастениях определяли по Бертрану (Крищенко, 1983).
Растения выращивали на белом (лампа ЛД-80), синем (лампа ЛС-65 с максимумом излучения 440-460 нм), красном (лампа ЛК-65 с максимумом излучения 640-660 нм), зелёном (лампа ЛЗ-65 с максимумом излучения 520-550 нм) и комбинированном свете (лампа-ЛФ-65 - красный 611 нм 87,5 % + синий 450 нм 12,5 %) при освещённости 1600-1800 лк, фотопериоде 16 ч и температуре 23-25С.
Адаптацию микрорастений к нестерильным условиям проводили в зимней теплице. Выход стандартных саженцев определяли в соответствии с ГОСТ Р 53135-2008 «Посадочный материал плодовых, ягодных, субтропических, орехоплодных, цитрусовых культур и чая. Технические условия».
Каждый вариант в биотехнологических экспериментах включал 20-25 эксплантов, опыты повторяли 2-4 раза. Повторность — неизолированная. 2.4.3. Элементы учета, наблюдений и анализ результатов исследований
Оценку зараженности образцов вирусами при тестировании методом ИФА осуществляли по индексу зараженности, определяемому как отношение экстинкции тестируемого образца (Ао) к экстинкции отрицательного контроля (Ак): при Ао/Ак 2,0 образец считался достоверно зараженным вирусом, при Ао/Ак = 1,60-1,99 — вероятно зараженным, при Ао/Ак 1,60 - свободным от вируса. Также определяли распространенности вирусов (в % к общему числу тестированных образцов).
При выполнении ОТ-ПЦР" оценивали электрофоретическую подвижность продуктов амплификации в, сравнении с отрицательным и положительным- контролями или- с маркером молекулярных масс, при ПЦР в реальном времени - уровень репортерной флуоресценции. В- процессе тестирования, на индикаторах определяли тип, количество и интенсивность проявления»симптомов в соответствии с «Типовыми методиками диагностики вирусных болезней сельскохозяйственных культур, одобренными специалистами стран-членов СЭВ» (1970).
Число и длину побегов определяли через 1 и 2 месяца после высадки экс-плантов на среду для размножения, укореняемость побегов и развитие корневой системы (число и длина корней) - через 10-50 дней культивирования на среде для укоренения. На этапе адаптации микрорастений определяли их приживаемость (%), прирост побегов (см) и их количество, число (шт.) и длину корней (см).
В опытах по изучению вредоносности вирусов подсчитывали количество плодов и побегов на растении, измеряли суммарную длину побегов одного растения (м) и определяли биологическую продуктивность (кг/растение) в соответствии с «Программой и методикой сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (1999).
Статистическую обработку опытных данных осуществляли методами дисперсионного, корреляционного и регрессионного анализа по Б.А. Доспехо-ву (1985). В качестве критерия существенности применяли множественный t-критерий Дункана. Использовали компьютерные программы Excel и STRAZ.
Расчёт экономической эффективности выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по определению экономической эффективности научных достижений в садоводстве» (2005) и на основе технологических карт (Технология получения сертифицированного посадочного материала плодовых и ягодных культур, 2009).
Вредоносность вирусов при культивировании растений in vitro
Вирусные болезни относительно недавно введенных в культуру нетрадиционных садовых растений изучены недостаточно. В коллекции ГБЄ РАН на различных диких видах Lonicera при помощи серологических методов были выявлены вирусы кольцевой пятнистости малины, огуречной мозаики, кольцевой пятнистости табака и томата, мозаики резухи, желтой мозаики фасоли и мозаики люцерны (Келдыш, Помазков, 1985).
Поскольку все; выявленные вирусы являются полифагами, то нетрадиционные садовые растения можно рассматривать в качестве естественных ре-зерваторов этих патогенов. Это приводит к возникновению устойчивых очагов инфекции, обеспечивает повторное заражение ш их циркуляцию с помощью переносчиков, обуславливает широкое распространение; трансмиссионных возбудителешсредифазличных культур.. - Анализ распространенности! вирусов-- на растениях., ежевикш показал, чтошроцент зараженияшеповирусамигАгМЭДHtTBRVбылшочтщ одинаковым:: данными вирусами;было зараженожаждое четвертое растение (таблица;7) Таблица 7 - Распространённость.(%); вирус6в шашекоторых ягодных:культурах в Московскойюбласти (в среднемза 199212007 гг.): Примечание: данные получены .совместныхисследованиях, с Е.А. Туть (Туть, Упадышев, 2007). Вирусы SLRSV и RpRSV имели несколько меньшее, распространение: соответственно 16 и 17 % зараженных растений ежевики. На малине чёрной преобладал неповирус TBRV. Наибольшее распространение на малино-ежевичных гибридах имели вирусы RpRSV, SLRSV и TBRV, на жимолости.— TBRV, на актинидии и лимоннике - ArMV.
Помимо указанных неповирусов и вируса SLRSV на растениях рода Rubus изучена распространённость идаеовируса кустистой карликовости малины (RBDV). На ежевике сортов Агавам, Торнфри, Смутстем и малине черной сорта Кумбёрленд вирус RBDV отсутствовал, тогда как на малино-ежевичном гибриде сорта Краснодарская он выявлен в очень высокой концентрации (индекс зараженности 11,4), сорта Логанберри - в более низкой, (индекс зараженности 7,4). Но данным А.Т. Jones (1986); BnpycRBDV спосо 125 бен естественно (путём переноса пыльцы) заражать ежевику и малино-ежевичные гибриды и может быть предположительно связан с дегенерацией Логанберри, вызывая рассыпчатость плодов, уменьшение массы ягод и силы роста.
На растениях рода Rubus симптомы вирусной инфекции проявлялись в виде хлороза жилок и искривления листовой пластинки.
Анализ зараженности коллекционных насаждений ежевики в ГНУ ВСТИСП вирусами по 4-5-летним периодам показал, что колебания процента зараженности находились в пределах от 10 до 37 % (таблица 8).
В период с 1992 по 1995 годы все изученные вирусы на ежевике имели приблизительно одинаковое распространение — около 25 %. Следующая пятилетка характеризовалась более низкими показателями зараженности вирусами по сравнению с предыдущим периодом, что, возможно, связано с погодными условиями. Так, в среднем за 1996-2000 годы температура воздуха в период с мая по июль была на 1,4 С выше, чем в 1992-1995 годы. В июне 1995-1999 гг. температура воздуха в июне была выше среднемноголетней.
Процент заражения неповирусами в 1996-2000 годы колебался от 10 — 11 % по вирусам TBRV и ArMV до 17 % по вирусу RpRSV. Вирус SLRSV по распространенности занимал промежуточное положение. По годам исследований колебания зараженности ежевики вирусами TBRV и ArMV были незначительными, тогда как по вирусам RpRSV и SLRSV — более сильными. Например, в 1997 году RpRSV не был обнаружен, а в 1998 году он диагно 126-стировался? у 5.0 % тестируемых образцово ежевики; Аналогичную картину. наблюдали и по вирусу SERSV. Возможно; это связано с различными условиями и срокамштестирования; которые: могут оказывать, существенное влияг; ниена результаты ИФА. К тому: жев.маетнашротяженишвсех летних меся-дев; 1997 г. температуравоздуха былавыше среднемноголетнихзначений:,
Период 2002-2007 годов1 отличался увеличением распространенности на: ежевике неповирусов ArMV и TBR и снижением — BHpycoB RpRSV и SERSV.
Анализ динамики накопления вируснойї инфекции; в одних и тех же растениях ежевики в различные годы, исследований позволил установить закономерность возрастания концентрации, вирусов по мере увеличения возраста растений. Так, на ежевике сорта Смутстем за период с 1992 по 1995 годы индекс зараженности возрос в 2,4-10,4 раза в зависимости от вида возбудителя (рисунок 7). Аналогичная «закономерностьвимела место и на.растениях ежевики сорта Торнфри. Вместе с тем на данном сорте ежевики указанная зависимость не носила прямолинейный характер: в 1995 году отмечено снижение концентрации вирусов: по сравнению с 1994 годом,..что может быть связано со сроком тестирования или с погодными условиями. На ежевике сортов3 Агавам и Дарроу с возрастом растений также происходило; увеличение концентрации неповирусов; однако более медленными темпами по сравнению с бесшипными сортами ежевики.
