Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время значительно возрос интерес с методам культуры тканей и клеток. Это связано как с увеличением юли клеточных культур в фундаментальных исследованиях, так и с юзможностями практического применения клеточных технологий в «лекции растений, в системах производства оздоровленного материа-іаив генной инженерии. Селекционный процесс заметно ускоряется при использовании ганоидных растений. Поэтому для многих зерновых и овощных культур >азработаны методики получения гаплоидов из изолированных пыль-[иков и пыльцы. В тоже время эффективность культивирования [ыльников и пыльцы большинства плодовых и ягодных растений стается достаточно низкой.
Одним из наиболее простых и эффективных методов генетической рансформации растений является перенос чужсрдиых генов путем нкубации высечек из листьев в присутствии Agrobacterium tuinefacien, меющей плазмиду с необходимыми генами. Но для плодовых и годных культур возможности генной инженерии мало используются з-за отсутствия эффективных методов регенерации растений из ли-говых эксплантов.
Способы получения придаточных побегов из листьев можно приме-ять и в системах микроразмножения растений. Культивирование ли-гьев пробирочных растений позволило создать методики, обеспечи-іющие высокую скорость размножения многих видов без возникно-їния генетических нарушений.
На практике относительно мало используется размножение и оздо-эвление плодовых и ягодных растений через каллусную культуру. то связано с отсутствием надежных методов регенерации растений :их видов из каллуса. С другой стороны, возможность получения шкальных сомаклональных вариантов в культуре пыльников, каллу-)в и листьев представляет несомненный практический интерес для декционеров-плодоводов.
Отсутствие эффективных методов культивирования пыльников и істьев плодовых растений in vitro объясняется эмпирическим харак-ром исследований в культуре тканей и органов. До последнего вре-:ни остаются непонятными механизмы регенерации, а также харак-р влияния различных факторов на морфогенетические процессы, птимальные для каллусо- и побегообразования факторы приходится :кать отдельно для каждого генотипа и типа экспланта.
Цель и задачи исследований. Целью нашей работы мы поставили изучение особенностей регенерации растений земляники и малины и листовых экснлантов, каллусов и пыльников, а также разработку эффективных и воспроизводимых методов регенерации этих видов растений в культуре изолированных листьев и пыльников.
Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:
1. Оптимизировать с использованием методов математического пла
нирования состав питательных сред:
а) для индукции каллусообразования в культивируемых пыльниках
б) для индукции органогенеза в каллусных тканях.
-
Изучить влияние гормональных составляющих питательных сред на морфогенез в культивируемых листовых эксплантах.
-
Оптимизировать гормональный состав питательных сред посредством регрессионного и дисперссионного анализов для получения максимального выхода регенерантов в культуре изолированных листьев.
-
Выявить наиболее эффективные способы предварительной обработки эксплантов в культуре листьев.
-
Изучить влияние физических факторов культивирования на реге нерационные процессы в культуре листьев.
-
Определить морфогенетический потенциал новых перспективны сортов земляники и малины, выведенных во ВСТИСП, при культиві^ ровании изолированных листьев и пыльников.
Научная новизна исследований. Выявлен характер морфогенетичес-ких реакций эксплантов земляники и малины в зависимости от куль тивирусмых in vitro органов ( листья, пыльники ), сортовых и видовь особенностей растений - доноров.
Определена последовательность смены гормональных условий кулі тивирования в культуре пыльников земляники, способствующая увеличению выхода регенерантов.
Выявлено значение источника углерода ( сахарозы, глюкозы и мальтозы ) в регуляции морфогенеза у культивируемых пыльников и каллусов земляники. Показана взаимосвязь между концентрацией уг леводов в среде и морфогенетическими реакциями культивируемых пыльников.
В культуре изолированных листьев определена зависимость между характером повреждения тканей листа, морфогенетической реакциеі экспланта и генотипом растения.
Показана эффективность предварительного замачивания листовых эксплантов малины в растворе 2,4-Д для увеличения частоты регенерации. . Определено влияние различных режимов освещения на морфогенез в культуре листьев и выявлен характер связи между интенсивностью освещения листовых эксплантов и соотношением концентраций БАП и ИМ К в питательной среде.
Практическая значимость. В результате исследований создана воспроизводимая эффективная методика культивирования in vitro листовых эксплантов малины сорта Скромница, обеспечивающая частоту регенерации 70 - 80%, на которую подана заявка на изобретение.
Методика получения растений-регенерантов малины в культуре изолированных листьев передана для разработки модели генетической трансформации растений в Институт биоорганической химии РАН.
Мы также разработали методику культивировании пыльников земляники, которая позволила достичь высокого уровня регенерации. До 40% пыльников сорта Брайтон, 32% - сорта Боровицкая, 24% -сортов Зенит и Редгонтлет, 16% - сорта Триб мот сформировали от 1 до 20 побегов каждый в зависимости от сорта в первичных или пассируемых каллусах. Растения-регенеранты для дальнейшего наблюдения, изучения и использования в селекции земляники переданы в отдел генетики и селекции ВСТИСП.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых (ТСХА, г. Москва, 1993), на Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" ( г. Алматы, 1993 ), на заседаниях секции ученого совета ВСТИСП по ягодным культурам (1990-1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 174 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждений, выводов, рекомендаций производству, приложений. Работа содержит 23 таблицы и 14 рисунков. Список использованной литературы состоит из 257 наименований, в том числе 188 - на иностранных языках.