Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 12
1.1. Систематическое положение фитоплазм 12
1.1.1. Классификация фитоплазм на основе филогенетического анализа 12
1.1.2. Классификация фитоплазм на основе RFLP-анализа .14
1.1.3. Таксономическое положение исследуемых видов фитоплазм
1.2. Морфологические признаки фитоплазм 16
1.3. Биологические признаки фитоплазм .18
1.4. Географическое распространение исследуемых видов фитоплазм .30
1.5. Фитосанитарный статус фитоплазмозов плодовых и ягодных культур 34
1.6. Растения-хозяева исследуемых видов фитоплазм .36
1.7. Симптомы повреждения фитоплазмами .40
1.8. Вредоносность исследуемых возбудителей фитоплазмозов 48
1.9. Меры борьбы с фитоплазмами 52
1.10. Методы диагностики фитоплазм
1.10.1. Электронная микроскопия 54
1.10.2. Иммуноферментный анализ 54
1.10.3. Молекулярно-генетические методы 55
1.10.4. Генетические маркеры генома, используемые для идентификации фитоплазм 61
1.10.5. Кластерный анализ видов рода Candidatus Phytoplasma 63
ГЛАВА II. Материалы и методы 65
2.1. Место проведения исследований 65
2.2. Материал, использованный в работе 65
2.3. Молекулярно-генетические методы исследования 67
2.3.1. Выделение ДНК .68
2.3.2. Измерение концентрации ДНК 70
2.3.3. Исследование классической и «nested»-ПЦР для диагностики фитоплазм .71
2.3.4. Проведение RFLP-анализа .75
2.3.5. Секвенирование ДНК фитоплазм 76
2.3.6. Кластерный анализ участков генома фитоплазм 77
2.3.7. Апробация ПЦР в режиме «реального времени» для диагностики фитоплазм 77
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение .82
3.1. Выявление возбудителей фитоплазмозов 83
3.2. Поиск чувствительного метода выделения ДНК фитоплазм 85
3.3. Применение и оптимизация методов «nested»-ПЦР и классической ПЦР для диагностики фитоплазм 90
3.3.1. Использование классической ПЦР для выявления фитоплазм 90
3.3.2. Оптимизация и применение «nested»-ПЦР участка 16S-23S гена для диагностики фитоплазм .92
3.3.3. Использование tuf гена для видовой идентификации фитоплазм 95
3.3.4. Разработка RFLP-анализа для групповой и видовой идентификации фитоплазм
3.4. Анализ последовательностей ДНК фитоплазм 99
3.5. Кластеризация участков ДНК выявленных видов фитоплазм 104
3.6. Применение ПЦР в режиме «реального времени» для выявления идентификации фитоплазм .109
3.6.1. Анализ универсальной системы ПЦР-РВ для выявления фитопатогенов рода Candidatus Phytoplasma 109
3.6.2. Анализ специфических систем ПЦР-РВ для видовой идентификации фитоплазмозов винограда .111
Заключение 117
Список работ, опубликованных по теме диссертации .121
Список условных сокращений .122
Библиография
- Классификация фитоплазм на основе филогенетического анализа
- Материал, использованный в работе
- Оптимизация и применение «nested»-ПЦР участка 16S-23S гена для диагностики фитоплазм
- Анализ специфических систем ПЦР-РВ для видовой идентификации фитоплазмозов винограда
Классификация фитоплазм на основе филогенетического анализа
Такие рестрикционные карты создаются для каждого вида фитоплазм, и служат маркером для проведения идентификации фитопатогена (Rajan, Clark, 1995). Карты строят по однообразной форме с использованием определенного набора ферментов рестрикции. Для удобства применяют стандартный маркер молекулярного веса, который позволяет охарактеризовать все рестрикционные фрагменты (Bertolini et al., 2007; Heinrich et al., 2001).
Царство Bacteria Класс Mollicutes Отдел Acholeplasmatales Семейство Acholeplasmataceae Род Candidatus Phytoplasma
1. Candidatus Phytoplasma vitis - группа 16SrV-С (Elm yellows phytoplasma), золотистое пожелтение винограда (рус.).
Широко используемое название: Grapevine Flavescence Dore phytoplasma. Существует несколько альтернативных названий болезни винограда, вызываемой Ca. Ph. vitis Flavescence dore: Bacco 22A disease, Flavescence dore of grapevine (англ.), Flavescence dore de la vigne, rougeau (франц.), Flavescenza dorata de la vite (итал.), Flavescencia dorada de la vid (исп.). Возбудитель Ca. Ph. vitis (Flavescence dore, FD) включает в себя три штамма, которые были классифицированы на основании анализа последовательностей 16S, secY, map и uvrB-degV генов: штамм FD1 (изолят FD70), который имеет низкую генетическую изменчивость; штамм FD2 (изоляты FD92 и FD-D) без генетической изменчивости; штамм FD-3, (изолят FD-C) с наибольшей генетической изменчивостью (Seemller et al., 1994).
2. Candidatus Phytoplasma solani (Quaglino et al., 2013) – группа 16SrXII-A (Stolbur phytoplasma), почернение коры винограда (рус.).
Распространенное название: Phytoplasma solani Bois Noir. Так же встречаются такие названия возбудителя почернения коры винограда, как Grapevine bois noir phytoplasma, Stolbur phytoplasma (Kollar et al., 1990; Hren et al., 2007).
3. Candidatus phytoplasma mali (Seemller, Schneider) – группа 16SrX-A (Apple proliferation), пролиферация яблони (рус.). Изначально возбудителя называли Apple proliferation phytoplasma, но потом сформировалась целая группа болезней, входящих в нее на основании генетических исследований – Apple proliferation группа (Tedeschi et al., 2007).
Синонимы: AP, proliferation of apple, witches broom of apple (англ.), proliferations du pommier (франц.), Hexenbesenwuchs des Apfels, Triebsucht des Apfels (нем.), proliferaciones del manzano (исп.).
Проведен ряд исследований по изучению генетической вариабельности Candidatus Phytoplasma mali. Анализ нерибосомных фрагментов ДНК выявил наличие у этого вида не менее трех подтипов, названных АТ-1, АТ-2 и АР-15 (Tedeschi et al., 2006; Jarauch et al., 1996, 2003).
4. Candidatus Phytoplasma pyri (Seemller, Schneider) – группа 16SrX-C (Apple proliferation), истощение груши (рус.). Другое научное название: Pear decline phytoplasma Синонимы: decline of pear, leaf curl of pear, moria disease of pear, Parry s disease of pear, PD (англ.), deperissement du Poirier, fletrissement du Poirier (франц.), Birnbaumsterben, Birnenverfall (нем.), decaimiento del peral (испан.). 5. Candidatus Phytoplasma rubi (Malembic-Maher et. al., 2010) – группа 16SrV-С (Elm yellows phytoplasma), израстание малины (рус.). Второе научное название: Rubus stunt phytoplasma Синонимы: Rubus stunt, RuS (англ.).
Возбудитель израстания малины включен в таксономическую группу 16SrV-EYP (Elm yellows phytoplasma), в которую входит карантинный вид Candidatus phytoplasma vitis.
Морфологические и биологические свойства сближают их одновременно и с бактериями, и с вирусами. Наличие клеточного строения, рибосом и двух типов нуклеиновых кислот (РНК и ДНК), а также устойчивости к антибиотикам группы тетрациклинов отличает фитоплазмы от вирусов. Размножение их осуществляется почкованием или бинарным делением, что также является отличительным признаком от вирусов. Фитоплазмы являются самыми маленькими по размеру клетками-прокариотами (Gibb, Padovan, 1994). Клетка микроорганизма состоит из цитоплазмы, рибосом, обоих видов нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). Она окружена мембраной, то есть имеет клеточное строение, но клеточная стенка отсутствует (рис. 3).
На ультратонких срезах фитоплазмы представляют собой группы нитевидных, сферических или продолговатой формы полиморфных клеток размером начиная от 175-400 нм до 1700 нм в диаметре (Cameron, 1978). Фитоплазмы имеют относительно небольшой геном, величина которого у разных видов колеблется от 530 до 1350 тысяч пар оснований (т.п.о.) (Lee et al., 1993, 1995; Kirson et al., 1997). Размер хромосом у Candidatus Phytoplasma pyri, Candidatus Phytoplasma mali составляет в среднем 660 и 645 т.п.о. соответственно (Seemller, Schneider, 2004). При этом у Candidatus Phytoplasma mali размер хромосом варьирует от 640 до 680 т.п.о. (Seemller, Schneider, 2007). Геном фитоплазмы состоит из одной хромосомы и нескольких небольших плазмид с уникальным геном репликации (Kuzmanovic et al., 2008; Lauer, Seemller, 2000). В генетическом коде присутствуют кластеры повторных генных последовательностей, чья роль еще до конца не изучена (Torres, 2005).
В геноме присутствуют основные универсальные гены, которые характерны для всех подгрупп и являются консервативными для диагностики фитоплазм. Есть и другие гены, которые являются узкоспецифическими вплоть до наличия лишь у конкретных штаммов (Martini et al., 2008, 2009).
По сравнению с другими организмами, у фитоплазм проявляется редукция участков генов, кодирующих синтез ряда веществ. У фитоплазм отсутствует большинство генов, отвечающих за синтез нуклеотидов, за F0F1-тип АТФ-синтазы, которое ранее считалось одним из компонентов минимального набора генов, необходимых для всех живых организмов (Martinez et al., 2000). Выявлены различные биосинтетические пути и транспортные механизмы, которые занимаются импортом важных соединений от растений-хозяев и насекомых-переносчиков к клеткам фитоплазм (Lauer et al., 2000).
Фитоплазмы являются облигатными внутриклеточными фитопатогенами. Они размножаются во флоэме растений, хотя о самом механизме размножения информации мало (Ciccotti et al., 2008). Биологический цикл представлен на рисунке 4. Фитоплазмы также развиваются в желудочно-кишечном тракте, гемолимфе, слюнных железах и внутриклеточно в различных органах насекомых (Seemller et al., 1994). При питании насекомого на инфицированном растении фитоплазма через слюнные каналы попадает в кишечный тракт и там размножается. При перелете насекомого на здоровое растение фитоплазма через слюнные железы попадает в растительные клетки и заселяет их.
Возбудители фитоплазмозов имеют высокий репродукционный потенциал, способны сохраняться долгое время в латентном состоянии. Латентный период фитоплазмы зависит от сроков ее передачи насекомым неинфицированному растению и может составлять 10 – 45 дней (рис.4). При этом насекомое остается переносчиком весь срок, даже во время линьки вплоть до своей гибели. Естественное распространение заболевания может происходить на небольшие расстояния и зависит от перелета вектора. Резкие вспышки численности насекомого-переносчика той или иной фитоплазмы способны вызывать эпифитотии (Lefol et.al., 1993, 1994).
Материал, использованный в работе
Важными показателями ПЦР для диагностики фитоплазм являются высокая чувствительность метода и специфичность. Данный метод диагностики способен распознать организм при наличии нескольких его клеток в пробе. Диагностика заболеваний, в том числе вызванных фитопатогенами, некультивируемыми на питательных средах, генетическое кодирование микроорганизмов, оценка их эпидемиологии и физиологии, изучение устойчивости различной микрофлоры к антибиотикам и другим ингибиторам – это неполный список возможностей применения данного метода (Martin, 2000).
При проведении ПЦР происходит накопление определенного фрагмента ДНК в геометрической прогрессии в течение нескольких циклов в одной пробирке. Изменение температуры смеси позволяет переходить от одной стадии синтеза участка ДНК к другой в одном термоциклере. При температуре 92-95 0С проходит плавление двуцепочечной молекулы ДНК. При падении температуры до 45-65 0С праймеры "отжигаются" на раскрученной одиночной цепи, а при обратном нагревании смеси на уровне 70-72 0С начинает работать Taq-полимераза, которая способствует восстановлению двуцепочечной структуры ДНК по принципу комплиментарности. Процесс определен как элонгация. Данный цикл повторяется снова. Для полноценного достраивания дочерней цепи ДНК после прохождения циклов реакции вводят этап финальной элонгации на несколько минут. «Nested»-ПЦР. Для повышения чувствительности и наибольшего выхода искомых ампликонов применяют метод гнездной («nested») амплификации. Подразумевается использование двух пар праймеров. Первая амплифицирует продукт немного больше искомого, вычленяя его из всей цепи ДНК. С полученным ампликоном проводят ПЦР со второй парой праймеров, которая синтезирует искомый участок гена. Иногда вместо «nested»-ПЦР применяют повторную амплификацию для накопления определенного продукта. Это достаточно актуально для фитоплазм, так как из-за их низкой концентрации в тканях растений выделяют малое количество ДНК. Такой процесс амплификации особо трудоемкий. Он требует повышенной осторожности во избежание контаминации между исследуемыми образцами (Kollar et al., 1990). Чаще всего в исследованиях фитоплазм проводили ПЦР с праймерами Р1/Р7 и полученные Ампликоны использовали для вторых этапов «nested»-ПЦР, разбавляя их дистиллированной H2O в 30-50 раз. Одна из пар гнездной ПЦР – R16(V)F1/ R16(V)R1, разработанная для выявления 16SrV группы фитоплазм (Elm yellows), к которой относится возбудитель золотистого пожелтения винограда.
Еще одна пара праймеров (M23Sr /16r758f) позволяла получить ампликоны участков 16S-23S генов для всех видов фитоплазм. Хотя для выявления ложноположительных результатов ПЦР с грамположительными бактериями и идентификации фитоплазменных организмов необходимо проводить секвенирование.
RFLP-анализ. С помощью ферментов определяют количество сайтов рестрикции исследуемого образца. Визуализация проводится с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод используется для видоспецифичной идентификации фитоплазм. В 1998 году впервые была создана классификация фитоплазм, которая основывалась на результатах RFLP-анализа ампликонов участков 16S rDNA гена (Lee, 1998). В протоколе ЕОКЗР предлагается использовать рестриктазы Taq I и Tru9 I для идентификации фитоплазм подгрупп Elm Yellows Group Phytoplasma и Stolbur Group Phytoplasma.
Для исследования фитоплазм большинство диагностических протоколов предлагают использовать метод ПЦР с универсальными праймерами с последующим насыщением полученного или более специфичного фрагмента ДНК при «nested»-ПЦР. Конечным этапом идентификации является RFLP-анализ, позволяющий определить видовую принадлежность фитоплазмы (Schneider et al., 1997). Вся процедура требует больших затрат времени, является достаточно кропотливой. Эту проблему можно решить применением метода ПЦР «в реальном времени» в комплексе с возможностью создания видоспецифичных праймеров и зондов для дальнейшего повышения качества обнаружения фитоплазм (Hee-Young, 2003).
Для получения достоверных результатов RFLP-анализа ампликонов, полученных в процессе второго этапа «nested»-ПЦР, необходимо удостовериться в единичном продукте амплификации. Вторичные «бенды» или фрагменты неспецифической длины (п.о.) могут затруднять анализ, создавая искаженный спектр длин и количество рестрикционных фрагментов исследуемого вида фитоплазмы.
Секвенирование – это процесс расшифровки нуклеотидной последовательности, полученной при постановке ПЦР с меченными нуклеотидами. По набору азотистых оснований (A, G, T, C) в изучаемом участке гена исследуемый организм идентифицируется, после сопоставления последовательностей с уже известными в генетической базе данных. В 1977г. Ф. Сэнгер предложил метод секвенирования, при котором используются терминирующие синтезированные триофосфаты (Schneider et al., 1997).
Оптимизация и применение «nested»-ПЦР участка 16S-23S гена для диагностики фитоплазм
На территории республики Дагестан были выявлены возбудители истощения груши CP и почернения коры винограда BN. Ранее не было отмечено данных о наличии данных фитоплазм в России. При обследовании сорных растений некоторых районов Московской области обнаружили очаги возбудителей фитоплазмозов, вызывающие заболевания растений семейства Астровых (AY, TP). В Международном сообществе фитоплазмологов (IPWG) в 2016 году ввели новый таксон Candidatus Phytoplasma cirsii, в котором выделяли фитоплазму, повреждающую растения C. arvense (Safarova et.al., 2016). Ранее фитоплазму обозначали Cirsium multiple inflorescence phytoplasma или Cirsium arvense phytoplasma.
С помощью молекулярно-генетических методов диагностики впервые определили возбудителя израстания малины RS – близкородственный вид к Candidatus Phytoplasma vitis (Матяшова и др., 2015). Также авторами были идентифицированы Clover phyllody phytoplasma, поражающая садовую землянику (ClP), и Beta leaf phytoplasma, повреждающая сахарную свеклу (BP). Возбудителей вышеперечисленных заболеваний российские ученые описывали лишь по симптомам, не определяя вид патогена с точностью до 100%. С помощью метода секвенирования подтвердили информацию о действии фитоплазмы на кактусы в целях получения декоративных форм.
В полученном материале из Испании, Франции и Чехии обнаружили возбудителей заболеваний плодовых культур (FD, AP и PrP). В соответствии с литературными источниками о распространении вышеуказанных фитоплазм, обнаружений их на территории России не было либо не подтверждалось соответствующими испытаниями. Если говорить о возбудителях фитоплазмозов плодовых и ягодных культур, то ранее на территории России выявляли и идентифицировали только вид Ca. Ph. pruni (Girsova et al., 2008).
Образцы винограда разного географического происхождения исследовали на наличие возбудителя почернения коры винограда с помощью системы «BNrt» методом ПЦР-РВ (таблица 18). Проанализировали процент встречаемости Ca. Ph. solani BN в местах возделывания винограда.
Как показали исследования, при диагностике фитоплазмозов в 16,3% случаев в республике Дагестан идентифицировали возбудителя почернения коры в виноградниках. Следует отметить, что при дальнейшем распространении BN будет необходимым принятие мер по борьбе с переносчиком возбудителя фитоплазмозов. При обследовании виноградников в республике Крым в Симферопольском и Ялтинском районах было выявлено достаточно высокое поражение возбудителем почернения коры винограда. Липецкая область не является регионом виноградарства, но есть частные компании (ООО «ЛОЗА», площадь виноградников – 25 га) по возделыванию винограда и ЛПХ, и на территории области в его посадках не был обнаружен возбудитель почернения коры винограда. Фитоплазма BN достаточно широко распространена в регионах возделывания винограда в Италии и Франции (www.eppo.int), поэтому выявление фитопатогена в 8-10% случаях от общего числа проанализированных образцов не вызвало сомнений. Образцы зарубежного посадочного материала отбирали в специализированных питомниках в осенне-зимний период, чем затруднялось выявление фитоплазмы из-за её низкой концентрации в надземных частях винограда, вследствие латентного состояния.
Для определения оптимального метода выделения ДНК при низком инфекционном фоне провели апробацию четырех коммерческих наборов для выделения ДНК из растительного материала с целью определения оптимальной процедуры экстрагирования и очистки ДНК фитоплазм.
Для определения количества и качества измеряли концентрации образцов ДНК возбудителя израстания малины. При считывании спектрофотометра в большинстве проб отношение поглощения при длинах волн 260 нм и 280 нм варьировало в пределах 0.5-2.1 при оптимальном уровне 1.8, что показывало на чистоту проб ДНК и возможность их дальнейшего исследования. В случае высоких значений показателя 260нм/280нм образец содержал большое количество побочных продуктов процесса выделения ДНК (белки, фенолы или другие контаминирующие вещества), имеющих значительное поглощение при 280 мн.
В таблице 19 приведена концентрация полученных проб ДНК. При выделении из листьев самая высокая концентрация зафиксирована при использовании набора «Проба-ЦТАБ» (97,7 нг/мкл) и «Dynabeads Silane viral NA» (73,9 нг/мкл). Максимальный выход ДНК из ткани стеблей составил 69,5 нг/мкл при выделении набором «Dynabeads Silane viral NA» и 30,7 нг/мкл - «Проба-ЦТАБ». Также с помощью набора «Dynabeads Silane viral NA» удалось выделить из корней малины пробу ДНК с концентрацией 96,7 нг/мкл, что в несколько раз больше соответствующих измерений при использовании других наборов и стандартной методики (24,2, 10,3, 24,6 и 20,8 нг/мкл). В целом концентрация проб тотальной ДНК, полученных при выделении наборами «DNeasy Plant mini Kit», «Сорб-ГМО-А» и стандартной методикой «Doyle&Doyle», была в несколько раз меньше по сравнению с применением наборов «Проба-ЦТАБ» и «Dynabeads Silane viral NA».
В таблице кроме показателей, исследуемых образцов приведены пороговые циклы отрицательных контролей выделения ДНК для каждого набора, а также средние значения и значения ошибки среднего для исходных образцов ДНК фитоплазмы без разведения и при разведении 10-4. Как показали результаты ПЦР-РВ, выделение нуклеиновых кислот из тканей листа с использованием набора «Dynabeads Silane viral NA» дает минимальный выход ДНК, так как обнаружение фитоплазмы можно было наблюдать в пробе только при разведении ДНК в 100 раз, несмотря на достаточное количество ДНК в образце (19.9 нг/мкл). В случае использования отечественных наборов и оптимизированной для фитоплазм методики значения пороговых циклов были средними на общем фоне (таблица 20).
Что касается коммерческого набора «DNeasy Plant mini Kit», то даже при максимальном разведении детектировали значение порогового цикла (№3, таблица 20). Действительно, в литературных источниках имеются данные о использовании данного набора для исследования фитоплазм (Firrao et. al., 2001). В связи с его относительно высокой стоимостью, экономически целесообразно применять оптимизированную для фитоплазм методику «Doyle&Doyle», реактивы для которой в разы дешевле коммерческого набора.
Анализ специфических систем ПЦР-РВ для видовой идентификации фитоплазмозов винограда
Отмечено, что между изолятами вида Ca. Ph. solani разного географического происхождения и растений-хозяев генетического различия по данному участку не наблюдали. На дендрограмме показано, что различия не существует внутри подгруппы 16Sr-V (EY) по анализируемому фрагменту tuf гена, в которую включены виды FD и RS. Это подтверждает сложную внутригрупповую дифференциацию возбудителя золотистого пожелтения винограда от возбудителя израстания малины.
В отдельный кластер выделена группа Apple proliferation, в которую вошли фитоплазмы АР, PrP и СР. Результаты анализа показали, что возможно использовать данный участок tuf гена для дифференциации фитоплазм на уровне подгруппы, а также для применения исследуемого участка генома как альтернативы 16S гену для диагностики многих видов фитоплазм.
В работе исследовали метод ПЦР в режиме «реального времени» с универсальной парой праймеров и зондов для выявления фитоплазм, а также специфические праймерные системы и соответствующие зонды для идентификации Ca. Ph. vitis FD и Ca. Ph. solani BN.
При проведении подбора температурно-временных параметров для системы «Unirt» было установлено, что оптимальным условием является температура 52 оС для отжига праймеров. Для определения специфичности праймерной системы «Unirt» использовали образцы ДНК грамположительных, грамотрицательных бактерий, ДНК неинфицированных растений винограда разного географического происхождения, а также бактерии рода Bacillus sp. и Enterobacter sp. микрофлоры винограда.
На первом этапе исследования универсальной пары праймеров UniRTF/UniRTR и зонда UniRT-FAM были получены значения пороговых циклов (Ct). Как видно из таблицы 31, образцы ДНК возбудителей фитоплазмозов имели значения Ct от 21 до 36. Отрицательные контроли в опытах не давали показаний Ct. Можно предположить, что данная пара праймеров подходит для обнаружения многих видов возбудителей фитоплазмозов. Как было сказано выше, результаты метода ПЦР-РВ зависят от вида и агрессивности фитопатогена, его накопления в тканях растений, сроках отбора материала. Самые высокие показатели Ct наблюдали у видов BN, CP, TP, CacP, RS – виды фитоплазм, выявленные на территории России.
Как показали результаты опыта постановки ПЦР «в реальном времени» на специфичность праймерной системы и зонда, образцы ДНК, выделенные из неинфицированных фитоплазмами растительных тканей винограда (№ 1-15, табл. 32) не обнаружили (Ct 45 цикла).
Почти все образцы ДНК грамположительных и грамотрицательных бактерий (№ 21-30, табл. 32) срабатывали с такими же показателями Ct. Образцы ДНК микроорганизмов, выделенных из экстракта здорового винограда (№ 31-35, табл. 32), не давали значения Ct, как и отрицательные контроли. В ходе исследований были отмечены перекрестные реакции (красным цветом) с двумя видами бактерий. Так, образец ДНК бактерии Xanthomonas fragaria (№ 25, табл. 32) и образец ДНК грамположительной бактерии – Lactococcus garvieae (№ 28, табл. 32) определили как ложноположительные результаты.
Анализ видоспецифических систем ПЦР-РВ для видовой идентификации Ca. Ph. vitis и Ca. Ph. solani Для видовой идентификации возбудителей фитоплазмозов винограда анализировали на возможность применения пары праймеров и соответствующих им зондов (далее ПЦР-РВ «FDrt» и «BNrt»), специфичных на участки 16S гена вида Candidatus Phytoplasma vitis и Candidatus Phytoplasma solani. Результаты ПЦР-РВ представлены в таблице 33.
При постановке ПЦР-РВ «FDrt» с образцами ДНК здорового винограда, грамположительных и грамотрицательных бактерий не детектировали нарастание флуоресценции, что говорило об отсутствии с ними ложноположительных результатов.
Две культуры микроорганизмов, выделенных в чистую культуру из экстрактов листьев, детектировали при значениях циклов в пределах 39,14-40,55. Образец ДНК возбудителя почернения коры винограда (№29, таблица №33) был в среднем зафиксирован с показанием 38,45 цикла, что могло явиться положительным результатом и служить подозрением на заражение карантинным видом возбудителя фитоплазмоза, присутствующим в достаточно низких концентрациях в тканях винограда.
При проведении исследования на специфичность системы ПЦР-РВ «FDrt» внутри рода Candidatus Phytoplasma детектировали положительные результаты AY, CacP, PrP, CP, BN-F при значениях циклов от 40,03 до 42,01 (таблица 34).
Образец ДНК Ca. Ph. rubi (RS) детектировали при значении порогового цикла в среднем 28,01 (№1, таблица №34). Такой результат достаточно объясним, так как возбудитель фитоплазмоза малины RS входит в ту же таксономическую группу (Elm yellows), что и золотистое пожелтение винограда Ca.Phytoplasma vitis (FD).