Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Изученность и достижения в области биологической защиты растений от болезней (обзор литературы) 13
Глава 2. Место, объекты, методы и условия исследований
2.1.Особенности географических, орографических и почвенно -климатических условий объектов исследований .35
2.2. Методы исследований 55
2.3. Краткая морфолого-биологическая и хозяйственная характеристика видов и сортов хлопчатника, их болезнеустойчивость и урожайность .
2.3.1. Cредневолокнистые сорта хлопчатника 68
2.3.2. Tонковолокнистые сорта хлопчатника .75
2.4. Полусапрофитная и патогенная микрофлора хлопчатника и другихрастений, пораженных хлопковой белокрылкой (Bemisiatabasigenn.) 80
Глава 3. Эндофитная микрофлора ризоплана и тканей растений хлопчатника, ее роль в патогенезе 88
3.1. Микрофлора ризоплана растений хлопчатника 92
3.2. Микрофлора тканей тонковолокнистого хлопчатника 95
3.3. Роль эндофитных микроорганизмов в патологическом процессе 106
3.4. Влияние источников питания на рост, развитие и патогенность грибаFusariumoxysporumf. vasinfectum 115
3.5. Культуральные особенности и патогенность штаммов hielaviopsisbasicola возбудителя черной корневой гнили хлопчатника 121
Глава 4. Биологические свойства эндофитных бактерий рода Bacillus
4.1. Антагонистические и физиолого-биохимические свойства эндофитных бактерий хлопчатника 125
4.2. Морфологические и физиолого-биохимические свойства эндофитных бактерий 137
4.3. Влияние условий выращивания эндофитных бацилл на накопление биомассы и изменение антогонистической активности 141
4.4. Механизм действия B. subtilisна фитопатогены 143
Глава 5. Характеристика биопрепаратов
5.1. Биопрепарат хлопкоспорин 146
5.2.Характеристика эндофитной бактерии B. subtilis 26Д .147
5.3.Изготовление препарата хлопкоспорин 150
5.4. Характеристика биопрепарата хлопкоспорин 153
5.5. Характеристика биопрепарата cубтилбен . 155
5.6. Физико-химические свойства субтилбена 156
5.7. Биологические свойства субтилбена 157
5.8. Биопрепарат фитоспорин 162
Глава 6. Эффективность биопрепаратов эндофитных бактерий В. subtilis -26Д в защите растений от болезней 167
6.1. Эффективность обработки семян хлопчатника биопрепаратами эндофитных бактерий 168
6.2. Эффективность испытания наиболее активных штаммов эндофитных бактерий рода Bacillus 168
6.3. Влияние биопрепаратов на всхожесть семян, густоты всходов хлопчатника и пораженность их болезнями 173
6.4. Эффективность испытания опытных образцов препаратов эндофитной бактерии В. subtilis - 26Д 188
6.5. Производственное испытание биопрепаратов эндофитной бактерии В. subtilis 190
6.6. Влияние препаратов эндофитных бактерий на рост и развитие растений, урожай и качество хлопка-сырца 197
6.7. Испытание биопрепарата субтилбен на основе эндофитной
6.8. Влияние субтилбена и УФ излучений в борьбе с семенной
Глава 7. Экономическая эффективность применения биопрепаратовв борьбе с болезнями хлопчатника 218
Заключение 221
Выводы 225
Предложения, рекомендации производству 228
Литература
- Краткая морфолого-биологическая и хозяйственная характеристика видов и сортов хлопчатника, их болезнеустойчивость и урожайность
- Роль эндофитных микроорганизмов в патологическом процессе
- Влияние условий выращивания эндофитных бацилл на накопление биомассы и изменение антогонистической активности
- Характеристика биопрепарата cубтилбен .
Краткая морфолого-биологическая и хозяйственная характеристика видов и сортов хлопчатника, их болезнеустойчивость и урожайность
В основе биологической защиты растений от болезней лежит использование межвидового антагонизма микроорганизмов. Антагонистами считаются те микробы, которые способны эффективно конкурировать с патогенными организмами, выделять метаболиты, подавляющие патогенны, вызывать перестройку растительного организма и, тем самым изменять его взаимоотношения с проникающим паразитом.
В биологической защите растений чаще всего пытаются использовать грибы и бактерии - антагонисты возбудителей болезней растений.
Одним из первых исследование взаимоотношения микроорганизмов проводил Я.П. Худяков [1935]; им выделены и изучены бактерии из родов Pseudomonas и Aplonobacter, вызывающие лизис различных видов Fusarium и других грибов. Исследования в этом направлении проводили Д.М. Новогрудский [1936]; Е.Ф. Березова [1939] и другие. Но результаты этих работ по использованию антагонистических свойств микроорганизмов долгое время не находили широкого применения.
Результаты исследований отечественных авторов [Худяков, 1935; Новогрудский, 1936; Красильников и др., 1952, 1953; Федоров, 1960; Билай, 1961; Сейкетов, 1969]. Свидетельствуют о распространенности в природе антагонизма между фитопатогенами и другими микроорганизмами, в использовании для защиты растений от болезней экологически безопасных эффективных препаратов на основе живых микробов или продуктов их метаболизма [Великанов Л.Л., Успенская Г.Д. 1980; Крашенинникова и др., 1995; Павлюшин, 1998; Смирнов и др., 1999; Мелентьев, 2001; Коломбет и др., 2001;Poprawskietal., 1997; Hervasetal., 1998; Lewis, Larkin, 1998; Strombergetal., 2000]. В связи с этим в разработке экологически безопасных методов защиты сельскохозяйственных культур от болезней следует выделить следующие направления: 1) применение естественных врагов или конкурентов вредных организмов; 2) использование продуктов жизнедеятельности организмов, подавляющих фитопатогенов и вредителей; 3) использование механизмов индуцированной устойчивости растений к болезням.
В целом эти направления связаны с биоконтролем (biocontrol), который может быть кратко охарактеризован как «регулирование численности микроорганизмов и животных естественными врагами» [Morris, 1996; DentD., AllcottR., 1996; Недорезков, 2003].
В настоящее время обнаружено большое число антибиотиков, синтези руемых различными штаммами B. subtilis, среди которых важное место занимают штаммы – антагонисты фитопатогенов. Циклические олигопеп тиды, образуемые бациллами, ингибируют синтез клеточной стенки (грами цидин, полимиксин), основные пептиды ингибируют образование малой субъеденицы рибосомы комплекса инициации (эдеины), аминогликозиды нарушают функции рибосом. Чаще всего штаммы – продуценты р. Bacillus образуют несколько антибиотиков, близких по физико – химическим свойствам, но отличающихся незначительными изменениями в аминокислотном составе. Возможно, в результате совместного действия комплекса антибиотических веществ, продуцируемых бактериальной клеткой, происходит подавление особо устойчивых видов фитопатогенных микроорганизмов. Замечено, что действие бацилл – антагонистов селективно по сравнению с прочими продуцентами биопрепаратов для защиты растений от болезней, что делает их еще более ценными агентами микробиологического контроля фитопатогенов [Смирнов и др., 1982].
В пятидесятые - шестидесятые годы в литературе появилось ряд работ, в которых проведены различные способы использования микробов-антагонистов в подавлении возбудителей болезней растений. В результате, наметились два основных направления: первое – использование живых культур микробов-антагонистов или продуктов их жизнедеятельности; второе – создание благоприятных условий для развития микробов-антагонистов в почве. Многочисленные работы посвящены разработке первого направления.
Бактерии рода Bacillus насчитывают более 20 видов, продуцирующих широкий спектр биологически активных веществ (БАВ). Наиболее продук-тивные и перспективные представители рода Bacillusв микробиологической промышленности - бактерии вида В.subtilis. При расшифровке генома В.subtilisбылобнаружен многочисленный набор транспортных белков, что свидетельствует о гибкости взаимодействия этой бактерии с окружающей средой [Пашкевич, 2009]. При температуре почвы, близкой к 0С, большая часть бацилл образует споры. Чем выше рН, тем больше содержание спор в культуре В. subtilis. Обладают высокой термостойкостью спор: нижний предел - 30С, верхний - + 90С [Недорезков, 1998].
Современные исследования [Павлюшин и др., 1999] показывают, что метаболиты некоторых актиномицетов могут проявлять комплексную активность против вредителей и фитопатогенов. Так продуцент октаберина – штамм актиномицета Streptomycescremeusbiovaroctaberanum является антагонистом не только тлей, трипсов и других вредителей, но и грибов и бактерий, вызывающих корневые гнили, фузариозы и другие болезни. Выявлены некоторые действующие вещества октаберина (короткие пептиды – ингибиторы протеина). Скорость размножения бактерий в растении зависит от восприимчивости растения – хозяина и фазы его развития [Cултанова, 1995]. Некоторые бактерии известны как патогены, бессимптомно находящиеся в растениях – хозяевах или не хозяевах [Bacon, Hinton, 2002], другие не известны как источники заболеваний, часть из них ассоциируется с растением, обладая азотофиксирующими свойствами
Роль эндофитных микроорганизмов в патологическом процессе
Бактерии-азотфиксаторы – азотобактер и ClostridiumPaster в целинных почвах содержатся в небольших количествах, но они хорошо развиваются в орошаемой почве. При орошении снижается основной фактор, лимитирующий развитие микроорганизмов в целинных почвах в жаркий период – недостаток гумуса, в почве развивается весь комплекс микроорганизмов, который при высокой агротехнике может обеспечивать условия для повышения плодородия почв.
На наиболее высокую биогенность светлых сероземов, связанных с поступлением большого количества света и тепла, быстрой сменой генераций микробов, указывают также Н.А. Красильников [1949] и Е.Н. Мишустин [1953].
Запасы элементов зольной и азотной пищи в светлых сероземах невелики. Содержание валового азота колеблется в пределах 0,05-0,08% [Липкинд, 1947; Иловайская, 1951; Белякова, 1957]. Из общего количества его, на долю минерального приходится около 3% [Липкинд, 1947].
Содержание валового фосфора в светлом сероземе пятой террасы Вахшской долины колеблется от 0.10 до 0.16% т.е. меньше, чем в почвах других долин. При разложении фосфатов светлого серозема методом Джексона [1958] установлено, что на 85% они состоят из минеральных форм [Липкинд, 1967], в основном кальций фосфата; железа и алюмофосфатов очень мало. Количество подвижного фосфора в почве Вахшской долины невелико; площадь с содержанием 45 мг/кг подвижного фосфора составляет всего 4% от общей орошаемой площади.
Валового калия в светлом сероземе пятой террасы содержится около 1.5%, но количество подвижных форм его незначительно и составляет не более 10% от валового. Обменного калия содержится здесь от 6.0 до 11.0 мг на 100г почвы, в том числе воднорастворимого от 0.7 до 3.8мг К2О на 100г почвы.
Почвенный покров четвертой террасы идентичен пятой, а территория ее полезной площади невелика. Самая обширная территория в Вахшской долине – третья. Она является основной базой орошаемого земледелия в долине. Оросительные воды из р. Вахш могут быть поданы на третью террасу без особых технических затруднений, и поэтому она орошается с древнейших времен.
В геологическом строении третьей террасы различают три горизонта: 1 – нижний слой – коренные породы, состоящие из песчаников неогенного возраста; 2 - мощный слой гальки и песка; и 3 – аллювиальные мелкоземис-тые отложения, покрытые ирригационными наносами.
Длительное орошение мутной водой р. Вахш привело к тому, что аллювиальные отложения, слагающие третью террасу, покрылись толстым чехлом ирригационных наносов и бывшие светлые сероземы оказались погребенными под толщей наносов, а ныне классифицируются как светлые сероземы на ирригационных наносах. Мощность их колеблется от 1 до 6м. на общем равнинном фоне террасы чрезвычайно развит мезорельеф в виде чаш. Чаши встречаются величиной от нескольких гектаров до квадратного километра и больше [Керзум, 1947]. Глубина чаш в среднем около 2.5-3.0м, а в отдельных случаях – 6-7м [Жигачев, 1947]. Генезис чашевидного рельефа связан с неравномерным отложением на полях взвешенных твердых частиц из поливной воды: вблизи оросителя откладываются более мелкие (песчаные и пылеватые) фракции, а вдали – более тяжелые (илистые) по гранулометрическому составу фракции.
Основной почвой третьей террасы р. Вахш являются староорошаемые светлые сероземы, развитые на ирригационных наносах. Эти почвы отличаются однородностью профиля – серого с буроватым или коричневатым оттенком, в зависимости от цвета привносимого водой наноса. Пахотный слой более темного цвета и более рыхлый. Незасоленные староорошаемые сероземные почвы распространены по верхним и средним частям склонов чаш. Грунтовые воды под ними залегают относительно глубоко. Содержание солей здесь незначительное, но больше, чем на целинных в светлых сероземах. Староорошаемые сероземы содержат такое же количество карбонатов, как и целинные сероземы, а гумуса и азота больше. Содержание гумуса и азота по склонам чаш различное. В пахотном слое почвы хлопковой старопашки [Белякова, 1957], содержание гумуса в верхней части склона составляет 0.9 - 1.2%, в средней около 1.3% и внизу склона 1.3 - 1.4%.
По данным И.М. Липкинда [1940; 1947], такое же различие наблюдается и содержание в почве минеральных соединений азота, фосфора и калия. Почвы при оросительной части склона чаще беднее почв средней и особенно нижней части склона, всеми формами азота, фосфора и калия.
В почве стационарного участка (табл.2.1.2) карбонатов кальция содержится по профилю почвы 12.5-14.2, что характерно для речных наносов с однородным содержанием карбонатов. Гумуса в слое 0-50см содержится до 1.16%, а вниз по профилю уменьшается постепенно до 0.62%. Аналогично наблюдается и по содержанию общего азота, валового калия. Такая закономерность связана со свойствами наносного грунта и эволюцией почвообразовательного процесса. Содержание подвижных форм элементов питания почвы, почти схожая начиная с глубины ниже 52см. Большое содержание подвижных форм питательных элементов в значительной степени связана с внесением минеральных удобрений за годы освоения, или являются отражением периода интенсивной химизации.
В целом по Вахшской долине, где в настоящее время широко развито орошение, для дальнейшего повышения плодородия почв, необходимо проводить дополнительные мероприятия, прежде всего по обеспечению полной ликвидации засоления почв посредством локального усиления дренажа, производства планировок и промывок. С другой стороны, необходимо ускорить освоение укороченных схем хлопково-люцерново-зерновых севооборот.
Влияние условий выращивания эндофитных бацилл на накопление биомассы и изменение антогонистической активности
Изучая внутренние ткани здоровых растений многие ученые, отмечают что они не всегда свободны от микроорганизмов [Zimmermann, 1902; Schan-dererl, 1939; Cosenza, Mc. Creary, Buck, Shigo, 1970; Knutson, 1973; Shigo, Hillis, 1973; Aho, Seidler, Evans, Baju, 1974; Менликиев, Султанова, 1978; Rayner, 1979; Murdoch, Campana, 1983; Hall, Schreiber, Leben, 1986]; чаще они оказывались заселенными бактериями. Последние в большинстве случаев не патогенны для растений и могут существовать как симбионты в тканях, не вызывая патологические явления [Schandererl, 1939; Sanford, 1948; Tapp, 1975; Murdoch, CampanaR, 1983; Менликиев, Султанова, Шарипова, 1987; Reingold, Hurek, Fendrik, 1987] или ассоциироваться с растением, [Нгуен, Сон, Тарасенко, Козыровская, 1989] обладая азотфиксирующей активностью.
Некоторым бактериям – облигатным паразитам свойственен эндобиоз. Большинство из них не губят пораженные ими клетки растения-хозяина, а наоборот, стимулируют их рост, [Тарр, 1975] вызывая пролиферацию тканей.
Бактерии, живущие в тканях некоторых растений и оказывающие действие на их рост описал А.Zimmermann [1902]; Miehe 1911, [цит. по Красильникову, 1958] выявил особые вещества этих бактерий, вызывающие возбуждение тканей.
Так, ArdisiaThunb не растет без этих бактерий-симбионтов или растет слабо, не цветет и не плодоносит [Jongh,1938]. Присутствие бактерий в тканях фруктов и овощей [Буромский, Матюшенко, 1936; Tervet, Hollis, 1948; Samish, Etinger-Rulczynska, Beck, 1963], корнях сахарной свеклы [Bugbee, Cole, Nielson, 1975; Jacobs, Bugbee, Gabrielson, 1985] и ксилеме корней люцерны [Cagne, Richard, Roussean, Antun, 1987], древесине клена [Hall, Schreiber, Leben, 1986], в нормальных условиях не проявляло никаких изменений.
При исследовании внутренних тканей здоровых растений хлопчатника выявлено заселение их не фитотоксичными бактериями из родов Bacillusи Pseudomonas[Менликиев, Султанова, 1978; Менликиев, Султанова, Шарипо-ва, 1987].
Исходя из выше изложенного, в задачу исследований входило изучение эндофитных бактерий, установление взаимоотношений их с растением и возбудителями болезней, которые имеют важное теоретическое и практическое значение.
Проведённый нами анализ здоровых растений хлопчатника сортов 9883-И и 108-Ф показывает, что в их эндотканях присутствуют различные микро-ороганизмы, среди них доминирующими являются бактерии из рода Вacillus, а в отдельных грибы из родов Fusarium и Aspergillus. При этом в фазу бутонизации хлопчатника заселенность тканей микроорганизмами составляла более 75% общего количества исследованных растений.
Ткани тонковолокнистого хлопчатника сорта 9883-И с типичными признаками фузариозного увядания и черной корневой гнили содержали соответствующие возбудители. Из тканей того же сорта хлопчатника с симптомами черной корневой гнили выделены возбудители фузариозного увядания и черной корневой гнили 57.6 и 22.4% соответственно, где заселенность их бактериями составила 2-4%.
С увядших растений хлопчатника того же сорта были выделены возбудители вертициллезного вилта и черной корневой гнили, 4.2 и 28.5% соответственно. Изолированные микроорганизмы с тканей растений, бактерии составили 6.5%, в том числе виды Alternaria3.1% и Aspergillus 3.7%.
Биологический анализ здоровых растений средневолокнистого хлопчатника сорта 108-Ф показали заселенность бактериями их внутренних тканей. В фазу начала раскрытия коробочек, отдельные ткани растений были заселены грибами из рода Alternaria и Penicillium.
Микробиологические же анализы растений хлопчатника 108-Ф выявили зараженность их тканей (диаграма - 3.1) преимущественно возбудителем вертициллезного вилта и бактерией. У здоровых растений соотношение количества тканей, заселенных возбудителем вилта и бактериями составило: в фазах бутонизации – 1:19, цветения – 1:20 и созревания урожая – 1:14, а у больных растений соответственно – 5:1, 12:1 и 14:1. Если в соотношение количества тканей, заселенных возбудителем вилта к бактериям в фазу созревания урожая преобладающим у больных растений был патоген, то у здоровых оно было в пользу бактерий.
Эндоткани больных вертициллезным вилтом средневолокнистого хлопчатника сорта Киргиз – 3 содержали V. dahliae, Th. basicolaи бактерии – 61.1; 36.2 и 6.2 % соответственно.
Известно, что почва является основным источником заселения растений микроорганизмами. Почвенная микрофлора, ее численность, состав и активность зависят от растительного покрова [Кублановская, 1952]. Селекционирующим фактором микроценоза почвы [Красильников, 1955] является содержащие в ней мертвые растительные остатки.
Дифференцирующее действие растений и их органических остатков на формирование микробных ценозов в почве объясняется различием [Красиль-ников, 1934, 1955] выделений корневых систем. Последние и углекислота почвы, отмершие ризосферные части корней создают специфическую экологию в прикорневой зоне растений [Красильников, 1958], которые способствуют скоплению и развитию в ризосфере определенных видов микроорганизмов. Так, при возделывании люцерны в почве накапливаются миколитические бактерии [Разницына, 1947; Белякова, 1957; Красильников, 1958; Африкян, 1959], корневые остатки которой активизируют размножение всех групп почвенной микрофлоры, особенно бактерий-антагонистов [Палецкая, Киселева, Журавлева, Горина, Сарыева, 1969]. Рис в отличие от люцерны не создает благоприятную экологическую обстановку для многих микроорганизмов [Соловьева, 1956; Соловьева, Васильев, 1961], поскольку под этой культурой происходит бурное развитие бактериальной флоры.
Характеристика биопрепарата cубтилбен .
Одной из определяющих характеристик перспективности микроорганизмов является их антагонистическая активность по отношению к возбудителям болезней растений.
Нами был осуществлен первичный скрининг штаммов эндофитных бактерий с целью отбора среди них перспективных для создания препаратов.
Установив наличие бактерий в эндотканях хлопчатника, мы не имели сведений об их разнообразии и биологических свойствах. Поскольку проводить отбор культур сразу по нескольким параметрам практически невозможно, то критерием первичного скрининга был избран один из главных показателей – антагонистическая активность к фитопатогенным микроорганизмам. В качестве тест-культур использовали возбудителей основных болезней хлопчатника и других сельскохозяйственных растений – V.dahliae, F. oxysporumf. vasinfectum, Th. basicola и X. malvacearum.
В процессе предварительного изучения изолятов эндофитных бактерий выяснилось, что они из растений выделяются в поликультуре. Для исследования морфологических и физиолого-биохимических свойств, а также идентификации этих бактерий потребовалось расчленить полученные изоляты на монокультуры.
Для дальнейшего исследования отобраны более 120 бактериальных изолятов. Они отличались друг от друга большим разнообразием культура-льно-морфологических признаков. По этому в целях первичной идентификации они были разбиты на следующие группы: I группа – колонии белого цвета, неправильной формы, с глубоко изрезанными краями, матовой и блестящей гладкой поверхностью; II группа – светло-бежевые колонии с изрезанным краем, матовой и блестящей поверхностью; III группа – темно-бежевые колонии с глубоко изрезанным краем, шероховато складчатой и гладкой поверхностью; IV группа – слизистые, светло-коричневые колонии с ровным краем, гладкой поверхностью, часто идеально круглой формой; Vгруппа – нежные, тонкие, почти полупрозрачные, белого цвета, неправильной формы колонии с глубоко изрезанными краями, гладкой блестящей поверхностью, сильно преломляющие лучи света, флюоресцирующие. Предварительные исследования показали, что выделенные бактерии состоят из различных штаммов, т.е. они выделяются из растений в поликультуре. Необходимо отметить, что среди изолятов эндофитных бактерий не выявлено фитотоксичных; большенство из них (83,2%) в той или иной степени прявили пектиназную активность на ломтике картофеля.
Среди бактерий, изолированных нами из внутренних тканей растений хлопчатника, прежде всего, необходимо было выявить культуры, характеризующиеся наиболее активными антагонистическими свойствами к фитопатогенным микроорганизмам, и установить их видовую принадлежность.
Антагонистическую активность исследуемых штаммов, выращенных на различных питательных средах, определяли методом агаровых блоков. Все штаммы бактерий проявили антигрибную активность на среде сусло-агар и синтетической среде с кукурузным экстрактом (диаграмма- 4.1.1).
Поскольку основной задачей работы является отбор культур эндофит-ных бактерий для создания препаратов. Мы сочли целесообразным провести углубленное исследование антагонистической активности, в первую очередь тех отобранных штаммов, которые характеризовались (табл.4.1.1) более выраженным действием на подопытные тест - культуры.
Обобщение результатов опытов показало, что не все штаммы бактерий обладают выраженной ингибирующей активностью по отношению к испытанным тест-культурам. Тем не менее, среди них выявлены высокоактивные ко всем - испытанным тест культурам, за исключением F.graminia-rum,F. solaniи F.oxуsporum (табл. 4.1.2). Большинство штаммов обладали высокой и умеренной активностью к Trichoteciumroseum (83.9%), X. malvacearum (65.3%) и X. campestris (52.6%). Только 4 культуры или 5.1% из общего числа исследованных не проявили антагонистической активности ни к одной из исследованных тест-культур грибов и бактерий.