Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 17
1.1 Возбудители черной ножки картофеля 17
1.2 Возбудитель кольцевой гнили картофеля 26
1.3 Особенности оценки устойчивости сортов 32
1.4 Обзор современных методов диагностики бактериозов картофеля 35
1.4.1 Иммунохимические методы диагностики 35
1.4.1.1 ИФА 40
1.4.1.2 ИХА 49
1.4.1.3 ИФМ 53
1.4.2 Молекулярно-генетические методы диагностики 57
1.4.2.1 ПЦР 57
Глава II. Материалы и методы 60
2.1 Реактивы и оборудование 60
2.2 Подготовка образцов бактериальных культур 61
2.3 Получение специфических частей тест-систем ИФА к Cms, Pa и Dic 63
2.4 Получение специфических частей тест-систем ИХА к Cms, Pa и Dic 71
2.5 Разработка классических DAS-ELISA тест-систем ИФА к Cms, Pa и Dic 77
2.6 Разработка тест-систем ИХА в полосочном и точечном форматах к Cms, Pa и Dic 78
2.7 Определение зараженности картофеля Cms, Pa и Dic методом ИФА 78
2.8 Определение зараженности картофеля возбудителем Cms методом realime ПЦР 81
2.9 Сравнительные исследования 85
Глава III. Результаты исследований и обсуждение 92
3.1 Получение специфических частей тест-систем ИФА и ИХА к штаммам Cms, Pa и Dic 92
3.2 Усовершенствование методов диагностики возбудителей бактериозов картофеля 108
3.2.1 Определение аналитических характеристик созданных диагностических тест-систем ИФА для оптимизации условий выявления Cms, Ра и Dic 108
3.2.2 Определение аналитических характеристик созданных диагностических тест-систем ИХА для выявления Cms, Pa и Dic 112
3.2.3 Создание диагностических наборов ИФА серии «Иммунотест» для определения Cms, Pa и Dic 122
3.3 Определение распространения Сms, Pa и Dic на семенном картофеле методом ИФА 128
3.4 Определение распространения Cms на картофеле в России на основе результатов, полученных методом realime ПЦР 134
3.5 Оптимизация условий проведения ПЦР для диагностики Pcc 145
3.6 Сравнение диагностических возможностей ПЦР, ИФА, ИХА и ИФМ при тестировании картофеля на зараженность Сms, Pa и Dic 148
3.6.1 Сравнительное испытание тест-систем для выявления Cms 148
3.6.2 Сравнительное испытание тест-систем для выявления Pa 152
3.6.3 Сравнительное испытание тест-систем для выявления Dic 155
3.6.4 Сравнительное испытание выявления Cms различными комбинациями из трех методов: ИФМ, FLASH-ПЦР и realime ПЦР 158
3.7 Определение оптимальной для культивирования возбудителей бактериозов (на примере Cms) картофеля питательной среды 161
Заключение 166
Практические рекомендации 169
Список литературы 170
Приложения 204
- ИФА
- Сравнительные исследования
- Определение аналитических характеристик созданных диагностических тест-систем ИХА для выявления Cms, Pa и Dic
- Определение оптимальной для культивирования возбудителей бактериозов (на примере Cms) картофеля питательной среды
Введение к работе
Актуальность темы. Важнейшим элементом современных технологий
оздоровления, контроля качества и сертификации семенного картофеля является наличие
комплекса недорогих, высокочувствительных и специфичных методов выявления скрытой
зараженности картофеля возбудителями вирусных, вироидных, бактериальных,
фитоплазменных и грибных болезней.
К числу наиболее вредоносных бактериальных болезней картофеля относят черную ножку и кольцевую гниль. Черную ножку вызывают близкородственные виды пектолитических бактерий из семейства Enterobacteriaceae: Pectobacterium atrosepticum (van Hall 1902) Gardan et al. 2003, comb. nov. (далее - Pa), Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (Jones 1901) Hauben et al. 1999, comb. nov. (далее - Pсc) и виды рода Dickeya Samson et al. 2005, gen. nov. (D. chrysanthemi, D. solani, D. dianthicola (Dickeya sp.) (далее -Dic). Возбудителем кольцевой гнили является бактерия вида Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus (Spieckermann and Kotthoff 1914) Davis et al. 1984,comb.nov. (далее - Cms).
Достоверная диагностика скрытых (латентных) форм возбудителей бактериальных болезней является важнейшим условием для своевременного предотвращения развития и сведения к минимуму на территории России как существующих распространенных бактериозов, так и предотвращения поступающей вместе с импортом дополнительной бактериальной нагрузки и новых форм заболеваний.
Наиболее перспективным для внедрения в семенное картофелеводство является применение комплекса модификаций современных иммунохимических и молекулярных методов, таких как иммуноферментный анализ (далее – ИФА), иммунохроматографический анализ (далее – ИХА), полимеразная цепная реакция - классический метод (далее – ПЦР) и полимеразная цепная реакция в реальном времени (далее - real-time ПЦР).
Степень разработанности темы.
Рыночные отношения в сфере торговли посадочным и семенным материалом делают актуальной задачу приведения в соответствие действующих стандартов качества посевного материала и сельскохозяйственной продукции с правилами, принятыми Европейской и средиземноморской организацией по карантину и защите растений (EPPO) и Международной ассоциацией тестирования семян (ISTA). Очевидно, что в России необходимо обеспечение аккредитованных лабораторий по добровольной сертификации семенного картофеля в системе ФГБУ «Россельхозцентр» недорогими и чувствительными отечественными диагностическими средствами.
В этой связи имеется необходимость усовершенствования существующих и разработки новых более надежных и чувствительных методов диагностики.
Цель исследований - разработка диагностических тест-систем на основе ИФА, ИХА и ПЦР для выявления скрытой заражённости возбудителей чёрной ножки и кольцевой гнили картофеля, а также проведение мониторинга распространенности возбудителей черной ножки и кольцевой гнили картофеля в регионах Российской Федерации методами ИФА и real-time ПЦР.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- создать диагностические тест-системы ИФА на основе лучших полученных партий специфических антисывороток к коллекционным штаммам Cms, Pa, Dic и провести испытания эффективности выявления скрытой заражённости возбудителей чёрной ножки и
кольцевой гнили картофеля с помощь разработанных тест-систем в сравнении с импортными коммерческими наборами и альтернативными методами;
создать моно- и мульти-параметрические диагностические тест-системы ИХА к Cms, Pa, Dic в полосчатом и точечном форматах на основе лучших полученных партий специфических антисывороток и провести испытания эффективности выявления скрытой заражённости возбудителей чёрной ножки и кольцевой гнили картофеля с помощь разработанных тест-систем в сравнении с импортными коммерческими наборами и альтернативными методами;
усовершенствовать методы ПЦР-анализа для тестирования зараженности картофеля возбудителем кольцевой гнили (Cms) и черной ножки (Pcc) путем модифицирования и подбора режимов амплификации с последующим анализом нуклеотидной последовательности ампликонов;
с помощью разработанных методов провести мониторинг распространения скрытых (латентных) форм возбудителей кольцевой гнили и черной ножки в семенном и продовольственном картофеле из различных регионов России.
Научная новизна.
Впервые в Российской Федерации созданы диагностические тест-системы ИФА и ИХА (к Cms, Pa, Dic), сравнительные испытания которых показали, что они не уступают по диагностическим возможностям импортным аналогам.
Проведена модификация протокола ЕОКЗР метода real-time ПЦР, используемого для выявления Cms, который с успехом применён для массового тестирования семенного и продовольственного картофеля на зараженность возбудителем кольцевой гнили.
Проведена оптимизация температурно-временных условий ПЦР с праймерами Еса001F;R для выявления Pcс, что позволяет диагностировать его в формате классического ПЦР и дает возможность в перспективе создать тест-систему real-time ПЦР для более надежного выявления этого патогена.
Впервые в Российской Федерации с помощью разработанных нами тест-систем ИФА к возбудителям черной ножки и кольцевой гнили проведен мониторинг зараженности оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля из различных регионов России скрытыми формами возбудителей черной ножки и кольцевой гнили картофеля, на основе которого сделано заключение о степени их распространения.
Впервые в Российской Федерации проведены исследования по определению зараженности возбудителем кольцевой гнили (Cms) более 2000 партий семенного и продовольственного картофеля методом real-time ПЦР.
Теоретическая и практическая значимость.
Созданы и апробированы диагностические наборы ИХА для выявления трех основных возбудителей бактериальных болезней картофеля – Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum и Dickeya sp., не уступающих по диагностическим возможностям зарубежным аналогам.
Созданы и апробированы иммуноферментные диагностические наборы нового поколения, позволяющие без снижения чувствительности выявления бактериальных патогенов – Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum и Dickeya sp. по сравнению с производимыми на базе ФГБНУ ВНИИКХ наборами ИФА в 10-20 раз снизить расход наиболее дорогостоящих специфических частей диагностических наборов.
Впервые методами ИФА и real-time ПЦР проведена оценка фактического распространения латентных форм возбудителей бактериозов в семенном картофеле – зараженность Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum и Dickeya sp. оценена в разрезе оригинального, элитного и репродукционного семенного картофеля в зависимости от сорта и времени проведения анализа.
Методы диссертационного исследования. При проведении исследований использовали как новые оригинальные модификации существующих методов, так и стандартные, общепринятые диагностические методы, которые подробно изложены в разделе «Материалы и методы» соответствующей главы диссертации.
Положения, выносимые на защиту:
-
Оригинальная схема иммунизации лабораторных животных коллекционными штаммами Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum и Dickeya sp.
-
Диагностические тест-системы ИФА и ИХА, созданные на основе лучших антисывороток к штаммам Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum и Dickeya sp., и коммерческие диагностические наборы ИФА и ИХА для определения Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum и Dickeya sp..
-
Распространенность возбудителей чёрной ножки и кольцевой гнили картофеля в различных регионах Российской Федерации на основе результатов, полученных методами ИФА и real-time ПЦР.
Апробация результатов работы.
Результаты исследований были представлены на 8-и международных научных конференциях: «Мировые генетические ресурсы картофеля и их использование в современных направлениях селекции» (к 125-летию со дня рождения Н.И. Вавилова) (ГНУ ВНИИКХ Россельхозакадемии, Москва, 2012), Второй съезд аналитиков России (Москва, 23-27 сентября 2013), шестая межрегиональная научно-практическая конференция «Современная индустрия картофеля: состояние и перспективы развития» (Чебоксары, 2014), «Методы биотехнологии в селекции и семеноводстве картофеля» (Московская область, ГНУ ВНИИКХ Россельхозакадемии, 2014), «Биотехнология и качество жизни» (Москва, 18-20 марта 2014), «Биотехнологии в комплексном развитии регионов» (15-17 марта 2016, Москва, Новый Арбат, 36), «Современное картофелеводство Евразийского содружества: от науки до практики» (РУП «Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству» - аг. Самохваловичи, 12-14 июля 2016), «Сельскохозяйственные науки: научные приоритеты учёных» (г. Пермь, ноябрь 2016).
Публикации. По результатам исследований, основные научные результаты настоящей диссертационной работы опубликованы в 19 научных изданиях, 2 из которых – в текущем перечне рецензируемых ВАК РФ журналах, 4 входят в журналы, включенные в реферативные базы Web of Science и Scopus.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, практических рекомендаций, списка литературы и 14 приложений. Материал изложен на 203 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 53 рисунка. Библиографический список включает 252 наименования, из них 165 иностранных и 8 электронных ресурсов.
ИФА
Применение микропланшетного твердофазного ИФА (ELISA- enzyme-linked immunosorbent assay), на основе метода двойного «сэндвича» АТ, впервые описанно Voller A. и др. (1976) [245] при обнаружении вирусов растений и характеризуется как легко доступный, дешевый, надежный и чувствительный метод анализа. В первоначальных исследования, по вирусу мозаики ризухи и вирусу шарки сливы [89] показано, что чувствительность анализа может достигать до 1-10 нг/мл вируса. Детальные исследования были проведены Clark M.F. с сотрудниками [105], которые определили оптимальные условия для проведения таких анализов и показали в своих ранних исследованиях, что вирус хлоротической кольцевой пятнистости яблони [94], вирус мозайки хмеля [89, 228] и многие другие могут быть легко обнаружены и исследованы.
В дальнейшем перечень исследуемых вирусов постоянно актуализировался и включал в себя: вирус мозаики яблока, вирус мозаики огурца, вирус аспермии, вирус бороздчатости ствола яблони, вирус хлоротической пятнистости яблони, желтой карликовости ячменя, вирус полосчатой мозаики ячменя, цитрусовый тристеза вирус, вирус мозаики нарциса, картофельные вирусы А и Y, вирус скручивания листьев картофеля, передаваемый семенами вирус гороха, вирус розеточной мозаики персика, вирус кольцевой пятнистости малины, вирус мозаики сои, вирус кольцевой пятнистости табака, вирус погремковости табака и вирус кольцевой пятнистости томата. В те же годы исследований, степень гетерологичных реакций между вирусами была изучена и охарактеризована в деталях [159] и разработаны тест-системы ИФА к Corynebacterium [104] и Spiroplasma [106].
В дальнейшем ИФА начали использовать гораздо шире, в том числе при мониторинге токсинов, загрязняющих пищевые продукты, и для определения показателей общего загрязнения окружающей среды. Krysinski E.P. и др. (1977) [160] показали, что сальмонеллы могут быть обнаружены в пищевых продуктах и афлатоксин также может быть определен [163] с помощью очень чувствительного варианта ИФА. Таким образом, можно отметить, что ИФА нашел широкое применение в сельском хозяйстве и проложил путь для дальнейшего использования иммунологических анализов всех типов, проводимых в настоящее время.
Иммуноферментный анализ (ИФА) основан на использовании АТ, ковалентно связанных с ферментом. Для синтеза конъюгатов наиболее часто используют пероксидазу хрена или щелочную фосфатазу. ИФА был предложен в 1970-хх гг. и до сих пор является одним из самых распространенных способов диагностики инфекций растений. Метод демонстрирует высокую чувствительность (порог чувствительности 104-105 бактериальных клеток на мл клубневого/стеблевого/листового экстракта), специфичность и производительность. Диагностика фитопатогенов методом ИФА хорошо зарекомендовала себя в широкомасштабных рутинных тестированиях растительного материала [4]. Данный метод на практике не уступает по уровню чувствительности, основанным на том же иммунохимическом принципе, методам ИХА и ИФМ [12]. Тест дешев и достаточно быстр, чтобы относить его к группе экспресс методов диагностики, но возможны случаи, когда он дает ложноположительные результаты (кросс-реакция) и ложноотрицательный результат (ингибирование реакции антиген-АТ растительными компонентами экстрактов листьев, стеблей или клубней). Требования к специфичности и активности используемых антисывороток чрезвычайно высоки.
Разделяют два основных подхода применения ИФА: жидкофазный и твердофазный.
Жидкофазный вариант может быть реализован в однофазной системе – в растворе и поэтому называется гомогенным. Это ИФА без предварительного физического разделения меченых АТ или антигенов от их иммунохимических комплексов – продуктов реакции.
Твердофазный вариант – гетерогенный ИФА, с физическим разделением с помощью твердой фазы, связывающей один из компонентов иммунологической реакции. В качестве твердой фазы используют стенки сосудов, в которых проводится анализ. Эти сосуды изготавливаются в виде специальных планшетов из непористых прозрачных полимерных материалов: полистирола, поливинилхлорида, полиметакрилата. Белки (антигены или АТ) адсорбируются на поверхности пластика – и на этом принципе базируется твердофазный ИФА [77] (рис. 6).
Данный вариант ИФА, предназначенный для обнаружения и количественного измерения антигена, осуществляется следующим образом:
1. специфичные АТ (или иммуноглобулины, содержащие специфичные АТ или очищенные специфические антитела) присоединяются к твердой фазе, которую затем промывают;
2. добавляется раствор анализируемого образца, предположительно содержащий антиген, а затем планшет с сенсибилизированной твердой фазой инкубируют и потом промывают;
3. добавляются меченые ферментом специфические АТ к антигену, затем твердая фаза инкубируется и промывается;
4. добавляется субстрат фермента - оптическая плотность продукта ферментативной реакции пропорциональна количеству антигена, внесенного в лунку на 2 стадии.
Если в качестве маркерного фермента используется пероксидаза хрена, то образующийся комплекс антиген-АТ выявляют с помощью конъюгата АТ к определяемому антигену с пероксидазой хрена. Количество связавшегося конъюгата выявляют с помощью раствора субстрата (например, смесь ТМБ и перекиси водорода в буфере). Интенсивность окраски продукта окисления хромогенного компонента субстратной смеси при А450 пропорциональна концентрации определяемого антигена, содержащегося в анализируемом образце.
При данных подходах возможны множества вариантов модификации ИФА, наиболее часто применимые отображены на рисуноках 7, 8. Кроме того, для увеличения прочности связывания белков, пластик может подвергаться обработке глутаровым альдегидом или другими модификаторами (которые как правило составляют комерческую тайну фирмы производителя) таким образом, что активированная поверхность приобретает способность к ковалентному связыванию белков. После сорбции на поверхности пластика несвязавшиеся антитела отмываются с поверхности лунок, и далее проводят анализ согласно приведенной схемы [71].
Данный вариант ИФА (рис. 7), предназначенный для обнаружения и характеризации антигена, осуществляется следующим образом:
1. иммуноглобулины, содержащие специфические АТ (например, из кроличьей антисыворотки) наносят на твердую фазу, инкубируют и затем промывают;
2. добавляется раствор анализируемого образца, предположительно содержащий антиген, а затем планшет с сенсибилизированной твердой фазой инкубируют и потом промывают;
3. добавляется раствор иммуноглобулинов, содержащий специфические АТ, и производят инкубацию с последующей промывкой -данные иммуноглобулины должны быть выделены из антисыворотки отличной по видовому признаку к тем, что на 1 шаге (например, выделенные из козьей или овечьей антисыворотки);
4. добавляется меченые ферментом анти-иммуноглобулины и инкубируется с последующей промывкой - данные анти-иммуноглобулины должны быть получены к иммуноглобулинам, используемым на стадии 3 (например, овцы или козы) и не должны вступать в реакцию с иммуноглобулинами, использованными для покрытия пластины (как в данном случае – кролика);
5. добавляется субстрат фермента - интенсивность окрашивания лунок пропорциональна количеству антигена, внесенного в лунки на 2 стадии.
Кроме того, в данном формате тройного «сэндвича» АТ, разработан варианты с образованием комплексов авидин-биотин (avidin-biotin complex «ABC-ELISA») и стрептовидин-биотин (labelled streptavidin-biotin «LSAB ELISA»), где вместо вторичных АТ используются коньюгаты первичных АТ с биотином, а вместо меченых ферментом АТ - используются коньюгаты авидина или стрептовидина с ферментами (пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза). Такой вариант используется в иследованиях, как правило, для оценки антигенного родства гомологичных и гетерологичных антигенов.
Достоинством данного подхода является универсальность конъюгата, используемого для анализа различных антигенов и повышение чувствительности регистрации образуемого иммунохимического комплекса.
Поскольку «молекула стрептовидина обладает также четырьмя высокоафинными центрами связывания биотина, но имеет изоэлектрическую точку, близкую к нейтральной, и в меньшей степени склонной к неспецифическому связыванию с АТ» [29], то применение формата «LSAB -ELISA» наиболее предпочтительно.
Данный вариант ИФА (рис. 8), предназначенный для обнаружения и характеризации АТ, проводится следующим образом:
1. соответствующий антиген сорбируется к твердой фазе, которую затем промывают;
2. добавляется раствор сыворотки, и производится инкубация с последующим промыванием;
3. добавляется меченый ферментом анти-видовой глобулин, который прикрепляется к АТ, после чего повторяют промывку - в данный момент могут быть также использованы немаркированные анти-видовые глобулины в комбинации с меченым антигеном и этим вторым АТ;
4. добавляется субстрат фермента - оптическая плотность продукта ферментативной реакции пропорциональна количеству антигена, внесенного в лунку на 2 стадии.
Сравнительные исследования
В сравнительных исследованиях ИФА использовали 96-луночные прозрачные полистироловые микропланшеты Greiner Bio1 HB (Grainer, Германия) и ООО «Медполимер» (Россия), а также диагностические наборы ИФА к исследуемым возбудителям фирмы «Loewe Biochemica» (Германия), использующие щелочную фосфатазу в качестве маркерного фермента. Анализы проводили согласно инструкции фирмы-производителя. При постановке ИФА использовали методику, принятую в отделе биотехнологии и иммунодиагностики, ФГБНУ ВНИИКХ им. А.Г. Лорха, адаптированную для идентификации бактерий [11].
Оптическую плотность продукта реакции определяли с помощью многофункционального микропланшетного детектора ZENYTH 3100 (Anthos Labtec Instruments, Австрия).
Для проведения ПЦР в рамках сравнительных испытаний тест-систем из 200 мкл растительных экстрактов каждого образца выделяли бактериальную ДНК с использованием набора Проба-ГС (ДНК-технология, Москва) согласно рекомендациям производителя. ПЦР проводили с праймерами Eca1f/2r [115], специфичными к фрагменту хромосомальной ДНК Pa, равному 690 п.н. В качестве положительного контроля использовали ДНК Pa18077, в качестве отрицательного – листья и клубни здорового картофеля [236]. ПЦР проводилась в амплификаторе ATC 201 (Nyx Technic, США) при следующих температурно-временных режимах: преденатурация (95 С, 5 минут); 36 циклов, включающих денатурацию (94 С, 30 секунд), отжиг (62 С, 45 секунд) и элонгацию (72 С, 45 сек); конечная элонгация (72 С, 8 минут). После окончания амплификации ампликоны разделяли в 1,5 % агарозном геле с бромистым этидием в 0,5-кратном ТБЕ-буфере, результаты документировали с помощью системы BioDocIt (UVP, Великобритания).
В процессе выполнения диагностических постановок методом real time ПЦР (указанным выше регламентом) выполнялась параллельная идентификация на этих же образцах (партиях) картофеля наличия Cms методами ИФМ и FLASH-ПЦР с целью определения диагностических возможностей перечисленных техник и подтверждения результатов, полученных realime ПЦР методом, тестами иного механизма действия.
Проведение ИФМ анализа осуществлялось по следующей методике.
1) Предварительная подготовка. Подготавливались к использованию, рекомендуемые для проведения ИФМ, десятилуночные предметные стёкла с диаметром лунки не менее 6 мм (фирма ICN).
Использовались нативные антисыворотки против Сms с титром не менее 1:2000 в НИФМ. Каждая новая партия антисывороток проходила следующее тестирование:
а) Суспензия 106 кл/мл Сms в объеме 20 мкл наносилась на лунки предметного стекла, подсушивалась на плитке при температуре не выше 40С и фиксировалась на стекле путем добавления 20 мкл холодного ацетона.
б) Подготавливалось соответствующее количество двукратных серийных разведений нативной антисыворотки, учитывая их концентрацию (напр. 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200 и т.д.); на лунки в порядке убывания концентрации АТ наносились последовательно разведения в объёме 20 мкл.
в) Стекло помещалось на влажную фильтровальную бумагу и инкубировалось 30 минут в темноте при комнатной температуре, в накрытом крышкой поддоне. Затем стряхивались капли сыворотки и стекло промывалось путем помещения его на 3 минуты в PBS (приложение 5), с последующим погружением сначала на 3 минуты в PBS, а затем быстрым однократным погружением в дистиллированную воду и аккуратным подсушиванием фильтровалкой.
г) Наносился конъюгат козьих АТ против иммуноглобулинов кролика, меченный FITS (флуоресцеинизотиоцианатом) в объеме 20 мкл и инкубировался с последующей промывкой (как указано выше) и приготовлением препарата для микроскопирования путем нанесения 5-10 мкл 0,1 М фосфатно-глицеринового буфера (приложение 5) на каждую лунку стекла и накрыванием покровным стеклом.
д) Препарат просматривался под люминесцентным микроскопом.
Наблюдаемые клетки должны быть равномерно прокрашены по всей поверхности ярко флуоресцирующим зеленоватым красителем. Далее определялось разведение, на котором уровень флуоресценции снижается (это разведение № 5). Отсчитывалось от разведения № 5 включительно 5 разведений по возрастанию концентрации y нативной сыворотки. Это и были рабочие разведения данной сыворотки (С, С/2, С/4, С/8, С/16).
2) Проведение анализа. А) Подготавливались отдельные стекла с положительным контролем (суспензия - 106 кл/мл Cms) и положительный контроль для каждой серии образцов. Положительный контроль промывался отдельно от образцов.
На отдельное стекло или на первые лунки каждого стекла (рис. 20) в качестве отрицательного контроля наносились по 20 мкл PB-буфера, используемого для приготовления суспензии образцов (их промывка проводилась совместно с образцами).
Б) Далее наносился стандартный объем суспензии – 20 мкл для 6-миллиметровых лунок (для лунок большего диаметра объем следует скорректировать) на 1 ряд лунок стекла. Другой ряд использовался для дублирования повторностей.
Если предполагалось наличие высокой концентрации патогена в образце (предварительно выявлена высокая концентрация патогена методами ПЦР), то проводилось приготовление разведения 1/100 (10 мкл образца суспендировалось в 990 мкл PB) и 20 мкл наносились на первую лунку стекла. В) Стекла подсушивались при комнатной температуре или на плитке при температуре не выше 40 С. Потом бактериальные клетки фиксировались на стекле холодным ацетоном.
Г) Подготавливалась серия последовательных 2-кратных разведений АТ в РВS:
- Вычислялся необходимый объем разведений (V), равный (N+l) х 20 мкл, где N - количество образцов (включая положительный контроль).
- ИФ-буфер вносился в 5 флаконов в объеме, равном полученному значению V. В шестой (вспомогательный) флакон вносился PBS в объеме, равном 2V.
- Во вспомогательном флаконе подготавливалось и тщательно перемешивалось разведение АТ, равное 2С.
- Из вспомогательного флакона отбиралось разведение в объеме, равном V и переносилось во флакон № 1, получая таким образом разведение, равное С объемом 2V. Далее процедура повторялась для всех флаконов, получая последовательные 2-х кратные разведения необходимого объема V (во флаконе № 5 объем равнялся 2V).
Оставшееся вспомогательное разведение хранилось при +4 С в течение суток и использовалось для приготовления новой серии разведений.
Д) Стекла помещались на влажную фильтровальную бумагу. На лунки с образцами наносились разведения нативной антисыворотки.
В данном случае в качестве вспомогательного используется разведение № 1, а объем разведения № 2 увеличивался в 2 раза в расчете на отрицательный контроль.
Е) Затем, накрытый крышкой поддоном со стеклами в течении 30 минут инкубировали при комнатной температуре в темноте.
Ж) Далее, капли сыворотки стряхивались со стекол. Стекла промывались 3 минуты в PBS и затем 3 минуты в PBS и дистиллированной воде и аккуратно подсушивались фильтровальной бумагой.
З) Стекла помещались на влажную фильтровальную бумагу и на лунки с образцами наносился раствор конъюгата.
И) Накрыв поддон со стеклами крышкой, проводилась инкубация 30 минут при комнатной температуре в темноте.
К) Капли конъюгата со стекол стряхивались. Стекла промывать как указано выше и аккуратно подсушивались фильтровальной бумагой.
Л) На каждое окошко наносилось 5-10 мкл 0,1 М фосфатно-глицеринового буфера и накрывалось покровным стеклом.
Считывание результатов ИФМ-анализа. Стекла просматривались под флуоресцентным микроскопом с фильтрами, подходящими для излучения FITC, с масляной иммерсией и увеличением 500-1000 раз. Лунки просматривались, начиная с наибольшей концентрации нативной антисыворотки, по двум взаимно-перпендикулярным диаметрам и по периметру. В первую очередь анализировался положительный контроль. Клетки его должны быть ярко-флуоресцирующими и полностью прокрашенными.
Определение аналитических характеристик созданных диагностических тест-систем ИХА для выявления Cms, Pa и Dic
Ниже представленные исследования проводились на базе института биохимии имени А.Н. Баха РАН (ИНБИ РАН) совместно с сотрудниками лаборатории иммунобиохимии [74].
Разработка и характеристика моно- и мультипараметрических ИХА тест-систем в полосочном формате.
Для обеспечения достаточной интенсивность окраски контрольных и тестовых зон тест-полоски в положительных пробах при отсутствии фонового окрашивания при анализе экстрактов здоровых клубней и листьев картофеля подбиралась концентрация конъюгированных АТ-НКЗ, по показаниям оптической плотности при А520 в интервале от 0,5 до 6,0. Интенсивность окраски аналитической и контрольной зон увеличивалось с увеличением А520. При А520 = 5,0, интенсивность в тестовой зоне оставалась неизменной, при достаточной интенсивности окрашивания в контрольной зоне, что и определило необходимые разведения конъюгата. Таким образом, разведение конъюгата с А520 = 5,0 было использовано в дальнейших экспериментах.
Максимальная интенсивность окраски в тестовой и контрольной зонах достигалась при осаждении АТ из раствора с концентрацией 0,7 мг/мл (при плотности осаждения 0,2 мкл/мм) и не повышалась при более высоких концентрациях (данные не представлены). В результате эта концентрация была выбрана для использования в ИХА. Антикроличьи АТ для контрольных зон наносили на мембрану из раствора с концентрацией 0,7 мг/мл, чтобы получить максимальную интенсивность окраски контроля.
На основании результатов оптимизации были изготовлены моно- и мультипараметрические иммунохроматографические тест-системы для детекции Cms, Pa и Dic. Аналитические характеристики тест-систем изучали с использованием стандартных суспензий бактериальных препаратов в концентрации от 102 до 108 кл/мл. В контрольной зоне были иммобилизованы АТ, специфичные к кроличьим АТ (1 мг/мл), в аналитической зоне - антитела, специфичные к Cms, Ра и Dic (1,5 мг/мл). Оптическая плотность конъюгата АТ с НКЗ составляла 5,0. На рисунках 37, 38 и 39 в качестве примера представлен внешний вид тест-систем для детекции единственного антигена в пробе: Cms, Ра и Dic соответственно, а также характерные зависимости интенсивности окраски аналитической зоны от концентрации добавленной бактериальной суспензии в трех вариантах исполнения (экстракт листьев, клубневой экстракт и буфер), представляющие возрастающую зависимость интенсивности окраски, считываемой Рефлекомом, от концентрации бактерий в пробе для аналитической зоны. Монопараметрические тест-системы на основе полученных поликлональных АТ и НКЗ со средним диаметром 20 нм, наносимых в виде линий, в оптимизированных условиях метода ИХА обеспечивают детекцию антигенов в пределах от 104 - 105 кл/мл и выше - для Cms (испытана на штаммах в трёхкратной повторности: Cms204, CmsM1, CmsM2, CmsR77) (приложение 9), Ра (испытана на штаммах в трёхкратной повторности: Pa393, Pa18077) и Dic (испытана на штаммах в трёхкратной повторности: DicD17, DicD9, DicDFil) и позволяют анализировать экстракты картофеля в течение 10 минут с визуальным пределом обнаружения 1 105 КОЕ/мл для листьев и 4105 кл/мл для клубней. В соответствии с принципом двойного «сэндвича» АТ варианта ИХА интенсивность окраски тестовых зон постепенно возрастает с увеличением концентрации анализируемого вещества в образце.
На представленных изображениях (рис. 37, 38, 39) приняты следующие обозначения: А) - контрольная зона; Б) - аналитическая зона; В) - предел визуальной детекции; Г) – предел детекцией Рефлекомом; Д) – средний показатель, учитывающий все детектируемые штаммы патогенов, их повторности и характер экстракта в котором находится анализируемый образец; Е) – порог достоверности реакции.
Таким образом, интенсивность окрашивания и ее зависимость можно контролировать визуально или использовать количественные данные, характеризующие интенсивность окраски. Мультипараметрические тест-системы [73] на основе поликлональных АТ, предполагающие три аналитические зоны, наносимые в виде линий, также обеспечивают детекцию антигенов в пределах 104 - 105 кл/мл - для Cms, Ра и Dic. Приведены данные испытания на смеси штаммов: Cms204, Pa393 и DicD9 в трёхкратной повторности. (рис. 40, 41, 42).
Полученные значения существенно ниже обычного уровня накопления бактериальной инфекции в клубнях картофеля [154].
На представленных рисунках приняты следующие обозначения: А) – контрольная зона; Б) - аналитическая зона; В) – предел визуальной детекции; Г) – предел детекцией Рефлекомом; Д) – средний показатель для моно- и мульти-параметрической тест-системы, учитывающий трёхкратную повторность анализируемого образца; Е) – порог достоверности реакции. Результаты исследований также свидетельствуют об отсутствии критичных различий в применении моно- и мультипараметрического формата ИХА.
Пороговые фоновые значения предела детекции вышеуказанных тест-систем в моно- и мультипараметрическом формате определялись путем измерения Рефлекомом их максимальных фоновых значений при взаимодействии со штаммами близкородственных патогенов (для Pa и Dic – штамм Pcc Рсс30168; для Сms – Cmm штамм Cmm1208), а также сапротрофами, выделенными путем высева на питательную среду и инкубирования в течении 48 часов при 270 С, из листового и клубневого экстрактов, в концентрации соответствующей не менее 108 кл/мл. Постановку проводили в трехкратной повторности (табл. 9).
Определение оптимальной для культивирования возбудителей бактериозов (на примере Cms) картофеля питательной среды
Перед многими бактериологами стоит комплекс следующих задач:
- подбор оптимальной для выращивания чистых бактериальных культур агаризованной питательной среды;
- подбор оптимальной не агаризованной питательной среды для выращивания возбудителей бактериозов, потенциально содержащихся в конкретных растительных экстрактах (содержащих высокий сапротрофный фон), для дальнейшего проведения диагностических мероприятий в форматах «БИО-» и «Enrichment-ELISA» (вариант ИФА включающий размножение целевых бактерий в ходе анализа), тем самым увеличивая чувствительность конкретного метода диагностики;
- поиск наиболее удобного формата проведения как вышеуказанных мероприятий, так и для выделения патогена в чистую культуру из конкретного образца наиболее оптимальным способом, используя микропланшеты из оптического прозрачного полистирола для культивирования бактерий и высокочувствительное лабораторное оборудование для считывания показаний роста числа клеток в лунках планшета [83].
Для решения данных задач, на примере возбудителя кольцевой гнили картофеля, были проведены исследования и сравнительный анализ четырех вариантов питательных сред (без агара) на коллекционных штаммах Сms, инкубируемых в полистироловом 96-луночном микропланшете с плоским дном (фирма - Corning) предназначенной для культивирования бактерий. Считывание результатов проводилось на микропланшетном ридере Model 680 (Bio-Rad, США) при длине оптического фильтра 655 нм.
В испытаниях использовали как универсальную питательную среду для культивирования бактерий YDС (приложение 5), так и полуселективные питательные среды NCP-88 и MNTA (приложение 5), в базовый состав которых входят антибиотические селективные компоненты.
В ходе подготовки, из состава всех вышеуказанных питательных сред исключался агар. Кроме того, питательная среда YDC (из состава которой исключался и CaCO3, не позволяющий питательной среде оставаться прозрачной) испытывалась в двух вариантах: 1) – базовая, в состав которой входит глюкоза; 2) – модификация, в составе которой вместо глюкозы использовался D-Mannitol (D-mannit – 26,67 мл в 200 мл питательной среды).
После автоклавирования вышеуказанных питательных сред (по 200 мл каждая) и остывания их до 500 С, к их аликвотам добавлялись, соответствующие их базовому составу (приложение 5), антибиотики:
- trimethoprim (40 мкл к 10 мл питательной среды);
- amphotericin B (5 мл воды во флакон – из него 1 мл – и в него добавляется 4 мл воды – из которой 10 мкл добавляется к 10 мл питательной среды);
- nalidixic acid (на 10 мл питательной среды бралось 40 мкл 0,05 % -5 мг/мл раствора в метаноле);
- polymyxin B (брались 5 мг препарата и растворялись в 10 мл воды, из раствора 60 мкл на 10 мл питательной среды);
- cycloheximide (в раствор из 520 мкл воды и 480 мкл спирта добавлялось 5 мг вещества и от туда в 10 мл питательной среды добавлялось 400 мкл).
Питательные среды (в стерильных условиях) из аликвот наносились по соответствующей схеме в микропланшет в объеме 100 мкл, и в которые также добавлялись предварительно подготовленные суспензии коллекционных штаммов Cms (CmsC1, CmsC3, Cms12, Cms204) в двух концентрациях (108 и 109 кл/мл) и в двух повторностях в соответствующие лунки согласно представленной в таблице 30 схемы.
Затем проводилось начальное измерение оптической плотности образцов перед инкубированием. Для сохранения стерильности, все межоперационные манипуляции с планшетой проводили, закрывая ее парафильмом и крышкой.
Далее проводилась инкубация закрытой планшеты на шейкере (100 об/мин) в термостате при 270 С в течении 48 часов. После чего производилось второе контрольное измерение показаний роста оптической плотности образцов (табл. 30).
Учитывая полученные результаты, как для решения поставленных ранее задач, так и для данного формата проведения исследований, из четырех рассматриваемых вариантов питательных сред, наиболее перспективно использование универсальной питательной среды YDC (без CaCO3, вместо глюкозы маннитол), а также полуселективной питательной среды для выделения Cms - MNTA (в составе которой предусмотрено применение антибиотиков). Также, данные исследования создают предпосылки к дальнейшей работе по подбору оптимальной концентрации антибиотических компонентов питательных сред, для увеличения активности роста целевого патогена при использовании селективных питательных сред.
Кроме того, показатель НСР05 для частных различий у штамма Cms204 подтверждает высокую активность самой культуры в сравнении с представленными показателями у других штаммов, которые его не превысили. Данный факт, в свою очередь косвенно подтвердил необходимость получения именно на основе этого штамма специфических частей к диагностикумам, описанным ранее в настоящей работе.
Также, было важным оценить возможности применения конкретных антибиотических селективных вышеиспользованных компонентов в работе по подбору оптимальной их концентрации для увеличения активности роста целевого патогена при использовании вместо питательных сред для культивирования - клубневых экстрактов картофеля. Брался клубневой экстракт картофеля, полученный в ходе стандартной пробоподготовки из 200 клубней, изначально предназначенный и проверенный на отсутствие бактериозов картофеля методами ИФА и ПЦР. Затем клубневой экстракт наносился во все 96 лунок микропланшета в объеме по 100 мкл, и в половину всех лунок с клубневым экстрактом добавлялась предварительно подготовленная суспензия штамма Cms204 в концентрации 108 кл/мл (табл. 32). После этого, в лунки каждой половины планшеты индивидуально