Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Насекомые-вредители и их вредоносное воздействие 11
1.1.1. Влияние насекомых-вредителей на урожайность сельскохозяйственных культур 11
1.1.2. Влияние насекомых-вредителей на агроэкологию 18
1.1.3. Влияние насекомых-вредителей на здоровые человека и окружающую среду 22
1.1.4. Интегрированный контроль популяции насекомых-вредителей с целью защиты растений: краткий исторический обзор развития и применения метода 26
1.2. Инсектициды 36
1.2.1. Биологические инсектициды, механизм их действия и токсичность 39
1.2.2. ДНК-инсектициды 47
Глава 2. Материалы и методы 53
2.1. Материалы 53
2.1.1. Место выполнения работы 53
2.1.2. Насекомые, использованные в опытах 53
2.1.3. Патогены насекомых 54
2.1.4. Растения, использованные в опытах 54
2.1.5. Фрагменты одноцепочечной ДНК 55
2.1.6. Реагенты 56
2.1.7. Лабораторное оборудование 57
2.2. Методы 58
2.2.1. Выращивание насекомых и уход за ними 58
2.2.2. Протокол инфицирования насекомых 58
2.2.3. Выращивание растений и уход за ними 58
2.2.4. Применение оцДНК-фрагментов 59
2.2.5. Исследование обработанных насекомых и растений 60
2.2.6. Статистический анализ 67
Глава 3. Результаты исследований 68
3.1. Высокий летальный эффект на личинках непарного шелкопряда Lymantria dispar L в ответ на контактные и пероральные применения ДНК-инсектицидов 68
3.2. Эффект действия ДНК-инсектицидов на личинках плодовой мухи Drosophila melanogaster M. как модельном организме 73
3.3. Оценка селективного и специфического действия ДНК-инсектицидов на личинках капустной совки (Trichoplusia ni H.), табачного бражника (Manduca sexta L.), совки ипсилон (Agrotis ipsilon H.) и имаго амбарного долгоносика (Sitophilus granarius L.) 78
3.4. Оценка влияния концентраций ДНК-инсектицидов на проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) в качестве модели нецелевого растительного организма 82
3.5. Влияние ДНК-инсектицидов на биохимические показатели, важные для роста и развития деревьев дуба (Quercus robur L.) и яблони садовой (Malus domestica M.) 91
Глава 4. Заключение 95
4.1. Обсуждение 95
4.1.1. Действие ДНК-инсектицидов на целевые и нецелевые виды насекомых 96
4.1.2. Действие ДНК-инсектицидов на нецелевые растительные организмы 101
4.1.3. Экономические перспективы применения ДНК-инсектицидов 105
4.2. Выводы 107
Приложения 142
- Влияние насекомых-вредителей на урожайность сельскохозяйственных культур
- ДНК-инсектициды
- Эффект действия ДНК-инсектицидов на личинках плодовой мухи Drosophila melanogaster M. как модельном организме
- Действие ДНК-инсектицидов на целевые и нецелевые виды насекомых
Влияние насекомых-вредителей на урожайность сельскохозяйственных культур
Как правило, под понятием «вредитель» традиционно подразумевается любой организм растительного или животного происхождения, способный приносить вред другим растениям, животным, а также людям в сфере сельского хозяйства, лесозаготовительной промышленности, животноводстве, окружающей среде в целом (Klimov и Tolstikov, 2011). Вредителей принято делить на три категории, а именно: регулярные вредители, спорадические вредители и потенциальные вредители (Cramer, 1967). Регулярные вредители, как правило, встречаются в больших количествах во время сельскохозяйственного сезона (к примеру, цикады настоящие, тли настоящие и бахромчатокрылые), спорадические вредители эпизодически активизируются в отдельные годы (к примеру, саранча, кузнечики, волосяные гусеницы, сверчки, гусеницы озимой совки и хлопковая полупяденица), в то время как потенциальные вредители обычно причиняют незначительный ущерб сельскому хозяйству, однако могут превратится в мощную разрушительную силу в результате каких-либо нарушений в экосистеме и последующего стремительного роста их популяции (к примеру, совка луговая) (Atwal и Singh, 1990).
Зачастую, потери урожая непосредственно и тесно связаны с популяцией соответствующих вредителей. Таким образом, любые организмы, которые причиняют вред сельскохозяйственным культурам, могут превратиться в опасного вредителя, как только их популяция достигнет критической отметки и характер причиненного ими ущерба можно будет определить в рамках оценки важности ситуации. Оценка потерь урожая вследствие деятельности вредителей является важным фактором для сельскохозяйственного планирования и, оценив характер повреждений, причиненных растению, можно проанализировать сопутствующий экономический убыток.
Следует отметить, что продовольственные растения по всему миру подвергаются атакам более 10 000 видов насекомых-вредителей (Dhaliwal et al., 2007; Singh и Gandhi, 2012), и эти насекомые вредители непрерывно развиваются и эволюционируют, представляя собой непосредственную угрозу запасам продовольствия, животным и человеческому обществу. Насекомые-вредители, как правило, представляют собой угрозу для человека, поскольку они не только приносят экономические убытки, в результате повреждения либо полного уничтожения сельскохозяйственных растений и их ценных продуктов, но и распространяют многочисленные патогены, вызывающие различные заболевания у животных, также являющиеся потенциально опасными для человека (Ralph и Peairs, 1966). Тем не менее, некоторые насекомые-вредители, с экономической точки зрения, были и остаются полезными для человека, ведь они производят различные продукты и материалы, такие как мед, шелк, пчелиный воск, шеллак, кошинель, кантаридин, чернильные орешки для производства красок, чернил и дубильной кислоты. Другая экономическая польза сельскохозяйственных насекомых включает в себя опыление цветочных растений, овощных растений и фруктовых деревьев, защитную функцию, проявляющуюся в том, что насекомые-вредители нередко выступают естественными врагами некоторых хищников (в качестве паразитов), а также возможность использовать их в качестве научно-исследовательских образцов для прикладных научных проектов в области медицины, генетики, физиологии и токсикологии.
Невзирая на многочисленные преимущества насекомых для сельского хозяйства, все же необходимо обратить внимание на их вредоносную природу. Многие насекомые выступают вредителями и причиняют существенные социально-экономические убытки, как в развитых, так и в развивающихся странах. На растительноядных (травоядных) насекомых приходится порядка одной пятой (1/5) всего ущерба, причиняемого всемирному растениеводческому хозяйству каждый год, и одним из существенных факторов, способствующих росту популяции и активности вредителей, является антропогенная среда, где сельскохозяйственные культуры и домашний скот селективно выращивают для получение максимальной урожайности и пищевой ценности готового продукта (Mohamed, 2013). Процесс селекции специальных сортов сельскохозяйственных растений для потребления человеком делает их высоко восприимчивыми для поражения насекомыми-вредителями. К примеру, стоит отметить, что многие сорта сельскохозяйственний растении, которые были выведены три десятилетия назад, приносили более высокие урожаи, что, впрочем, компенсировалось малым сроком годности и хранения (Kerin, 1994).
По наблюдениям, насекомые вредители демонстрируют возможность характерно эволюционировать до биотипов, способных приспосабливаться к изменениям, связанным с окружающей средой, генетическими и токсикологическими факторами, или, проще говоря, вырабатывать сопротивление к средствам борьбы с ними, что делает подобную адаптивную черту значительной проблемой для сельского хозяйства (Roush и McKenzie, 1987). Вне всяких сомнений, производство достаточного количества продовольствия всегда было и остается для человечества сложной задачей, особенно принимая во внимание рост мирового населения и конкуренцию со стороны растущей популяции насекомых вредителей. Важно отметить, что глобализация, торговля и сокращение интенсификации ведения сельского хозяйства также сыграли свою немаловажную роль в распространении насекомых-вредителей. В тропических и субтропических регионах климатические условия создают благоприятную среду для многочисленого различных насекомых, и для подавления их растущей популяции необходимы титанические усилия, особенно в том, что касается борьбы с насекомыми-вредителями и защиты сельскохозяйственных растений. Принимая во внимание и без того существенные проблемы, ставшие следствием засухи в некоторых регионах Африки, значительные потери сельскохозяйственной продукции, культур и кормовых пастбищ поставили под угрозу выживание и без того уязвимого населения этих регионов. По оценкам 2011 года, население Земли составляет порядка 7 миллиардов человек и продолжает расти, а прогнозы указывают на то, что к концу 21-го века эта цифра достигнет уже 10 миллиардов (UNPF, 2011; Culliney, 2014). Это значит, что человечество столкнулось с острой необходимостью в увеличении запасов продовольствия и укреплении продовольственной безопасности. Невзирая на недавний прирост продуктивности сельского хозяйства, программы продовольственного снабжения, действующие в разных регионах мира, по-прежнему сталкиваются с целым рядом трудностей, что приводит к возникновению острой необходимости в разработке жизнеспособных средств для поддержания и увеличения мощности производства продовольствия (FAO, 2011).
Точно оценить потери сельскохозяйственной продукции и урожаев в результате действия насекомых-вредителей представляется достаточно проблематичным, так как все цифры, связанные с подобными оценками, сопровождаются существенной долей неопределенности (Culliney, 2014). Van der Graaff (1981) считает, что в подавляющем большинстве случаев собранные данные о потерях сельскохозяйственной продукции являются косвенными и имеют низкую степень достоверности. На потери урожая влияет целый ряд различных факторов, в число которых определенно входят вредители. Однако при анализе потерь урожая, связанных с деятельностью насекомых-вредителей, достаточно сложно отделить влияние таких факторов, как климат, почва, система планирования сельского хозяйства, характер взаимодействия между растениями и вредителями, а также характер взаимодействия между вредителями и патогенами и последующее распространение болезней (Walker, 1983, 1987).
Таким образом, в большинстве развивающихся стран данные о негативном действии насекомых-вредителей на сельское хозяйство являются крайне ограниченными или вовсе отсутствуют (Reed, 1983; Yudelman et al., 1998; Culliney, 2014), в результате чего большинство рабочих данных по этой проблеме поступают из Америки, Западной Европы, Австралии и Индии (Oerke et al., 1994; Culliney, 2014). Статистические отчеты указывают на то, что потери урожая, связанные с насекомыми-вредителями, растительными патогенами и сорняками, стабильно растут вплоть до порядка 42% по всему миру, а общая стоимость подобного ущерба оценивается на уровне 500 миллиардов долларов (Oerke et al., 1994). Согласно Pimentel (1997) глобальные потери урожая могут составлять от 35% до 42%, в то время как Oerke et al. (2006) оценивают подобный показатель на уровне 69%. Последнее исследование Deutsch et al., (2018) показали, что насекомые могут ускорить потерю урожая из-за эффекта потепления климата, что во многом так-был прекращен вегетационный период с повышением температуры. Насекомые уже потребляют до 20% из основных культур, таких как пшеница, рис и кукуруза. модель Deutsch et al., (2018) показал, что для каждой увеличенной степени Цельсия потеря урожайности будет составлять 10-25%. Результат предполагает будущие тематические исследования по борьбе с вредителями.
Хотя применение пестицидов и прочих профилактических мер обрело широкое распространение и всячески поощряется по всему миру, вредители по-прежнему уничтожают значительную долю ежегодного урожая отдельно взятых сельскохозяйственных культур в мире (Culliney, 2014). Согласно отчетам, по всему миру было зарегистрировано снижение урожая сахарной свеклы на 26%, овса на 30%, сои на 32%, пшеницы на 34%, хлопка на 38%, кукурузы на 39%, кофе на 40%, картофеля на 41% и риса на 50% (Oerke et al., 1994; Oerke и Dehne, 2004), где большая часть потерь урожая приходится именно на развивающиеся страны.
ДНК-инсектициды
ДНК-инсектициды разработаны на платформе коротких одноцепочечных фрагментов ДНК (длиной 18–20 нуклеотидов) генов ингибитора апоптоза вирусов ядерного полиэдроза (Oberemok, 2008, 2011; Simchuk et al., 2012; Oberemok et al., 2013; Oberemok и Skorokhod, 2015; Oberemo et al., 2014; Oberemok и Nyadar, 2015; Nyadar et al., 2016б; Nyadar и Adeyemi, 2018). Данная новая идея использует разработку и применение этих биологических препаратов, которые проявляют механизм блокирования экспрессии генов, аналогичный механизму, применимому в антисмысловых технологиях (Weiss et al., 1999; Dias и Stein, 2002) и важны для выживания как механизмы РНК-интерференции (Fire et al., 1998; Wang et al., 2011). Первоначальные практические результаты в отношении ее инсектицидного потенциала были продемонстрированы Oberemok и Skorokhod (2014). Они показали, что инсектицидный потенциал вирусных фрагментов IAP ДНК можно использовать для создания безопасных, доступных и надежных ДНК-инсектицидов для контроля популяций непарного шелкопряда.
В настоящее время биологический контроль популяций непарного шелкопряда осуществляется в природе с помощью мультикапсидного вируса ядерного полиэдроза Lymantria dispar (ВЯП НШ) Meyers и другими (Oberemok, 2008). Опубликованные данные в отношении селективности показали, что действие ДНК-инсектицидов на основе фрагментов антиапоптозного гена ДНК ВЯП НШ является селективным и не наносит вред нецелевому насекомому по сравнению с табачным бражником Manduca sexta L. и совкой-ипсилоном Agrotis ipsilon H. Oberemok et al., 2015).
В настоящее время проводятся дополнительные исследования по расширению возможностей применения ДНК-инсектицидов. Исходя из доступных опубликованных данных, перспективное использование подхода ДНК-инсектицидов является вполне практичным, поскольку оно безопасно, избирательно в своем воздействии и эффективно, а также обладает другими качествами, которые способствуют защите растений для улучшения производства растений, борьбе с насекомыми-вредителями и рациональному использованию сельскохозяйственных ресурсов.
Механизм ДНК-инсектицидов связан с действием и применением антисмысловых молекул (Weiss et al., 1999; Dias и Stein, 2002) и РНК-интерференции (Fire et al., 1998; Wang et al., 2011).
Полимеразную цепную реакцию использовали для обнаружения генов апопто-за у обработанных насекомых, а реакции с одноцепочечными доменами олигоBIR и олигоRING гена IAP-3 ВЯП НШ в качестве праймеров выявили различные геномные части испытуемых насекомых. Для очистки и последующего секвенирования ДНК был выбран толстый фрагмент из каждого спектра ДНК насекомых (Рисунок 1–А).
Анализ секвенирования ДНК с помощью BLASTN (Zhang et al., 2000) показал, что секвенированный фрагмент генома обычной плодовой мухи относится к некодирующей части 3L хромосомы (97%-ная идентичность). Последовательный фрагмент ДНК генома табачного бражника не согласовался с программой TBLASTX (Zhang et al., 2000) или любым фрагментом генома в базе данных последовательности нуклеотидов Manduca sexta. Таким образом, одноцепочечные фрагменты доменов олигоBIR и олигоRING гена IAP-3 ВЯП НШ не могли блокировать функционирование любых известных генов обычной плодовой мухи и табачного бражника и, очевидно, были безвредны для них.
Напротив, поиск по TBLASTX в нуклеотидной базе данных геномных фрагментов показал мРНК IAP-1 Lymantria dispar (описано группой Sugiyama Y.) в 2012 году и доступно по адресу URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/409924403) для ингибитора белка апоптоза, который совпадает с 20% сек-венированного фрагмента ДНК. Результаты секвенирования ДНК показали, что обратный праймер (фрагмент домена ВЯП НШ олигоRING гена IAP-3) проявляет идеальное комплементарное спаривание оснований с фрагментом непарного шелкопряда, обычной плодовой мухи и с геномом табачного бражника, где не соответствует только один нуклеотид (цитозин вместо гуанина) (нижняя правая сторона Рисунок 1–Б).
Напротив, фрагмент олигоBIR гена IAP-3 ВЯП НШ, используемый в качестве прямого праймера, не способен к идеальному комплементарному спариванию с геномными последовательностями изучаемых насекомых (Рисунок 1–В), но во всех случаях этого было достаточно для инициирования полимеразной цепной реакции.
Кроме того, недавние исследования (Oberemok и Skorokhod, 2014; Oberemok et al., 2016) показали, что фрагмент домена олигоRING (инсектицидный фрагмент) был связан с интерференцией генетической экспрессии генов ингибитора апоптоза (IAP) у L. dispar, прерывая механизмы, участвующие в посттранскрипционной экспрессии антиапоптотических генов насекомых.
Данные по местной обработке личинок непарного шелкопряда фрагментом домена олигоRING из гена IAP-3 его вируса ядерного полиэдроза демонстрируют подавление гена IAP-Z хозяина-мишени (гомологичен гену IAP-3) в 12,06 ± 1,48 раза у развившихся взрослых самок L. dispar по сравнению с контролем водой примерно через 75 дней после обработки. Данные указывают на то, что фрагмент домена олигоRING из гена IAP-3 ВЯП НШ действует как антисмысловой РНКаза H-зависимый олигонуклеотид, вызывая деградацию целевой мРНК гена IAP-Z L. dispar.
Кроме того, у взрослых самок D. melanogaster антисмысловой фрагмент из гена DIAP-2 подавлял целевой ген DIAP-2 в 4,96 ± 0,06 раза по сравнению с контролем водой. Таким образом, антисмысловой фрагмент из гена DIAP-2 действует как антисмысловый РНКаза Н-зависимый олигонуклеотид, действие которого сопровождается последующим подавлением экспрессии целевого белка (Nyadar et al., 2018).
Эффект действия ДНК-инсектицидов на личинках плодовой мухи Drosophila melanogaster M. как модельном организме
Личинок Drosophila melanogaster 2-го и 3-го возраста в течение 20 минут обрабатывали фрагментами оцДНК из гена DIAP-2 в концентрации 20 пмоль/мкл и наблюдали до развития взрослых особей.
Морфологию и количество появившихся взрослых насекомых анализировали под бинокулярным микроскопом. Drosophila melanogaster – это половой диморфный вид, где самцы и самки легко различимы по нескольким морфологическим признакам. У взрослого самца брюшко имеет круглую форму, а нижние сегменты брюшка темные и блестящие. У взрослых самок брюшко имеет заостренную форму, а окраска задних сегментов варьируется от бледного до почти полностью темного цвета.
Результаты эксперимента не показали существенной разницы в смертности между контрольной группой, которую обрабатывали dH2O и экспериментальными группами личинок насекомых. Смертность, зарегистрированная в группах олигоSn2 и олигоAn2, показала небольшое увеличение на 13,1% и 15%, соответственно, по сравнению с контрольной группой, которую обрабатывали dH2O, Рисунок 7.
Общее количество развившихся взрослых особей D. melanogaster (самцы + самки) из групп, которых обрабатывали оцДНК, % среднее значение ± SE представлено для 9 повторений в эксперименте Было обнаружено, что фрагменты оцДНК олигоAn2 влияют на общее количество взрослых самок, нарушая механизм выбора пола во время развития личинок. Это наблюдение позволило исследовать влияние на самок личинок D. melanogaster.
Это была отметить, что среди общего числа выживших взрослых самок процент развившихся особей был значительно ниже в группе, которую обрабатывали олигоAn2 (31,2%), по сравнению с контрольной группой dH2O (55,1%, p 0,01, Рисунок 8).
Антисмысловый (олигоAn2) фрагмент из гена DIAP-2 вызывает снижение развития самок D. melanogaster по сравнению с контрольной группой, % среднее значение ± SE представлено для 9 повторений в эксперименте. Значительная разница, когда p 0,01, отмечена звездочкой ( )
Кроме того, результаты по группам, которых обрабатывали олигоSn2, не выявили каких-либо значительных изменений у развившихся взрослых самок по сравнению с контрольной группой dH2O, указывая на то, что местное применение антисмыслового (олигоAn2) фрагмента оцДНК из гена DIAP-2 значительно и специфично ингибирует развитие взрослых самок Drosophila melanogaster, Рисунок 8.
Анализ биомассы развившихся взрослых самок дал основание предположить, что фрагменты олигоAn2 оцДНК влияют на значительную часть морфологических характеристик D. melanogaster. Результаты показывают значимое уменьшение (p 0,05) биомассы обработанных олигоAn2 взрослых самок по сравнению с контрольной группой dH2O (0,75–1,23 мг соответственно), Рисунок 9.
Антисмысловой (олигоAn2) фрагмент из гена DIAP-2 уменьшает биомассу взрослых самок D. Melanogaster, среднее значение ± SE представлено для 9 повторений в эксперименте. Значительная разница, когда p 0,01, отмечена звездочкой ( )
Взрослые самки выглядели как фенотипические самцы, поскольку имели атрибут биомассы, как у самцов, но все еще сохраняли характерное брюшко заостренной формы и окрашенные задние области. Этот результат соответствует предыдущему исследованию, полученному для личинок L. dispar при местной обработке антисмысловым (олигоRING) фрагментом гена IAP-3 ВЯП НШ (Obere-mok et al., 2016a; Nyadar et al., 2018).
Для дальнейшего изучения действия фрагментов олигоSn2 и олигоAn2 на D. melanogaster некоторые из обработанных личинок были отобраны для изучения действия фрагментов оцДНК на экспрессию гена DIAP-2 в качестве целевого гена для механизма действия ДНК-инсектицидов в рамках антисмысловых технологий.
Результаты показывают, что фрагмент оцДНК олигоAn2 очень активен и важен для развития плодовых мушек. Он подавлял целевой ген (DIAP-2) в 4,96 ± 0,06 раза по сравнению с контрольной группой (p 0,01), Рисунок 10.
Полученный результат (Рисунок 10) указывает на то, что антисмысловой фрагмент из гена DIAP-2 действует как антисмысловый РНКаза Н-зависимый олигонуклеотид (Oberemok и Skorokhod, 2014; Nyadar и Oberemok, 2016), дейст 76 вие которого сопровождается последующим подавлением экспрессии целевого белка (Dias и Stein, 2002). Гены, идентифицированные как те, которые играют важнейшую роль в выборе и определении пола у плодовых мушек, были эволю-ционно консервативными (Raymond et al., 1998), но прямой связи генов IAP с определением пола у D. melanogaster и других насекомых, включая непарного шелкопряда, выявлено не было. Концепция выживания и развития эмбрионов Drosophila до взрослой плодовой мухи включает в себя несколько процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток (Bangs и White, 2000; Hay, 2000; Abdelwahid, 2007) с важными функциями, выполняемыми как генами DIAP-1, так и генами DIAP-2.
Впервые это исследование показывает, что применяемый антисмысловый фрагмент (олигоAn2) оцДНК (длиной 20 нуклеотидов) может с высокой эффективностью влиять на выбор пола при развитии D. melanogaster, и поэтому результаты, полученные в этом исследовании, могут сигнализировать о пути для понимания других функциональных сложностей, вызываемых геном DIAP-2 у D. melanogaster, особенно при использовании антисмысловых фрагментов оцДНК.
Следовательно, ДНК-инсектициды из фрагментов оцДНК олигоAn2 гена DIAP-2 могут использоваться для контроля соотношения популяции самок плодо 77 вых мушек и, как следствие, ограничения размножения, чтобы предотвратить их инвазивную активность на плодовых культурах.
Кроме того, механизм фрагментов олигоAn2 может проложить новый путь к разработке и эффективному использованию ДНК-инсектицидов против целевых насекомых-вредителей.
Действие ДНК-инсектицидов на целевые и нецелевые виды насекомых
Результаты изучения инсектицидной активности фрагмента IAP-2-гена ВЯП НШ длиной 20 нуклеотидов (5 пмоль на личинку) посредством кормления показали успешность и эффективность такого метода доставки ДНК-инсектицидов в личинки целевых насекомых (Lymantria dispar). Использование ВЯП НШ в течение 1 дня в качестве триггера состояло в том, чтобы активизировать механизм защиты хозяина и увеличить концентрацию целевых мРНК антиапоптозного гена.
Было обнаружено, что инсектицидная активность олигоAn-фрагмента является достоверной для личинок непарного шелкопряда, причем самый высокий процент смертности составил 44% после 1 дня обработки по сравнению с группами, обработанными контрольным раствором (вода) и олигоSn-фрагментом (контрольным фрагментом), где была зарегистрирована смертность на уровне 22% (Рисунок 5). Было замечено, что достоверная смертность в экспериментальной олигоAn-группе длилась в течение 5 дней (Рисунок 5) с видимыми признаками апоптоза (Schliess и Hussinger, 2005), указывая на то, что антисмысловой оligoAn-фрагмент IAP-2-гена ВЯП НШ может индуцировать апоптоз, приводящий к гибели личинок (Oberemok и Nyadar, 2014; Nyadar et al., 2016a; Nyadar и Adeyemi, 2018).
Это свидетельствует о том, что одно из функциональных свойств ДНК-инсектицидов из IAP-2-гена ВЯП НШ основано на генетическом взаимодействии между ВЯП НШ и насекомым-хозяином, что дает хорошую возможность для дальнейшего изучения системы взаимоотношений вирус-хозяин и их успешного применения в борьбе с насекомыми-вредителями для защиты растений (Pez et al., 2015).
Инсектицидная активность олигоAn-фрагмента IAP-2-гена ВЯП НШ посредством кормления является эффективной (Nyadar и Adeyemi, 2018), и способ их доставки путём кормления оказался эффективным и удобным, поскольку смертность у обработанных личинок регистрировалась в диапазоне от 22% до 85%, Рисунок 5.
Кроме того, в эксперименте с фрагментами IAP-3-гена ВЯП НШ, целью использования ВЯП НШ в течение 2 дней в качестве триггера состояло в том, чтобы активизировать механизм защиты хозяина, который необходим для проявления инсектицидной активности оцДНК-фрагментов в концентрации 0,3 пмоль на личинку непарного шелкопряда. Совместное применение олигоBIR-фрагмента и олигоRING-фрагмента показало инсектицидную активность с 5-го дня эксперимента. Примечательно, что значительное увеличение смертности по сравнению с контрольной группой наблюдалось у предварительно инфицированных личинок только в олигоBIR+ олигоRING-группе, Рисунок 6.
Заметное увеличение смертности по сравнению с контрольным раствором (вода) в группе, которую обрабатывали олигоA, не было статистически достоверным (Oberemok et al., 2017), Рисунок 6.
Дальнейшие наблюдения с 5-го по 11-й день указывают на увеличение смертности личинок насекомых. Самый высокий уровень смертности в 37,5%, был зарегистрирован в олигоBIR +олиго RING-группе. Интересно отметить, что фрагменты олигоBIR + олигоRING прогрессивно оказывали статистически значимое (p 0,01) влияние на смертность исследуемых личинок (Рисунок 6).
Полученные результаты по применению ДНК-инсектицидов на основе антисмысловых фрагментов IAP-генов ВЯП НШ на целевых личинках непарного шелкопряда, предварительно инфицированных ВЯП НШ, зависят от динамики синтеза мРНК целевого антиапоптозного гена и её деградации. Антисмысловые последовательности данных генов являются комплементарными последовательностями мРНК целевых антиапоптозных генов и инициируют посттранскрипционное подавление целевого антиапоптозного гена аналогично действию антисмысловых олигонуклеотидов (Dias и Stein, 2002) и механизму РНК-интерференции (Gu и Knipple, 2013).
Следовательно, это действие приводит к апоптозу клеток и, в конечном счете, к гибели всего насекомого, указывая на то, что инфицирование гусениц ВЯП НШ обеспечивает более высокий и действенный инсектицидный эффект применяемых как оцДНК-фрагментов, так и бакуловирусных препаратов.
Кроме этого, было показано, что использование раствора с ДНК-фрагментами IAP-3-гена в концентрации 100 пмоль/мкл (при погружение личинок в него на 5 минут) на личинках Trichoplusia ni. приводит к достовенрному снижению выживаемости насекомого. При уменьшении концентрации до 10 пмоль/мкл инсектицидный эффект пропадал, (Рисунок 12). Таким образом, для достоверного инсектицидного эффекта требуется применение достаточной дозы ДНК-фрагментов в базовом растворе.
Результаты применения оцДНК-фрагментов DIAP-2-гена длиной 20 нуклеотидов в концентрации 20 пмоль/мкл у Drosophila melanogaster показали, что олигоAn-фрагмент активно участвует в ингибировании развития самок плодовой мушки. Среди общего числа развившихся особей имаго наименьшее количество пришлось на группу, которую обрабатывали олигоAn2-фрагментом – 31,2% (по сравнению с 55,1% в контрольной группе, обработанной водой), Рисунок 8. Анализ биомассы показал, что влияние олигоAn-фрагмента значительно снижает биомассу плодовых мушек, Рисунок 9. Это указывает на то, что контактная обработка оцДНК-фрагментом оказывает влияние на личинок D. melanogaster (Nyadar et al., 2018).
Было показано, что экспрессия DIAP-гена-2 снижается в ответ на применение олигоAn2-фрагмента в 4,96 ± 0,06 раз (p 0,01) сильнее по сравнению с контрольной группой (вода), Рисунок 10.
Сообщалось о нескольких генах, идентифицированных как играющих решающую роль в определении пола у D. melanogaster (Bopp et al., 1991; Raymond et al., 1998; Cheng и Kirkpatrick 2016; Richardson, 2016). Однако прямой связи DIAP-2-гена с определением пола у плодовой мушки до исследований, показанных в данной работе, не было обнаружено.
К настоящему времени известно, что развитие D. melanogaster от эмбриона до взрослой плодовой мушки включает в себя ряд процессов, связывающих пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток (Bangs и White, 2000; Hay, 2000; Abdelwahid, 2007; Fan и Bergman, 2014; Nyadar et al., 2018) и одними из важных участников данных процессов являются DIAP-1-ген и DIAP-2-ген.
Некоторые исследования показывают, что DIAP-2-ген необходим для врожденного иммунного ответа и выполняет важную функцию в синтезе антимикробного пептида при заражении грамотрицательными бактериями (Huh et al., 2007; Leulier et al., 2006; Kounatidis и Ligoxygakis, 2012). Другие исследования связывали влияние DIAP-2-гена на работу DIAP-1-гена (Tran, 2008), однако на сегодняшний день нет подтвержденных данных об отношении DIAP-2-гена к дифференци-ровке пола у D. melanogaster.
Следует отметить, что применяемый олигоAn2-фрагмент DIAP-2-гена может с высокой эффективностью влиять на пол у плодовой мушки (D. melanogaster). Вполне вероятно, что результат, полученный в этом исследовании, может открыть путь к пониманию других функциональных особенностей работы DIAP-генов у D. melanogaster, особенно при использовании антисмысловых оцДНК-фрагментов.
Применяемый олигоAn2-фрагмент DIAP-2-гена действует как РНКаза Н-зависимый олигонуклеотид, эффект которого сопровождается последующим подавлением экспрессии целевого белка. В определённый момент в каскаде биохимических реакций, ведущих к определению пола, это приводит к сайлесингу гена dsx и ингибирует синтез специфических белков, кодирующих развитие самок насекомых (Nyadar et al., 2018). Полученные здесь результаты могут быть использованы для разработки видоспецифичных инсектицидов для контроля популяции насекомых-вредителей. Например, в борьбе против плодовых вредителей, таких как D. melanogaster, с помощью механизмов подавления развития самок плодовой мушки, тем самым препятствуя размножению на фруктах и других высокоценных сахаропроизводящих растениях.
Оценка избирательности ДНК-инсектицидов показала, что могут быть созданы препараты, направленные на конкретные целевые организмы, оставаясь при этом эффективными и безопасными (Oberemok et al., 2013; Oberemok et al., 2015; Nyadar et al., 2016a; Zaitsev et al., 2015). Были проведены исследования избира 100 тельности действия ДНК-инсектицидов на нецелевых видах насекомых (Agrotis ipsilon, Manduca sexta, Sitophilus granarius).
Результаты, зарегистрированные через семь дней после обработки, показали, что комбинация оцДНК-фрагментов (олигоBIR-фрагмент + RING-фрагмент) из IAP-3 гена ВЯП МС эффективна только против металловидки серой T. ni (p 0,05) по сравнению с группами, которых обрабатывали контрольным раствором (водой) и олигоA-фрагментом, Рисунок 11. Продлениен эксперимента в течение последующих 14 дней не показал каких-либо существенных различий в выживаемости целевых насекомых (Oberemok et al., 2017).
На другие обработанные виды насекомых, такие как Sitophilus granarius и Agrotis ipsilon, оцДНК-фрагменты IAP-3-гена ВЯП МС также не оказали инсектицидного влияния. Это наблюдение обосновывает избирательную природу действия ДНК-инсектицидов. Поскольку используемые ДНК-фрагменты были сконструированы на основе уникальных последовательностей IAP-3-гена ВЯП МС, они могли влиять только на целевые виды насекомых с их комплементарной последовательностью генов. Вследствие этого, нецелевые виды насекомых, такие как Sitophilus granarius и Agrotis ipsilon, не подверглись негативному действию со стороны ДНК-инсектицидов.