Микогельминты в защите озимой пшеницы от розовой снежной плесени Щуковская Анастасия Геннадиевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава I. Обзор литературы 11

1.1 Комплекс возбудителей снежной плесени озимых зерновых 11

1.2. Систематическое положение гриба Microdochium nivale (Fr.) Sammuels & I.C. Hallett, возбудителя РСП озимой пшеницы 17

1.3. Источники инфекции и пути ее распространения 20

1.4. Цикл развития гриба Microdochium nivale 21

1.5. Географическое распространение патогена 22

1.6. Вредоносность розовой снежной плесени озимой пшеницы 23

1.7. Методы защиты озимой пшеницы от снежной плесени 26

1.8. Подходы к биологической борьбе от розовой снежной плесени озимой пшеницы 33

1.9. Биологический контроль фитопатогенов при помощи микогельминтов 38

Глава II. Материалы и методы исследований 46

2.1. Материалы и методы исследований 46

2.2. Метеорологические условия в годы исследований 57

Результаты исследований 59

Глава III. Вредоносность розовой снежной плесени озимой пшеницы 59

3.1. Влияние погодных условий на развитие розовой снежной плесени 59

3.2. Зависимость продуктивности озимой пшеницы от степени развития розовой снежной плесени 64

Глава IV. Фауна и динамика нематод озимой пшеницы в очаге розовой снежной плесени 74

4.1. Фауна нематод озимой пшеницы на очаге розовой снежной плесени 74

4.2. Динамика нематод различных экологических групп в растениях пшеницы поражнной розовой снежной плесенью 80

4.3. Обнаруженные микогельминты в очаге розовой снежной плесени озимой пшеницы 85

Глава V. Изучение взаимоотношений в системе «патоген (розовая снежная плесень) – микогельминты» при температуре 5-7 С

5.1. Взаимоотношения микогельминтов и мицелии гриба Microdochium nivale при 5-7 С 90

5.2. Взаимоотношения микогельминтов и мицелия гриба Microdochium nivale на озимой пшенице в климокамере при 5 С 96

5.3. Воздействие микогельминтов на развитие розовой снежной плесени 103

Глава VI. Разработка технологии производства биопрепарата Микогельм и его применение в полевых условиях 105

6.1. Разработка технологии производства биопрепарата Микогельм 105

6.2. Полевые испытания биопрепарата Микогельм 109

6.3. Биологическая и хозяйственная эффективность препарата Микогельм 112

Заключение 115

Практические рекомендации 117

Список использованной литературы 118

• Систематическое положение гриба Microdochium nivale (Fr.) Sammuels & I.C. Hallett, возбудителя РСП озимой пшеницы
• Методы защиты озимой пшеницы от снежной плесени
• Зависимость продуктивности озимой пшеницы от степени развития розовой снежной плесени
• Обнаруженные микогельминты в очаге розовой снежной плесени озимой пшеницы

Введение к работе

Актуальность работы. Розовая снежная плесень (далее РСП) озимой пшеницы вызывает фитопатогенный низкотемпературный гриб Microdochium nivale (Fr.) Samuels & I.C. Hallett. Болезнь является одним из вредоносных заболеваний озимой пшеницы в Московской области. При сильном поражении наблюдается отмирание узла кущения, листовых влагалищ, корней и гибель всего растения. Выжившие растения могут отставать в своем развитии, а в их колосьях часто формируется неполноценное зерно. Вредоносность розовой снежной плесени заключается в изреживании посевов, а нередко полной их гибели. При сильном поражении растений иногда приходится прибегать к пересеву яровыми. Потери урожая при этом могут быть более 20-50 % (Санин и др., 1999, Захаренко и др., 2000).

Для подавления розовой снежной плесени используют химические фунгициды при предпосадочном протравливании зерна и опрыскивании ими как можно ближе к установлению снегового покрова, сроки установления которого трудно предсказать (Серая и др., 2003; Тазина, 2005; Ткаченко и др., 2015). Но вместе с тем, зачастую, применение фунгицидов, несмотря на очевидный эффект, имеет много отрицательных сторон (загрязнение окружающей среды, особенно при многократных обработках, стимулирование появления резистентных к ним форм вредных организмов, подавление или уничтожение полезных видов, участвующих в регуляции их численности). В настоящее время защите озимой пшеницы от розовой снежной плесени требуется альтернатива. В борьбе с этим заболеванием наиболее эффективна комплексная система защитных мероприятий, где биологический метод имеет важное значение. Основные вопросы в развитии биологической защиты растений связаны с уменьшением применения химических средств защиты растений с целью снижения экологического риска сельскохозяйственных культур, сохранением целостности полезной микробиоты в структуре биогеоценоза, а также с разработкой новых биологических средств на основе энтомоака-рифагов, энтомопатогенов и микроорганизмов антогонистов-фитопатогенов (На-дыкта, 2014; Павлюшин, 2013; Сагитов, Перевертин, 1987).

В органах и тканях растений или их ризосфере встречаются ассоциации нематод и других организмов, в том числе и грибов-возбудителей болезней растений. Роль нематод в комплексе «растение-хозяин – гриб (патоген) – нематода» двояка. С одной стороны нематоды выступают переносчиками патогенной микрофлоры, с другой стороны микогельминты используют в качестве источника пищи – мицелий фитопатогенных грибов (Шестеперов, Савотиков, 1995). Исследования российских и зарубежных ученых Курта, Шестепрова, 1983; Кулинича, 1984; Щуковская, 2004; Migunova, Shesteperov 2011; Ishibashi et al., 2000; Jun, Kim, 2004; Ishibashi et al., 2004; Hasna et al., 2007, 2008 и др., свидетельствуют о возможности использования нематод-микогельминтов против фитопатогенных грибов. В этой связи, изучение взаимоотношений, складывающихся в системе

«растение-хозяин (озимая пшеница) – возбудитель розовой снежной плесени – микогельминты» имеет теоретический и практический интерес, для дальнейшего использования микогельминтов в качестве агентов биологической борьбы (далее биоагентов) в борьбе с розовой снежной плесени озимой пшеницы.

Степень разработанности темы. Исследований изучающих взаимоотношения в системе «озимая пшеница – розовая снежная плесень – нематоды-микогельминты» в условиях низких положительных температур и практическое применение микогельминтов в регуляции развития заболевания не проводилось.

Цели и задачи. Целью работы было определение зависимости продуктивности озимой пшеницы от степени поражения розовой снежной плесенью озимой пшеницы и изучение влияния микогельминтов на развитие этого заболевания и возможности применения в качестве биоагентов.

Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач:

1. Определить зависимость продуктивности озимой пшеницы от степени поражения розовой снежной плесени, вызываемой грибом Microdochium nivale.

2. Изучить фауну и сезонную динамику нематод в очаге розовой снежной плесени, с целью выявления микогельминтов.

3. Изучить питание и размножение микогельминтов на мицелии гриба M. nivale при температуре 5 С в условиях in vitro.

4. Сравнить эффективность микогельминтов Aphelenchoides saprophilus, Aphelen-chus avenae и Paraphelenchus tritici в подавлении развития розовой снежной плесени.

5. Разработать технологию производства и применения биопрепарата Микогельм в очагах розовой снежной плесени.

6. Оценить биологическую и хозяйственную эффективность биопрепарата Мико-гельм в борьбе с розовой снежной плесенью.

Положения, выносимые на защиту.

7. Прогностическая модель продуктивности озимой пшеницы в зависимости от интенсивности развития розовой снежной плесени.

8. Микогельминты A. saprophilus, A. avenae и Р. tritici как одна из причин снижения развития розовой снежной плесени озимой пшеницы.

9. Вид A. saprophilus – наиболее активный биоагент среди отмеченных видов ми-когельминтов в защите озимой пшеницы от розовой снежной плесени.

10. Биологическая и хозяйственная эффективность применения препарата «Мико-гельм» в борьбе с розовой снежной плесенью озимой пшеницы.

Научная новизна. Доказана зависимость продуктивности озимой пшеницы от интенсивности развития розовой снежной плесени и разработана математическая модель прогноза урожайности озимой пшеницы в зависимости от интенсивности развития заболевания.

Впервые изучена паразитарная система "микогельминт - возбудитель РСП" при низких положительных температурах, указывающая на возможность исполь-

зования трх видов микогельминтов (A. saprophilus, A. avenae и Р. tritici) в качестве биоагентов гриба M. пivale.

Впервые определн эффективный биоагент A. saprophilus как наиболее перспективный вид в борьбе с розовой снежной плесенью пшеницы.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Разработана математическая модель прогноза продуктивности озимой пшеницы в зависимости от интенсивности развития розовой снежной плесени, которая может использоваться в учебном процессе при чтении лекции и проведения практических занятий по дисциплине «Прогноз развития вредителей и болезней».

Создана коллекция микогельминтов A. saprophilus, A. avenae, P. tritici и Dity-lenchus sp., которую можно использовать в учебной и исследовательской практике.

Разработана технология производства биопрепарата Микогельм, который был апробирован на посевах озимой пшеницы в Отделе отдалнной гибридизации ГБС РАН, что подтверждается Актом о проведении полевых исследований.

Разработаны «Методические рекомендации по разработке и применению препарата «Микогельм» в очагах розовой снежной плесени озимых зерновых культур», которые утверждены на Ученом совете ГБС РАН (20.11. 2014 года) и на Нематодной комиссии при Отделении защиты и биотехнологии растений РАСХН (20.01.2015 года).

Получен патент (регистр. № 2548199) на изобретение "Способ получения
биологического препарата для защиты озимых зерновых от розовой снежной

плесени".

Методология и методы исследований. Работа выполнена с использованием традиционных фитопатологических (Наумов, 1970, Стройков, 1986) фитогель-минтологических (Парамонов, 1962, Кирьянова и Крааль, 1969, Шестеперов, 1980) методов, а также оригинальных методик адаптированных к низким положительным температурам (Серая, 2003).

Степень достоверности апробация результатов. Достоверность результатов обоснована большим объмом исследований, применением стандартизированных методов и их модификаций. Статистические расчеты проводили методами дисперсионного, корреляционного и регрессионного анализа при помощи пакета программ STATISTICA 6.0 (StatSoft, США) и в программе Microsoft Office 2007, программы «Excel».

Материалы диссертации были доложены на международной конференции «Plant and Microbe Adaptations to Cold 2012» (PMAC 2012 Саппоро, Япония); на научной конференции «Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями» во Всероссийском институте гельминтологии им. К.И. Скрябина РАСХН (Москва, 2012); на Международной научной конференции «Современные проблемы общей паразитологии» (ИПЭЭРАН, Москва, 2012); на Х Международном нематологиче-ском симпозиуме (ВНИИФ, Голицыно, 2013); на III Всероссийском Съезде по защите растений (ВИЗР, Санкт-Петербург, Пушкино, 2013); на VIII Международной научно-практической конференции «Биологическая защита растений – основа фи-

тосанитарной стабилизации агроэкосистем» (Краснодар, 2014); на VII конгрессе по защите растений (Златибор, Сербия, 2014); на III Международном микологическом форуме (Москва, 2015).

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 научная работа, включая 3 статьи в рецензируемых российских журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ.

Личный вклад автора. Представленная диссертационная работа является результатом научных исследований, проводившихся на протяжении более десяти лет, выполненных лично автором. Диссертанту принадлежит сбор материала, обработка, анализ и обобщение лабораторных и полевых и экспериментальных данных. По результатам исследований опубликована 21 научная статья, самостоятельно опубликована 1 статья, 20 статей в соавторстве с научными руководителями, доцентом, к.б.н. Е.А. Колесовой, к.б.н. А.В. Овсянкиной, к.б.н. В.П. Упелние-ком, д.б.н. А.В. Бабошей.

Структура и объм диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 4 глав экспериментальной части, заключения включающего выводы, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Материал изложен на 143 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 19 рисунков. Список использованной литературы включает 173 источника, из них 80 на иностранных языках.

Работа выполнена под научным руководством доктора биологических наук О.Б. Ткаченко и доктора биологичечких наук, профессора А.А. Шестеперова, которые оказывали научно-методическую помощь в проведении исследований, анализе полученных результатов, обобщении данных исследований.

Автор искренне признателен зав. лаб. фитогельминтологии ВНИИП РАН, д.б.н. В.Д. Мигуновой, доценту каф. «Агрохимии, агропочведения и защиты растений» РГАЗУ, к.б.н. Е.А. Колесовой, к.б.н. А.В. Овсянкиной (ВНИИФ), зав. отд. отдалнной гибридизации ГБС РАН, к.б.н. В.П. Упелниеку, агроному отд. отда-лнной гибридизации, м.н.с. Н.П. Кузьминой, зав. лаб. экологической физиологии и иммунитета растений ГБС РАН, д.б.н. А.В. Бабоше, с.н.с. отдела защиты растений к.б.н. ГБС РАН М.А. Келдыш, доценту каф. «Декоративного садоводства и газоноведения» ТСХА, к.б.н. С.В. Тазиной, а также заместителю директора ФГБУ «Россельхозцентра», к.б.н. Д.Н. Говорову и заместителю директора отделения защиты растений по Московской области ФГБУ «Россельхозцентра» Л.А. Воронко-вой, д.б.н., главному научному сотруднику Зоологического института РАН, г. Санкт-Петербурга А.Ю. Рыссу – за помощь и поддержку при проведении исследований и написании данной работы.

Систематическое положение гриба Microdochium nivale (Fr.) Sammuels & I.C. Hallett, возбудителя РСП озимой пшеницы

Около 80 % биосферы постоянно и сезонно холодные, с температурой ниже 5 С, а полярные регионы занимают 14 % биосферы (Gounot, 1999). Термин криосфера был предложен Barry et al. (2011) и коллективно описывает части земной поверхности, где вода находится в замороженном состоянии – снежный покров, ледники, ледниковые покровы, пресноводный лд, айсберги, вечная мерзлота и грунтовый лд (Barry, Gan, 2011). Сообщалось о нескольких разновидностях микроорганизмов, особенно грибов в криосфере (Friedman, 1993; Robinson, 2011; Margesin et al., 2007; Frisvad, 2008; Ludley, Robinson, 2008; Hoshino et al., 2009; Tojo, Newsham, 2012). Несмотря на то, что все таксоны грибов уже были найдены в криосфере, грибы в ней отмечали менее часто, чем в умеренных зонах.

Для обозначения низкотемпературных грибов в микологии используют, термин «психрофильные» или «психротолерантные» грибы. Этот термин впервые использовал для обозначения низкотемпературных бактерий Р. Морита (Morita, 1975). Однако, по мнению Т. Хошино (T.Hoshino) и Н. Мацумото (N. Matsumoto) (2009), этот термин не может всесторонне характеризовать низкотемпературные грибные организмы, которые являются более сложными, чем бактерии. Для обозначения низкотемпературных грибов ими недавно был предложен новый термин – «криофильные» грибы (Hoshino, Matsumoto, 2012). Они обосновывали сво предложение тем, что, в отличие от бактерий, у грибов часто имеются стадии с различными экологическими требованиями. Более детально этот термин описан в работе Т. Хошино с соавторами (Hoshino et al., 2013), в которой они распределяют криофильные фитопатогены по месту паразитирования в сечении снегового покрова: «на», «в» и «под» снегом. По их определению – криофильные грибы, это те грибы, которые проводят определнную жизненную стадию или целый жизненный цикл (половую и/или бесполую стадию) в криосфере, где биосфера постоянно или сезонно покрыта снегом и/или льдом.

Патогенные грибы, поражающие растения под снеговым покровом на поверхности земли вызывают снежные плесени. В нашей стране долгое время поражение растений озимых зерновых культур низкотемпературными грибами именовали термином «выпревание». Симптомы выпревания сходны с симптомами поражения снежной плесенью. В начале прошлого века классики фитопатологии во Всесоюзном институте защиты растений (ВИЗРе) И.И. Туманов (1935) и С.М. Тупеневич (1966) ввели термин «выпревание». «Выпревание растений озимых культур представляет собой весьма сложный процесс. Оно наблюдается при длительном пребывании растений при температуре, близкой к 0 С, и неглубоком промерзании почвы без света под мощным снежным покровом. В таких условиях растения усиленно расходуют запасы питательных веществ в листьях и узлах кущения, ослабляется их устойчивость. Они легко подвергаются поражению грибными заболеваниями, среди которых наиболее распространнными при выпревании являются различные формы снежной плесени и склеротиния» (Куперман, Моисейчик, 1977). В целом, выпревание отражало физиологическое явление поражения зимующих растений (озимых и многолетних) от вышеперечисленных факторов. В мировой литературе такого термина «выпревание» не существует, а поражение зимующих растений низкотемпературными патогенами под снеговым покровом называют «снежные плесени». В отечественной литературе термин «снежная плесень» раньше использовали только исключительно для названия болезни, вызываемой грибом Fusarium nivale в настоящее время именуемого Microdochium nivale var. nivale (телеоморфа Monographella nivalis var. nivalis). В мировой научной литературе болезнь именовалась «розовая снежная плесень». В литературе отмечены следующие возбудители снежных плесеней сельскохозяйс 13 твенных культур (Boyce, 1961; Smith et al., 1989; Аrsvoll, 1975; Tkachenko, 2013): оомицеты Pythium spp.; аскомицеты Dactylaria graminicola, Didymella pheina (син. Ascochytaphleina), Epicoccum nigrum (син. Epicoccum purpurescens), Gibberella avenacea (син. Fusarium avenaceum), Monographella nivalis var. nivalis (син. Microdochium nivale var. nivale), M. nivale var. majus, Nectria tuberculariformis (анаморф Acremonium boreale (Smith et al., 1989), Phoma sclerotioides (син. Plenodomus meliloti, Sclerotinia borealis (син. Myriosclerotinia borealis, Sclerotinia graminearum), S. nivalis, S. trifoliorum; базидиомицеты: Atheria sp. На Хоккайдо, Япония (Hoshino et al., 2009), Ceratobasidium gramineum, Coprinus psychromorbidus в Северной Америке, Rhizoctonia sp. В провинции Альберта, Канада (Smith et al., 1989), Ceratorhiza rhizoides (син. Sclerotium rhizodes Auesw. – Nom. Inval.) (Xu et al., 2010), Laetisaria fuciformis (син. Corticium fuciforme), Typhula incarnata, T. ishikariensis var. ishikariensis (син. T. borealis, T. hyperborea), T. ishikariensis var. idahoensis (син. T. idahoensis), T. ishikariensis var. canadensis, T. japonica в Японии (Terui, 1941), T. phacorrhiza, T. trifolii, T. variabilis; неопределнного систематического положения (incertae sedis): Sclerotium nivale (Nom. Inval.) в России (Tkachenko, 2003).

Возбудители снежных плесеней могут разделяться на облигатные и факультативные T. ishikariensis и T. incarnata, вызывающие крапчатую или серую снежные плесени, облигатные паразиты, а Pythium spp. и M. nivale, вызывающие питиозную и розовую снежные плесени – факультативные паразиты и могут развиваться без снега даже летом, когда холодно и сыро. Они умеренно толерантны к холоду. S. Borealis – некротроф, поражает растения, поврежднные низкими температурами.

Крапчатая (или серая) снежная плесень.

Возбудитель склероциальный гриб T. ishikariensis S. Imai отностися к классу Basidiomycetes, подклассу Hymenomycetes. Основной рост и развитие патогена происходит под постоянным снеговым покровом в течение четырх месяцев и более. Заражение растений происходит осенью с понижением температуры. Поздней осенью, прохладная, влажная погода (10-18С) и рассеянный ультрафиолетовый свет способствуют прорастанию склероциев (Потатосова, 1960; Пересыпкин, 1989). В годы с сухой и теплой осенью, склероции прорастают мицелием под снежным покровом (Hsiang et al., 1999). Из склероциев, находящихся на поверхности или в верхних слоях почвы, образуются плодовые тела с ножкой размером около 15 0,5 мм и светлой, слегка кремовой окраски спороносящей частью размером 4 1 мм булавовидной формы.

Половая стадия редко наблюдается в природе, и первичным инокулюмом является мицелий, формирующийся из склероциев. Мицелий распространяется под снежным покровом и проникает в растения непосредственно через ткани или устьица. После таяния снега склероции обычно находят на грибнице между листовыми влагалищами, на пластинках отмерших листьев и на поверхности почвы вблизи корней. Заселнные грибом мертвые ткани злаковых сгнивают и распадаются, склероции падают на солому и почву, где переживают лето (Hsiang et al., 1999).

Методы защиты озимой пшеницы от снежной плесени

Культуры низкотемпературных грибов М. nivale и Т. ishikariensis поддерживали на агаре в косяках, в колбах и на чашках Петри в климокамере при 2-5 С.

Поддерживание культуры М. nivale в пробирках (косяки). В чистые пробирки объмом 20 200 мм наливали приготовленную питательную среду в объме 10 мл. После автоклавировали при 0,5 атм. в течение тридцати минут. Затем раскладывали на ровной поверхности под углом 15 С до полного остывания и затвердевания питательной среды. В остывшие пробирки, при помощи препаровальной иглы вносили кусок мицелия гриба М. nivale, взятого с материнской культуры. Засеянные пробирки хранили при комнатной температуре до полного зарастания мицелием гриба всей поверхности питательной среды, а потом переносили в климокамеры.

Для поддержания культуры М. nivale в колбах применяли туже методику, что и при создании искусственного инфекционного фона (см. методику № 4). Определение таксонов М. nivale и Т. ishikariensis

Культуры низкотемпературных грибов разделяли на основе морфологических характеристик: гриб М. nivale - форма и размер макроконидий, Т. ishikariensis - цвет и размер склероциев. Для более точного определения видов использовали определитель грибов рода Fusarium В.И. Билай (1955).

Создание инфекционного фона проводили по усовершенствованному методу Ю.М. Стройкова и Л.Г. Серой (2001). Простерелизованное в автоклаве (при давлении 1 атм. в течение 40 мин). Соотношение пшеницы и воды 1:1. Остывшее зерно пшеницы засевали грибом M. nivalе. Колбы энергично встряхивали и для наработки иннокулюма помещали в климокамеру на шестьдесят дней, поддерживаятемпературу 10о С.

Использовали методику внесения инокулюма гриба разработаную Ю.М. Стройковым (1986) и модифицированную нами. Из колб извлекали заросшее мицелием гриба M. nivale зерно, взвешивали на торзионных весах (типа ВТ до 500 мг, ЗМА Киев) и распределяли по пакетам. Развешеный (100 г) и распределеный инокулем гриба равномерно рассыпали по поверхности опытной делянки (1 м2).

Изучение вредоносности РСП на озимой пшенице, проводилось, в полевых условиях, в период 2005-2012 гг. Были заложены мелкоделяночные опыты. Площадь делянок 1 м2. Схема опыта: 1. Контроль (внешне здоровые растения, без симптомов РСП); 2. Слабая интенсивность поражения – 1-30 %; 3. Средняя интенсивность поражения – 31-60 %; 4. Сильная интенсивность поражения – 61-100 %.

Опыт был выполнен в четырхкратной повторности. Делянки разбивались весной, фенологические наблюдения проводились в течение весны и лета. Уборку урожая проводили в конце июля - начале августа. При анализе снопового образца учитывали следующие показатели: число продуктивных стеблей с делянки (шт); длина колоса (см); высота растений (см); число колосков в колосе (шт); число зрен в колосе (шт); масса зерна с каждого колоса (г); масса 1 000 зрен (г). Продуктивность оценивали по массе зерна (с обмолоченного снопа), на каждой учтной делянки. 6. При обследовании посевов озимой пшеницы с целью выявления видового состава нематод пшеницы, поражнной РСП и внешне здоровых растений, был применен маршрутный метод.

На поле были отобраны модельные площадки (1 м2) соответствующие четырм степеням поражения РСП (см. методику № 5). С модельных площадок на протяжении вегетации пшеницы, включая и осенне-зимний период покоя, выкапывали тридцать больных и тридцать здоровых растений. Здоровые растения не имели признаков поражения грибами и нематодами.

Пробы брали в следующие фазы развития озимой пшеницы: фазы всходов (сентябрь), фаза кущения (октябрь, ноябрь, декабрь, март, апрель), фаза трубкова-ния (май), фаза колошения (июнь), фаза молочно-восковой спелости (июль). С каждых десяти растений брали среднюю навеску корней (10 г), листьев (20 г), стеблей (20 г), узел кущения (20 г). Образцы взяты в трхкратной повторности.

Для извлечения нематод из разных частей растений применяли модифицированный метод Бермана. Для данного метода использоваливоронки диаметром 120 мм, на раструб которых надевали кусок резинового шланга длинной 100 мм. В нижний конец шланга вставляли энтомологическую пробирку для сбора выделенных нематод. Воронки с резиновыми шлангами и с пробирками устанавливали в штативах со специально изготовленными отверстиями для воронок. В воронку помещали сито с ватным фильтром. На фильтр укладывали, очищенные от лишних примесей, навески разных частей растений слоем 3-5 мм. Воронки заливали водой так, чтобы жидкость покрыла помещенную на сито массу.

Продолжительность растительной экспозиции составляет двадцать четыре часа. Далее суспензия нематод из энтомологической пробирки наносили на предметное стекло и просматривали под микроскопом. Определяли видовой состав нематод с использованием работ по систематике нематод А.А. Парамонова (1962). Количество самцов, самок и личинок учитывали отдельно. 8. Методы культивирования нематод-микогельминтов на мицелии гриба Alternaria tenuis (Nees)

Поддержание популяций микогельминтов A. saprophilus, A. avenae. P. tritici. В засеянные грибом A. tenuis пробирки (см. методику № 2) вносили нематод, в одну пробирку по 100 особей. Пробирки экспонировали в термостате при комнатной температуре 18-23 С. Через 10-15 дней получалиот 3 000 до 5 000 особей нематод.

Оригинальные методики

Представленные методики были модифицированы и применялись для изучения влияния микогельминтов на мицелий гриба M. nivale, при низких положитиельных температурах 2-5 С.

Подготовка лабораторных сосудов, для выращивания в них модельных растений озимой пшеницы (вегетационный метод)

В лабораторные контейнеры объмом 200 мл насыпали 30 г прокаленной и обеззараженной (раствором марганцовки) почвы. В эту почву высевали по 622 семени на контейнер озимой пшеницы сорта Лютесценс–147. Через пять дней после посева появлялись первые всходы растений. Через 20-25 дней после посева после появления у растений двух настоящих листьев, они были заражены иноку-люмом M. nivale и содержались при комнатной температуре 15-20 С. После того, как мицелий гриба распространялся по поверхности питательной среды (через тридцать дней после посева), растения были инвазированы водной суспензией нематод.

Зависимость продуктивности озимой пшеницы от степени развития розовой снежной плесени

Материалом для наших исследований служили растительные образцы озимой пшеницы сорта Лютесценс-147 внешне здоровой и поражнной РСП. Полевые опыты были заложены и проведены на сорте озимой пшеницы «Лютесценс-147», так как по нашим данным этот сорт является наиболее восприимчивым к поражению РСП (Щуковская, 2004).

В течение 2005-2007 гг. сбор проб растений и почвы проводили на одном по-ле, то есть в условиях повторного посева. С 2011 г. посевные площади озимых зерновых были перенесены на участки, вышедшие из под чистого пара и исследования проводились на них. Всего за период наблюдений собрано и проанализировано свыше 2 500 проб растений.

Чистая культура гриба M. nivale, культуры нематод-микогельминтов A. saprophilus, A. avenae, P. tritici, специально отобранные из сборов нематод выделенных из поражнных РСП растений озимой пшеницы, служили материалом для проведения исследований по изучению влияния нематод на развитие M. nivale. Работа проводилась в 2011-2013 гг. Методы исследований:

Для выделения в чистую культуру и сохранения низкотемпературных грибов M. nivale и T. ishikariensis использовали искусственную питательную среду – картофельно-глюкозный агар. Для приготовления картофельно-глюкозного агара использовали готовый картофельно-глюкозный агар или изготовляли сами. Приготовление картофельно-глюкозного агара (КГА).

Агар (100 г) заранее расплавляли в 500 мл воды до полного растворения частиц. Очищенный и мелко нарезанный картофель (1 кг) варили до полной готовности в 500 мл воды. Отвар картофеля процеживали и добавляли в растворнный агар. Полученный раствор доводили до 1 000 мл, затем добавляли глюкозу (10 г). Вс тщательно перемешивали и разливали по стеклянным колбам объмом 1 000 мл, закрывали ватно-марлевыми пробками. Готовую питательную среду автоклавировали при 0,5 атм. в течение тридцати минут.

Готовый картофельно-глюкозный агар (PDA – potato dextrose agar фирмы Himedia, Индия). г порошка в 1 000 мл дистилированной воды. Колбу с раствором нагревали на водяной бане до полного растворения порошка. Стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм (121 С) в течении тридцати минут.

Выделение в чистую культуру Возбудителя РСП озимой пшеницы Кусочки поражнных грибом M. nivale растений ополаскивали в стерильной воде и помещали на PDA в чашки Петри и выращивали при комнатной температуре (20 С). Через пять дней мицелий гриба полностью обрастал поверхность питательной среды. Заросшие чашки Петри помещали в климокамеры SANYO MPR-311 D (H) и выдерживали при температуре 5 С. Гриба Typhula ishikariensis возбудителя тифулза озимой пшеницы

Перед помещением на питательную среду склероции помещали в воду для набухания. Иногда для стимуляции прорастания склероции некоторое время (1-2 ч) выдерживали в воде при темературах близких к 0 С. Для выделения пользовались общепринятыми методами: промывание склероциев под струй воды, опускание на несколько секунд в абсолютный спирт, нанесение повреждения оболочке склероция стерильными инструментами, промывание в стерильной воде, а затем пернос на КГА. В расплавленную среду на кончике стерильного скальпеля добавляли против загрязнения бактериями антибиотик Стрептомицин. Культуральные характеристики

Культуры низкотемпературных грибов М. nivale и Т. ishikariensis поддерживали на агаре в косяках, в колбах и на чашках Петри в климокамере при 2-5 С.

Поддерживание культуры М. nivale в пробирках (косяки). В чистые пробирки объмом 20 200 мм наливали приготовленную питательную среду в объме 10 мл. После автоклавировали при 0,5 атм. в течение тридцати минут. Затем раскладывали на ровной поверхности под углом 15 С до полного остывания и затвердевания питательной среды. В остывшие пробирки, при помощи препаровальной иглы вносили кусок мицелия гриба М. nivale, взятого с материнской культуры. Засеянные пробирки хранили при комнатной температуре до полного зарастания мицелием гриба всей поверхности питательной среды, а потом переносили в климокамеры.

Для поддержания культуры М. nivale в колбах применяли туже методику, что и при создании искусственного инфекционного фона (см. методику № 4). Определение таксонов М. nivale и Т. ishikariensis Культуры низкотемпературных грибов разделяли на основе морфологических характеристик: гриб М. nivale - форма и размер макроконидий, Т. ishikariensis - цвет и размер склероциев. Для более точного определения видов использовали определитель грибов рода Fusarium В.И. Билай (1955). 3. Подготовка инокулюма для создания инфекционного фона Создание инфекционного фона проводили по усовершенствованному методу Ю.М. Стройкова и Л.Г. Серой (2001). Простерелизованное в автоклаве (при давлении 1 атм. в течение 40 мин). Соотношение пшеницы и воды 1:1. Остывшее зерно пшеницы засевали грибом M. nivalе. Колбы энергично встряхивали и для наработки иннокулюма помещали в климокамеру на шестьдесят дней, поддерживаятемпературу 10о С. 4. Внесение инокулюма гриба M. nivale на опытные делянки в полевых условиях Использовали методику внесения инокулюма гриба разработаную Ю.М. Стройковым (1986) и модифицированную нами. Из колб извлекали заросшее мицелием гриба M. nivale зерно, взвешивали на торзионных весах (типа ВТ до 500 мг, ЗМА Киев) и распределяли по пакетам. Развешеный (100 г) и распределеный инокулем гриба равномерно рассыпали по поверхности опытной делянки (1 м2).

Обнаруженные микогельминты в очаге розовой снежной плесени озимой пшеницы

Многие зарубежные авторы (Lagerlof, 2011; Ruess, 1996; Barness, Russell, 1981) указывают на возможность использования нематод-микогельминтов, регулирующих развитие фитопатогенных грибов, таких как R. solani (Kuhn), Pythium spp, B. cinerea (Pers.), V. dahlia (Kleb.), F. oxysporum (Schl.). Однако до сих пор вопрос о взаимоотношении нематод-микогельминтов и паразитических грибов до конца не изучен и не выходит за рамки лабораторных исследований.

Результаты наших исследований, показывают, что между микогельминтами A. avenae, P. tritici, A. saprophilus обнаруженными в тканях растений озимой пшеницы поражнной грибом M. nivale, который вызывает это заболевание, существует тесная трофическая связь. Особенно чтко это связь прослеживается в весенний период вегетации пшеницы, когда в очагах РСП наблюдается увеличение численности популяции микогельминтов по сравнению с другими видами нематод. Взаимоотношения между грибами и нематодами могут быть самыми разнообразными. В зависимости от этого возрастает, убывает или оста-тся неизменной биомасса одного вида в присутствии другого. Большую роль на развитие взаимоотношений микроорганизмов, в агроценозах играет температура окружающей среды, которая прямо влияет на процессы проявления их жизнедеятельности (Шестепров, Савотиков, 1995).

Нами были проведены исследования, основной целью которых было показать, что A. avenae, P. tritici и A.saprophilus способны питаться и размножаться на мицелии гриба M. nivale. Исследования происходили в несколько этапов:

Этап I. Виды микогельминтов A. avenae, P. tritici и A. saprophilus способны питаться и размножаться на мицелии гриба, в контролируемых условиях. Размножение нематод-микогельминтов на мицелии гриба M. nivale наблюдали при трех температурах: 5, 15 и 27 С. Для этого отбирали пробирки с равномерно развитым мицелием. Засеянные пробирки были инвазированы водной суспензией микогельминтов, в количестве 100 экз. (± 20) на одну пробирку, после чего их поместили в климокамеру Sanyo MPR-311D (H) при температурах 5 и 15 С и в термостат ТВЗ-25 при 27 С. Каждую серию опыта анализировали, когда в большинстве пробирок мицелий гриба был съеден микогельминтами. Когда мицелий полностью исчез с поверхности питательной среды, нематод выделяли и подсчитывали их количество. Результаты исследований приведены в таблице 9.

Микогельминты A. avenae, P. tritici и A. saprophilus хорошо размножались на грибе M. nivale, но на их проявление жизнедеятельности оказывала влияние температура. Все виды микогельминтов размножались при температурах 5 и 15 С. В пробирках с нематодами, которые хранились при температуре 27 С, была отмечена ограниченная активность (в некоторых пробирках обнаруживались живые особи в единичном количестве). A. avenae, P. tritici и A. saprophilus при этой температуре плохо размножались. При 5 С вид P. tritici уничтожил мицелий гриба M. nivale в течение 70-75 дней. Численность его при этом составила - 536 экз. на пробирку. При 15 С мицелий гриба, вследствие питания микогельминта, исчез за 40-45 дней, численность популяции вида была – 444 экз. на пробирку. Температура 27 С оказалась неблагоприятной для вида P. tritici: численность (93 экз.) нематод была меньше, чем в первоночальном инокулюме (табл. 9).

Вид A. avenae при 5 С полностью уничтожил мицелий гриба за 70-75 дней, численность популяции вида была – 627 экз. на пробирку. При культивировании A. avenae при 15 С обнаружено, что этот вид обладает меньшей скоростью размножения, что естественным образом сказалось на его численности – 536 экз. на пробирку. При 27 С численность A. avenae не превышала первоначальную (116 экз. на пробирку) (табл. 9).

Температура 5 С оказалась благоприятной для культивирования микогель-минта A. saprophilus. Этот вид использовал все пищевые ресурсы за 60-65 дней, его численность при этом составила 661 экз. на пробирку. При 15 С A. saprophilus уничтожил мицелий гриба M. nivale за 40-45 дней, но численность нематод этого вида была меньше, чем при 5 С – 536 экз. на пробирку. При температуре 27 С размножениеэтого вида не отмечалось.

Коэффициент размножения при температуре 5 С у всех видов колебался от 4,8 до 7,1, при этом нематоды использовали все представленные пищевые ресурсы (мицелий гриба M. nivale) за 50-75 дней. Однако при температуре 15 С скорость размножения у микогельминтов уменьшилась (коэффициент размножения – 4,65-6,09), что естественным образом сказалось на численности популяции (P. tritici – 444 экз. на пробирку, A. avenae – 536 экз. на пробирку и у A. saprophilus – 570 экз.). В пробирках, хранившихся при этой температуре, были отмечены единичные погибшие особи, что не наблюдалось в пробирках при температуре 5 С. В тоже время, у видов P. tritici, A.avenae и A. saprophilus при температуре 27 С не зарегистрировано размножения (коэффициент размножения – 1,14-1,48). К тому же, при этой температуре во многих пробирках погибли практически все нематоды. Наибольшая скорость размножения при температурах 5 и 15 С, наблюдалась у микогельминта A. saprophilus. Его численность была в 1,5 раза выше, чем у других видов.

Температура культивирования также оказывала влияние на половой и возрастной состав популяций. У видов P. tritici, A.avenae и A. saprophilus с увеличением температуры от 5 до 15 С зарегистрировано увеличение численности личинок (P. tritici от 70,4 до 77,8 %; A.avenae от 80,5 до 91 % и A. saprophilus от 85,4 до 92,2 %). Скорей всего это можно объяснить тем, что многие половозрелые самки погибали при более высокой температуре. При 27 С резко сокращалась численность личинок видов, скорей всего личинки просто не успевали выйти из яиц. С увеличением температуры до 15 С у нематод A. saprophilus отмечено увеличение численности самцов от 2 до 10 %.

Анализ полученных данных по культивированию трх видов мико-гельминтов на грибе M. nivale показывает, что температура влияла на размножение нематод, на сроки использования представленных пищевых ресурсов, на половой и возрастной состав.

Вид A. saprophilus оказался наиболее агрессивным по отношению к низкотемпературному грибу M. nivale. Он не только смог уничтожить весь мицелий, но и достиг при этом высокой численности популяции. Это объясняется его оригинальным свойством – способностью питаться и размножаться при пониженных температурах.