Введение к работе
Актуальность темы. На современном этапе возрастают требования к исходному посадочному материалу цветочно-декоративных растений, который в соответствии с последними стандартами должен быть свободен от различных вредителей и болезней. В этой связи биотехнологические методы приобретают лидирующую роль в получение высококачественного материала гладиолуса.
Гладиолус - является популярной высокодекоративной цветочной культурой, выращиваемой по всему миру. Ускоренное размножение гладиолуса в течение последних 15-20 лет вьцьшает огромный интерес, как исследователей - ботаников, биотехнологов, селекционеров, так и производственников. Традиционный вегетативный метод не позволяет размножить быстро и в достаточном количестве новые сорта и гибриды. Многие гибриды имеют низкий коэффициент размножения, что препятствует их аттестации на сорт. Обычно для выведения нового сорта селекционеру требуется 10-12 лет. Все это сдерживает процесс сортосмены и обедняет ассортимент цветочной продукции.
При дефиците исходного материала значительно ускорить размножение позволяет метод клонального микроразмножения. Данный метод был использован для некоторых сортов гладиолуса, однако, при этом недостаточно полно изучено влияние стерилизующих растворов, регуляторов роста, минерального и органического состава питательной среды, условий культивирования на процессы регенерации растений. Довольно слабым звеном в технологическом процессе остается пересадка пробирочных растений в нестерильные условия. Для гладиолуса практически не изучены вопросы длительного культивирования in vitro, как эффективный прием сохранения ценных генотипов.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось изучение особенностей регенерации и клонального микроразмножения гладиолуса, а также определение возможности использования этих приемов при производстве посадочного материала. Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
разработать эффективные методы получения стерильной культуры эксплантов;
изучить поведение различных типов почек на клубнелуковице и клубнепочек при культивировании in vitro;
оптимизировать состав питательных сред для всех этапов культивирования;
изучить влияние гормональных факторов питательной среды и физических факторов выращивания на процессы микроразмножения гладиолуса;
определить оптимальные концентрации азотнокислого кальция и изучить действие пониженных температур при длительном хранении пробирочных растений;
разработать приемы клоналыюго микроразмножения гладиолуса для получения целых растений - регенерантов и выявить условия подготовки этих растений к высадке в почву.
Научная новизна результатов исследований. Проведенные исследования позволили установить возможность применения культуры изолированных органов и тканей для размножения гладиолуса. Разработаны эффективные приемы получения асептической культуры первичных эксплантов, выявлены наиболее благоприятные сроки изоляции in vitro изолированных почек гладиолуса семи сортов, различных по происхождению и срокам цветения, изучена реакция эксплантов на экзогенные регуляторы роста в сочетании с трофическими и физическими факторами культивирования. Установлена возможность микроразмножения гладиолуса четырьмя методами: дедифференциация интактных тканей с последующим каллусообразованием; активация роста почек возобновления; индукция образования адвентивных побегов; формирование зачатков корней в тканях экспланта.
Разработан состав питательной среды для длительного хранения, обеспечивающий наибольшую жизнеспособность пробирочных растений (А. С. №1695854).
Практическая ценность. На основании полученных результатов предложена усовершенствованная технология клонального микроразмножения гладиолуса, позволяющая повысить выход посадочного материала в 3-5 раз, в зависимости от сорта, снизить затраты труда и себестоимость продукции по сравнению с общепринятой технологией,
Применение разработанных элементов технологии дает возможность более успешно решать проблему оздоровления и ускоренного размножения ценных сортов, сократить сроки их получения и сохранить ценный материал.
Внедрение в практику. Растения гладиолуса, полученные методом клоналыюго микроразмножения, переданы для интродукции и сорто-изучения в коллекцию Главного ботанического сада РАН.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Республиканской конференции "Проблемы современного садоводства"
з (г. Киев, 1989), на II международной конференции "Биология культивируемых клеток растений и биотехнология" (Алматы, 1993), на III конференции " Регуляторы роста и развитие растений" (Москва, 1995), на заседаниях Ученого Совета и секции ягодных культур ВСТИСП (1989 -1992, 1998), экспонировались на ВДНХ СССР, 1989 (удостоверение №
6).
Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано десять научных работ.
Объем работы. Диссертационнная работа изложена на 125 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 8 глав, отражающих экспериментальный материал, обсуждения, выводов, рекомендаций производству. Работа содержит 25 таблиц и 18 рисунков. Список использованной литературы состоит из 172 наименований, в том числе 102 на иностранных языках.
Объекты, условия и методика проведения исследований. Исследования проводили в 1988-1992 г. в лаборатории биотехнологии отдела размножения. Для выявления сортовой специфики использовали сорта гладиолуса коллекции ГБС РАН четырех сортовых групп: ранние - Спринт. Сонг, Диксиленд, Хот-Липс; средне-ранние - Арес; средние - Бенгален, Кохинор; средне-поздние - Джестер.
Получение стерильных культур для экспериментов осуществляли по методике Р. Г. Бутенко (1964). Экспланты для введения в культуру брали в разные сроки соответствующие фазам развития клубнелукович-ных растений: началу вегетации, органического покоя, вынужденного покоя. В качестве стерилизующих растворов использовали 0,1 % сулемы, 0,1 % диацида, 0,1 % мертиолата.
Экспланты в стерильных условиях помещали на искусственные питательные среды: агаризованные, стационарные жидкие, и постоянно перемешиваемые жидкие.
Были испытаны составы: Мурасиге-Скуга, Гамборга, Ли-де Фос-сарда, Хеллера. Минеральная основа всех использовавшихся сред была дополнена тиамином, пиридоксином, никотиновой кислотой по 0,5 мг/л, аскорбиновой кислотой 1,0 мг/л.
Для выявления источника углеводов на развитие эксплантов в питательную среду добавляли сахарозу, глюкозу, лактозу, мальтозу манит и дульцит в концентрации 30 г/л. В зависимости от целей опытов на разных этапах культивирования в питательную среду вводили следующие
регуляторы роста: 6-бензнламинопурин (6-БАП), зеатин (3), кинетин (К), индолнлуксусную кислоту (ИУК), нафтилуксусную кислоту (НУК), ин-долнлмаслянную кислоту (ИМК), тиадиазурон (ТДг), 2-изопентиладенин (2-ІР).
Культивирование растений проводили при температуре 23-25С, освещенности 2000 - 3000 лк и фотопериоде 16 часов.
На хранение закладывали укорененные побеги длиной 7-11 см, взятые со среды для укоренения.
Хранение проводили при температуре 4-6С в бытовом холодильнике и в комнатных условиях (22С).
Повторность в опытах неизолированная, число, повторностей в каждом варианте опыта от 15 до 30. Статистическую обработку данных проводили по Н.А.Плохинскому, 1970; Б.А. Доспехову, 1973; В.А. Потапову, В.И. Кашину, А.Г. Курсакову 1997, а также с использованием пакета программ "Statgraph" на персональном компьютере типа РС-386 AT.