Содержание к диссертации
Введение
1 Bacillus thuringiensis Berliner – основа современных бактериальных инсектицидов (обзор литературы) 12
1.1 Стратегии вирулентности Bacillus thuringiensis 15
1.2 Биопрепараты на основе Bacillus thuringiensis: производство и разнообразие 27
2 Условия, материалы и методы исследований .37
3 Результаты исследований их обсуждение 52
3.1 Поиск и изучение новых изолятов и штаммов Bacillus thuringiensis 52
3.1.1 Использование ПЦР анализа для идентификации изолятов 52
3.1.2 Анализ морфологии колоний изолятов 55
3.1.3 Анализ микроскопии изолятов 55
3.2. Оценка инсектицидной активности изолятов и штаммов Bacillus thuringiensis 58
3.3 Морфологические особенности кристаллических включений у разных штаммов Bacillus thuringiensis 63
3.4 Сравнительная характеристика штаммов коллекции лаборатории протеомики надорганизменных систем ФГБНУ ВНИИСХМ 76
3.4.1 ПЦР – анализ штаммов B. thuringiensis 76
3.4.2 Определение таксономической принадлежности штаммов B. thuringiensis методами молекулярной систематики 79
3.5 Действие Bt-инсектицидов в отношении целевых насекомых 83
3.5.1 Эффективность Bt – инсектицидов в отношении колорадского жука 83
3.5.2 Эффективность Bt – инсектицидов в отношении желтого крыжовникового пилильщика 90
3.6 Безопасность экспериментальных и промышленного препаратов на основе Bacillus thuringiensis для нецелевой биоты в лабораторных и полевых условиях 93
3.6.1 Действие препаратов на основе Bt в отношении Harmonia axyridis Pallas 94
3.6.2 Действие препаратов на основе Bt в отношении Orius laevigatus Fieb 99
3.6.3 Действие препаратов на основе Bt в отношении Macrolophus pygmaeus Rambur 101
3.6.4 Оценка действия препарата Лепидоцид на полезных членистоногих сада 103
Заключение 106
Список сокращений и условных обозначений 109
Список литературы 110
Приложения 133
- Стратегии вирулентности Bacillus thuringiensis
- Оценка инсектицидной активности изолятов и штаммов Bacillus thuringiensis
- Эффективность Bt – инсектицидов в отношении колорадского жука
- Оценка действия препарата Лепидоцид на полезных членистоногих сада
Стратегии вирулентности Bacillus thuringiensis
Насекомые обладают широким диапазоном средств для защиты от патогенных микроорганизмов. Физические и химические барьеры предотвращают проникновение микроорганизмов или мешают им наносить существенный урон. К физическим барьерам можно отнести внешнюю кутикулу, перистальтику кишечника, перитрофическую мембрану (внутренний слой средней кишки насекомых), кишечную микробиоту. А к химическим барьерам относятся: рН среднего отдела кишечника, протеазы, антимикробные пептиды, клеточные рецепторы и иммунная система (Chernysh, 2015). Поэтому для патогенов необходимо обладать молекулярными и биохимическими ресурсами и инструментами, чтобы преодолевать защиту хозяев и размножаться в его теле, вызывая болезнь. Такие качества микроорганизма называются факторами вирулентности. Под вирулентностью понимается способность инфекционного агента заражать восприимчивый организм. Бактерии Bacillus thuringiensis продуцируют целый ряд соединений, поддерживающих их инфекционную природу. Часть этих факторов вирулентности являются общими для представителей группы B. cereus, например, цвиттермицин А, гемолизины, гемолитический комплекс и некоторые энтеротоксины (Abdel-Hameed,1994; Guttmann, 2000; Hansen, 2001). Другие факторы вирулентности являются отличительной особенностью Bt как биологического вида – это Cyt- и Cry-эндотоксины. Как общие, так и видоспецифичные факторы вирулентности способствуют реализации шести стратегий вирулентности (Arglo-Filho, 2014):
1. Устойчивость к воздействию иммунной системы хозяина.
Предотвращение фагоцитоза и резистентность к противомикробным соединениям, пищеварительным ферментам, рН и активным формам кислорода.
2. Производство деградирующих ферментов. Деградация противомикробных агентов насекомого и облегчение колонизации кишечника. В некоторых случаях, прямая токсичность.
3. Снижение интенсивности питания и перистальтики кишечника.
4. Выделение антимикробных веществ. Снижение конкуренции за пространство и питательные вещества, а также сокращение числа противомикробных соединений, производимых микробиотой средней кишки хозяина.
5. Противомикробная резистентность. Устойчивость к противомикробным соединениям, производимым микробиотой средней кишки хозяина. Возможность размножаться в насекомом-хозяине.
6. Производство токсинов. Деградация кишечной мембраны и получение питательных веществ, благоприятствующих прорастанию спор и размножению. Проникновение в гемолимфу и септицемия. Протеазы. Фосфолипазы. Чтобы противостоять иммунной системе хозяина, бактерии должны избегать бактерицидной активности фагоцитов. Макрофаги представляют собой первую линию защиты насекомого от бактериальных патогенов. Как правило, они поглощают бактерии и инициируют локальный иммунный ответ, снижающий ущерб от патогенов. (Rabinovitch, 1995). Поверхность споры или экзоспориум является первым бактериальным компонентом, взаимодействующим с хозяином. Основным белком экзоспориума у представителей группы B. cereus является металлопротеаза InhA1, которая позволят бактериям избегать действия макрофагов. InhA1 может вызывать экзоцитоз и / или цитотоксичность, позволяя патогенам размножаться вне макрофагов, в конечном счете, приводя к смерти макрофагов. В исследовании N. Ramarao и D. Lereclus (2005) было проведено сравнение штаммов Bacillus subtilis не экспрессирующих ген InhA1 из B. thuringiensis и мутантов, экспрессирующих InhA1. B. subtilis - непатогенный почвенный оргазм, не относящийся к группе Bacillus cereus. В результате подавляющее большинство спор B. subtilis, не имеющих металлпротеазы, были захвачены макрофагами и не могли прорастать и размножаться, хотя и не были убиты. А споры с InhA1 успешно спасались от макрофагов (Ramarao, 2005).
Важными для патогенности биологически активными веществами, синтезируемыми бактериями группы Bacillus cereus, являются вещества, позволяющие разрушать антимикробные пептиды насекомых. Это свойство было также обнаружено у InhA1, металлпротеаза деградировала аттацины и цекропины - антимикробные белки насекомых (Dalhammar, 1984; Ramarao, 2005).
Ген иммунного ингибитора А (inA) первоначально был обнаружен у B. thuringiensis. Благодаря этой протеазе происходит специфическая деградация антибактериальных белков. Считается, что inA вносит вклад в специфичность действия Bt в отношении насекомых. Однако, схожие гены были обнаружены и у других представителей группы Bacillus cereus - B. cereus и B. anthracis (Guttmann, 2000).
Перитрофическая мембрана насекомого, помимо хитина, гликопротеинов и протеогликанов, образована четырьмя классами белков (Terra, 2001). И обнаружено, что протеазы могут давать синергетический эффект с инсектицидными токсинами Bt за счет влияния на белки мембран насекомого (Gominet, 2001).
Фосфолипаза С продуцируется большинством штаммов Bt и B. cereus (Volwerk,1989). Роль фосфолипаз в гидролизации фосфолипидов - сложных эфиров фосфатидной кислоты, являющихся компонентами всех биологических мембран. Также фосфолипаза вовлечена в энтомопатогенный процесс бактерий Bt (Raddadi, 2007).
Хитиназы. Хитин – это не растворимый линейный полимер N ацелитглюкозамина, являющийся основным компонентом кутикулы насекомых, а также входящий (3-13%) в состав перитрофической мембраны (Tellam, 1999). Не случайно, хитиназы вносят свой вклад в вирулентность некоторых патогенов, которые заражают насекомое через кишечник и кутикулу и должны преодолеть хитин-содержащий барьер. Еще в начале 1970-х было отмечено увеличение ларвицидного эффекта Bt при добавлении хитиназ, продуцируемых Serratia marcescens (Regev, 1996). Однако, B. thuringiensis содержит и свои собственные хитиназы, оказывающие синергетический эффект вместе с другими факторами патогенности бактерии (Wiwat, 2000; Arora, 2003).
Вегетативные инсектицидные токсины (Vip). В период вегетативного роста некоторые штаммы Bt продуцируют инсектицидные белки, которые секретируются в среду. Впервые Vip-токсины были обнаружены в середине 1990-х, на данный момент описано 176 Vip-токсинов, распределенных на 4 класса: Vip 1, Vip 2 Vip 3 и Vip 4 (Crickmore, 2017). Vip 1 и Vip 2 представляют собой бинарные белковые соединения с высокой инсектицидной активностью в отношении некоторых жесткокрылых вредителей (например, Diabrotica spp.) и против хлопковой тли Aphis gossypii. Свое действие на целевую клетку Vip1 и Vip2 токсины реализуют в паре, при этом Vip 1 представляет собой рецепторо-связывающий домен, обеспечивающий путь в клетку для ADP-рибозилазы Vip 2 токсина (Warren, 1998; Sattar, 2011).
Vip 3 - это линейный, не бинарный токсин, активный в отношении широкого спектра чешуекрылых насекомых (Estruch, 1996). Для Vip3 токсинов была показана способность образовывать каналы в клеточной стенке чувствительного насекомого. При этом Vip3-токсин связывается с эпителиальными клетками средней кишки восприимчивых насекомых, вызывает их лизис, паралич кишечника и смерть (Yu, 2012). Однако, этот механизм действия отличается от работы Cry- токсинов по механизму связывания с рецептором и свойствам ионного канала. Белки Vip и Cry не конкурируют за сайты связывания у чешуекрылых Manduca sexta и S. frugiperda (Lee, 2003; Sena, 2009). Кроме того, обширные исследования in vitro и in vivo показали почти полное отсутствие перекрестной резистентности между Vip3A и Cry1 белками (Lee, 2006; Mike, 2006).
Наличие Vip3 токсинов открывает возможность использования биопестицидов на основе Bt в отношении большего числа вредителей, а также препятствует развитию устойчивости насекомых к Cry- белкам (Sena, 2009; Bravo, 2011).
Диапазон чувствительных хозяев и механизм действия Vip 4-токсина пока остается неизвестным. Однако, выявлена его филогенетическая близость с Vip1 белками (Crickmore, 2017).
Оценка инсектицидной активности изолятов и штаммов Bacillus thuringiensis
Инсектицидная активность в отношении стандартного тест-объекта -личинок 4 возраста Aedes aegypti была проверена для 24 Bacillus thuringiensis subsp. israelensis (Bti)- изолятов (таблица 2) и 10 B. cereus group (Bcg)-изолятов, не отнесенных в Bt subsp. israelensis. Все Bti- изоляты, за исключением двух изолятов, утративших кристалл (5.2.4., 14.1.3.), обладали инсектицидной активностью в отношении личинок комаров A. aegypti. Максимально использованная концентрация спорово-кристаллических препаратов составляла 1% культуральной жидкости (КЖ), и вызывала 100% гибель личинок в течение нескольких часов после постановки опыта. Зависимость гибели личинок от концентрации КЖ была прямой и сильной (коэффициент корреляции r = 0,8).
Для более точной оценки действия препаратов на личинок, была определена ЛК50, которая составила от 8 10-5 до 20 10-5 КОЕ/мл. Два изолята, утратившие кристалл, не обладали инсектицидным действием, как при максимальной концентрации, так и при низких концентрациях КЖ.
Изоляты, не отнесенные к Bti, также не показывали инсектицидного действия. Такой результат является ожидаемым, поскольку данные изоляты не показали наличия cry4 генов, согласно ПЦР - анализу, а также не имели кристаллических включений, по данным микроскопии.
Проверка активности в отношении личинок A. aegypti является стандартным методом контроля качества штаммов Bti, используемых для производства препаратов от кровососущих насекомых по всему миру (Crickmore, 1995). Поэтому, A. aegypti использовался как целевой объект для проверки Bti-изолятов. Большинство изолятов показали значение ЛК50, сравнимое с данными ЛК50 для штаммов-продуцентов Бактокулицида BtH14 ((15-18) 10-5) из литературы (Кандыбин, 2009; Сафронова, 2012). Также нами был использован контроль – штамм 3.12, продуцент экспериментального препарата Бактокулицид, его ЛК50 для личинок комара составляла 1210-5%. В результате сравнения ЛК50 изолятов и контроля, были отмечены два изолята (2.1.1., 4.1.4.), имеющие существенно отличающиеся показатели и являющиеся перспективными для использования в качестве штаммов-продуцентов новых бактериальных препаратов.
Интересным кажется тот факт, что 2.1.1. и 4.1.4., как и другие изоляты из коллекции SLU, не имеют Cry11 токсинов, в отличие от контрольного штамма 3.12, что не повлияло на их эффективность в отношении A. aegypti.
Были проведены исследования действия семи Bti изолятов (1.1.1., 1.2.1., 2.1.2., 2.1.4., 12.2.1., 13.1.2., 14.1.3) в отношении личинок Hermetia illucens. Этот объект не является целевым для Bti, более того, нет данных в литературе о возможном действии Bt на личинок черной львинки. Предполагалось, что кристаллогенные изоляты могут оказывать действие на личинок младших возрастов. Также в анализ были добавлены экспериментальные препараты Бацикол и БТБ на основе Bt subsp. darmstadiensis и Bt subsp. thuringiensis соответственно. Эти препараты помимо кристаллов эндотоксина имеют в своем составе - экзотоксин и могут иметь более широкий спектр действия, чем препараты, содержащие только Cry-токсины.
Однако, никакого действия Bti-изолятов, как и экспериментальных препаратов БТБ и Бацикол на личинок H. illucens обнаружено не было. Скорее всего, личинки H. illucens не могут быть использованы для оценки инсектицидной активности препаратов на основе Bt, поскольку являются не чувствительным видом. Таким образом, большинство (22 из 24) Bti –изолятов, полученных из природных субстратов, были активны в отношении A. aegypti. ЛК50 изолятов была близка с показателями инсектицидов на основе Bacillus thuringiensis subsp. israelensis. Изоляты 2.1.1. и 4.1.4. показали наилучший результат по эффективности в отношении личинок комара.
Личинки H. illucens были не чувствительны к экспериментальным препаратам Бацикол, Ж и Битоксибациллин, Ж а также к кристаллогенным изолятам, отнесенным к Bt subsp israelensis.
Эффективность Bt – инсектицидов в отношении колорадского жука
В соответствии с целью и поставленными задачами, исследования по определению биологической эффективности препаратов на основе Bt проводились по нескольким направлениям. Изучались биологические и экологические особенности действия препаратов в различных условиях развития популяций вредителя, осваивались методы учета численности вредителей и энтомофагов, уделялось внимание аспектам токсичности исследуемых препаратов в отношении нецелевой биоты.
Картофель является одной из основных производственных культур в России, и разработка систем защиты картофеля – наиважнейшая задача биологической защиты растений. Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say 1824) занимает исключительное положение среди других вредителей пасленовых не только из-за своей вредоносности, но и в силу биологических особенностей. Гетерогенность популяции, высокая плодовитость, наличие разных типов физиологического покоя, способность к расселению различными путями делают его чрезвычайно опасным объектом.
Исследования действия экспериментальных биологических инсектицидов на основе Bt subsp. thuringiensis (штамм BtH1-800) и Bt subsp. darmstadiensis (штамм BtH10-109 и BtH10-56) и были проведены в трех регионах России – Ленинградской области, республике Марий Эл и в Воронежской области.
Популяция колорадского жука на посадках картофеля сорта Удача в ООО «Славянка-М» (Ленинградская обл., Гатчинский район) была представлена личинками младших возрастов (рисунок 20). Экспериментальные препараты на основе КЖ штаммов BtH1-800 (Битоксибациллин, жидкая форма) и BtH10-109 (Бацикол, жидкая форма) испытывались в концентрации 5%. В качестве эталона был использован инсектицид Регент, ВДГ, содержащий 800 г/кг фипронила, в норме применения 0,02 кг/га, – зарегистрированный, применяемый на практике и высокоэффективный препарат. По сравнению с эталоном, бактериальные препараты показывали низкую эффективность на 3 и 7 сутки, однако на 14 сутки учета в опытных вариантах не было обнаружено личинок и имаго колорадского жука, и эффективность составила 100% (рисунки 21,22).
При оценке биологической эффективности примененных бактериальных инсектицидов необходимо учитывать замедленное действие биопрепаратов. Обычно уже через 6-8 часов после обработки листогрызущие перестают питаться, то есть не наносят вред. Определенный процент вредителей может погибать на третьи сутки после обработки, однако максимальный эффект действия Bt-препаратов наступает через 7 дней после обработки. С учётом этих особенностей препараты оказались достаточно эффективными в регуляции численности колорадского жука.
Таким образом, результаты проведенных нами исследований по оценке действия экспериментальных микробиопрепаратов Битоксибациллин, Ж и Бацикол, Ж, позволяют сделать вывод о перспективности их использования в гомогенных популяциях колорадского жука, состоящих из личинок младших возрастов, в Ленинградской области для пополнения ассортимента экологически безопасных средств защиты растений.
Популяция колорадского жука на посадках картофеля сорта Белорусский в Волжском районе респ. Марий Эл была представлена личинками разного возраста. Экспериментальные препараты на основе КЖ штаммов BtH1-800 (Битоксибациллин, жидкая форма) и BtH10-109 (Бацикол, жидкая форма) испытывались в концентрации 5%.
На 6-е учетные сутки после обработки эффективность препаратов составляла 96,4% и 78 % для Битоксибациллина и Бацикола соответственно (рисунок 23). Однако, вследствие недостаточной изоляции участка, на опытных растениях обнаруживались имаго, перелетевшие из других территорий и откладывающие яйца. На 10 учетные сутки эффективность несколько уменьшилась за счет, как мы предполагаем, пополнения популяции вредителя с необработанных участков и составляла 88,2% и 52 % для Битоксибациллина и Бацикола соответственно.
В Воронежской области заселенность жуком составляла 30-40%, средняя численность была 50-60 особей на куст, популяция была представлена личинками 1-3 возрастов, также встречались единичные яйцекладки и имаго (рисунок 24). Экспериментальный препарат на основе Bt subsp darmstadiensis, штамм BtH10-56 в норме применения 20 л/га показал высокую эффективность на сортах картофеля Винета и Рокко, 87,2 и 96,0 % на 10 сутки учетного периода соответственно. На 6 сутки были проведены повторные обработки как экспериментальным, так и эталонным препаратом Цепеллин, КЭ (альфа-циперметрин 100 г/л), ввиду высокой активности вредителя. Благодаря этому на 14 учетные сутки эффективность оказалась близкой к 100% на обоих сортах картофеля (рисунки 25,26).
Согласно нашим исследованиям, препараты на основе Bt показали высокую эффективность (100%) в условиях, которые оказались идеальными для действия спорово-кристаллического комплекса, а именно – гомогенная популяция жука, состоящая из личинок младших возрастов и отсутствие сильной заселенности жуком соседних территорий (Ленинградская обл., 2016).
В условиях гетерогенной популяции жука, постоянном пополнении численности за счет переселения с соседних территорий, препараты на основе Bt дают более низкую эффективность, как было показано в респ. Марий Эл, 2016 (96,4% для БТБ, Ж и 78% для Бацикола, Ж). Однако, по-прежнему, биопрепараты на основе Bt являются более безопасной альтернативой химическим инсектицидам. При высокой заселенности колорадским жуком и его активности, должны быть рекомендованы повторные обработки экспериментальными препаратами. Так в Воронежской области при проведении двух обработок на 1 и 6 учетные сутки была получена высокая эффективность экспериментального препарата на основе штамма BtH10-56 (до 100%) на двух сортах картофеля.
Оценка действия препарата Лепидоцид на полезных членистоногих сада
Природные местные энтомофаги как биоценотический компонент входят в состав и структуру агроэкосистем и могут обеспечивать временное биоценотическое равновесие на уровне, не превышающем экономического порога вредоносности фитофагов. Благодаря использованию узкоспециализированных биопрепаратов, безопасных для энтомофагов сада, можно получать экологически чистую продукцию и сократить количество обработок за счет сохранения естественных врагов вредителей. Следовательно, у специалистов должны быть возможность и умение выбрать из многих эффективное и безопасное действующее вещество.
Были проведены наблюдения за скоростью восстановления исходной численности энтомофагов в агробиоценозе плодового сада после применения бактериального инсектицида Лепидоцид, П (БА 3000 ЕА/мг) (учебно-опытный сад Санкт-Петербургского государственного аграрного университета).
На опытных делянках в саду были обнаружены представители кокцинеллид (Coleoptera, Coccinellidae), златоглазок (Neuroptera, Chrysopidae), мух сем. Syrphidae (Diptera), клопов сем. Anthocoridae, Miridae, Nabidae (Hemiptera), перепончатокрылых сем. Aphidiidae (Hymenoptera), пауков (Araneae), но преобладали златоглазки (Chrysopidae), кокцинеллиды (Coccinellidae), клопы (Nabidae).
Кусты черной смородины были обработаны Bt-инсектицидом Лепидоцид в двух нормах применения (1,0 и 1,5 кг/га), и проводилось наблюдение за изменением численности преобладающих групп энтомофагов, а именно -златоглазок, хищных клопов (Anthocoridae, Miridae, Nabidae) и кокцинеллид. Численность златоглазок, кокцинеллид и клопов на протяжении 28 суток после обработки была на уровне численности данных энтомофагов в контрольном варианте (рисунки 40, 41, 42). Следовательно, испытываемый Bt-препарат не угнетает развития естественных энтомофагов сада.
Все изученные в лабораторных условиях препараты относятся к неопасным или малоопасным, согласно шкале оценки токсичности препаратов на основании учета смертности: Битоксибациллин не опасен для имаго Harmonia axyridis и личинок Macrolophus pygmaeus (смертность до 10 %) и мало опасен для личинок H. аxyridis (смертность до 50 %). Бацикол не опасен для имаго H. аxyridis и мало опасен для личинок H. аxyridis и M. рygmaeus. Лепидоцид не опасен для H. аxyridis и мало опасен для M. рygmaeus.
Проведенные полевые исследования показали, что Лепидоцид не угнетает развития естественных энтомофагов сада – златоглазок, хищных клопов (Anthocoridae, Miridae, Nabidae) и кокцинеллид.