Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Вредоносность и распространенность сосудистого бактериоза капусты 8
1.2. Систематическое положение возбудителя 10
1.3. Симптомы 13
1.4. Расовый состав патогена 16
1.5. Методы защиты капусты от сосудистого бактериоза 18
1.6. Методы диагностики зараженности 26
1.7. Генетика Xanthomonas campestris pv. campestris 31
ГЛАВА 2. Материал и методы 33
2.1. Выделение и хранение чистых культур возбудителя 33
2.2. Идентификация рас патогена и оценка устойчивости к сосудистому бактериозу селекционного материала капусты 33
2.3. Изучение методов защиты капусты от сосудистого бактериоза 37
2.4. Выделение ДНК и ПЦР анализ 40
ГЛАВА 3. Расовый состав возбудителя и устойчивость сортообразцов капусты к сосудистому бактериозу 43
3.1. Расовый состав популяции патогена 43
3.2. Оценка устойчивости различных гибридов капусты к сосудистому бактериозу 48
3.3. Проявление симптомов сосудистого бактериоза у капустных растений с различными генами устойчивости в зависимости от концентрации инокулюма X. campestris pv. campestris 57
ГЛАВА 4. Оценка эффективности средств защиты капусты от сосудистого бактериоза 66
4.1. Оценка эффективности биопрепаратов на основе бактерий-антагонистов и антибиотиков 66
4.2. Антибактериальная активность эфирных масел и их использование для обеззараживания семян капусты от сосудистого бактериоза 75
4.3. Выделение и испытание эффективности бактериофагов против сосудистого бактериоза 85
ГЛАВА 5. Оценка генетического разнообразия штаммов xanthomonas campestris и молекулярно-генетических маркеров патовариантов этого вида 95
5.1. Оценка диагностических маркеров для патовариантов вида Xanthomonas campestris 95
5.2. Генетическое разнообразие возбудителя сосудистого бактериоза в России в 2006 – 2012 гг 100
5.3. Мультилокусный анализ последовательностей ДНК штаммов X. campestris 103
Заключение 116
Список литературы 120
- Систематическое положение возбудителя
- Идентификация рас патогена и оценка устойчивости к сосудистому бактериозу селекционного материала капусты
- Оценка устойчивости различных гибридов капусты к сосудистому бактериозу
- Антибактериальная активность эфирных масел и их использование для обеззараживания семян капусты от сосудистого бактериоза
Систематическое положение возбудителя
Поражение капустных растений проявляется на всех стадиях выращивания культуры: на всходах, рассаде, растущих в поле растениях первого года и семенниках (Джалилов, 1996). Симптомы сосудистого бактериоза варьируют в зависимости от сорта, вида и рода хозяина, его возраста и условий окружающей среды. Поражаются в основном надземные органы, хотя наблюдается и поражение корнеплодов у редиса и репы (Lambe, Lacy, 1982; Sherf, Macnab, 1986; Roberts et al., 1987), а у растений рапса поражаются корни, приводя к корневой гнили (Иванюк, Сильванович, 1990).
Зараженные семена, как правило, не проявляют каких-либо признаков инфекции, но затем на всходах появляется обесцвечивание, затем точечный некроз семядольных листьев, потом они чернеют и увядают (Matsumoto, 1975; Shiomi, 1991). Сильно пораженные семена рапса и горчицы могут выглядеть сморщенными и бесцветными (Sharma et al., 1992). Проникновение патогена в растение может происходить через механические повреждения, устьица и гидатоды.
На листьях появляются по краям хлоротичные пятна, которые затем принимают V-образную форму. У пораженного растения сосуды становятся темными – от коричневого до черного цвета (Goto, 1992). При системном поражении наблюдаются увядание и опадение пораженных листьев (Matsumoto, 1975). К начальным симптомам можно отнести появление сетки потемневших сосудов (Schaad, Thaveechai, 1983).В некоторых случаях на листьях появляются округлые некротические пятна. Иногда увядание и некротизация сосудов ксилемы не приводит к пожелтению листьев. При высокой температуре симптомы у пораженных растений белокочанной и цветной капусты могут быть сходными с симптомами слизистого бактериоза (Ignatov et al., 1992). В связи с повышением вирулентности патогена X. c. pv. сampestris, в последний годы отмечают новые виды симптомов, такие как появление на листьях темно-зеленых водянистых пятен, с последующим их хлорозом и опадением (Tatjana et al., 2013).
Многими исследователями отмечается, что ряд штаммов Хсс вызывают нетипичные для сосудистого бактериоза симптомы. Mguni с соавторами (1996), выделили три биологических типа штаммов (Хсс, XccA и XccB) из капустных, культивируемых в Зимбабве. Штаммы типа XccA вызывали гниль растения, типа XccB вызывали увядание и гниль стебля, а штаммами группы Хсс формировались типичные «V»-образные симптомы.
Системное поражение растений развивается в результате размножения бактерий в проводящей ткани. После заражения через гидатоды, бактерии передвигаются из межклеточного пространства паренхимы в сосуды ксилемы и затем распространяются по черешку, стеблю и корню. Размножение бактерий приводит к нарушению нормального развития растений. При раннем заражении больные растения не формируют кочан, что приводит к значительным потерям урожая.
В поле симптомы системного поражения сосудистым бактериозом сходно с фузариозным увяданием, вызываемым грибом Fusarium oxysporum. Для точной диагностики этих болезней необходимо разрезать кочерыгу в поперечном направлении. При этом в случае сосудистого бактериоза сосуды будут иметь черную окраску, а не буро-коричневую как при фузариозе (Защита овощных культур и картофеля от болезней, 2006). Сосудистый бактериоз с некрозом сосудов принято считать типичным проявлением болезни. В местах механических повреждений при повышенной относительной влажности воздуха появляется экссудат. Он содержит клетки возбудителя и представляет маленькие капли желтой маслянистой жидкости.
На капусте могут встречаться и другие виды и патовары Xanthomonas. Эти виды не встречаются в сосудах капусты, а поражают паренхиму листьев, вызывая небольшие темно-серые некрозы. К ним относятся возбудители листовой пятнистости капусты X. campestris pv. raphani и X. campestris pv. armoraciae. Патовары X. campestris pv. armoraciae и X. campestris pv. raphani наиболее близки к возбудителю сосудистого бактериоза капусты по ряду свойств (McCuloch, 1929; Vaulerin et al., 1990; White, 1930; Alvarez et al., 1994; Ignatov et al., 1998а). Различия между ними заключаются, главным образом, в симптомах и набору поражаемых растений-хозяев. Патовар X. campestris pv. armoraciae вызывает симптомы на капустах, хрене, турнепсе и других растениях семейства Капустные. Патовар X. campestris pv. raphani вызывает симптомы на редисе, турнепсе, горчице, томате, табаке и перце, но не встречается на хрене (White, 1930). В отличие от X. campestris pv. campestris, X. campestris pv. armoraciae не вызывает системного поражения типичного для сосудистого бактериоза (Vauterin et al., 1990).
Первые симптомы заболевания обычно обусловлены посевом инфицированных семян (Hunter et al., 1975; Randhawa, Schaad, 1984; Schaad, White, 1974; Kohl, Wolf, 2005). При прорастании зараженного семени возбудитель проникает в мезофилл листа и сосудистую систему эпикотиля, а в дальнейшем – в гидатоды. Развитие заболевания при температуре +15…+20С может носить латентный характер. Повышение температуры до 25-30С может приводить к переходу от латентного состояния к проявлению симптомов (Kohl, Wolf, 2005).
При температуре свыше 30 С симптомы могут проявляться в виде больших пятен в средней части листьев, а при 15 С – 17 С наблюдается только некроз листьев. При этом не было никаких видимых внешних изменений на инфицированных черешках и стеблях. Хотя, на их продольном разрезе из некротизированных сосудов были изолированы на питательную среду желтые, мукоидные колонии (Dragana, Jelica, 2012).
Распространение патогена может происходить каплями воды, дождя, аэрозолями, сельскохозяйственными машинами и людьми (Vicente, 2012). В рассадном отделении патоген особенно сильно распространяется при использовании верхнего полива – дождевания (Shidaki et al., 2000). Изменение способа полива может снижать распространение патогена (Roberts et al., 2007). Эпифитотия заболевания в Белоруссии была связана с сочетанием температурой в поле +22…+28 С с частыми дождями и повышенной влажностью (Сильванович, 1989). Показано, что массовое развитие заболевания наблюдалось в годы с большим числом дождливых дней и высокой инфекционной нагрузкой (Kocks et al., 1999).
Идентификация рас патогена и оценка устойчивости к сосудистому бактериозу селекционного материала капусты
Наиболее радикальный путь борьбы с сосудистым бактериозом – выращивание устойчивых сортов и гибридов. Рядом селекционных фирм предлагаются на рынке устойчивые к заболеванию гибриды капусты. Однако при этом отсутствуют сведения о типе устойчивости (расово-специфическая либо полевая), а в случае расоспецифической устойчивости, неизвестно к каким расам она эффективна.
Нами была проведена оценка устойчивости ряда коммерческих F1 гибридов белокочанной капусты зарубежной селекции. Характеристика этих гибридов приведена в главе 2, пункт 2.2.. Стандартом восприимчивости служил сорт цветной капусты Гарантия.
Результаты искусственного заражения этих сортообразцов 66 изолятами X. campestris pv. campestris представлены в приложении 2.
Растения гибрида белокочанной капусты Зенон были восприимчивы ко всем испытанным штаммам патогена, так же как стандарта восприимчивости – сорта цветной капусты Гарантия (Рисунок 3.2.1). В связи с этим гибрид Зенон был исключен из программы дальнейших исследований. Относительно высокий уровень расоспецифической устойчивости показали F1 гибриды Браксан (восприимчивость к 67% штаммов), Бронко и Синтекс (восприимчивость к 71% штаммов), Таурус (восприимчивость к 73% штаммов), Тайфун и Агрессор (восприимчивость к 74% штаммов) (Приложение 2).
Как было ранее отмечено, все «устойчивые» гибриды поражались 24 штаммами, выделенными в 2012 г. Еще 7 штаммов не поражали по одному гибриду – т.е. несли единственный возможнй ген авирулентности. Только 2 штамма (Lix16, Dasch-8) были авирулентны ко всем испытанным гибридам (8 возможных генов Рисунок 3.2.1. Листья F1 гибрида Синтекс – справа и F1 Зенон - слева, зараженные сосудистым бактериозом уколом в жилку авирулентности), и еще два штамма (Тlo-1, Dasch-9) – ко всем, кроме одного гибрида (7 возможных генов авирулентности). Остальные штаммы несли от 1 до 6 возможных генов авирулентности. Полученные данные не позволили уменьшить число вероятных генов устойчивости в гибридах капусты, т.е. показано существование 8 уникальных специфичных реакций растений для каждого гибрида, которые возможно, определяются разными генами или сочетаниями нескольких генов (Таблица 3.2.1). Полученные реакции растений гибридов капусты и штаммов никак не коррелировали с расами патогена, выявленными при заражении сортов – дифференциаторов (раздел 3.1.), кроме того факта, что почти все штаммы 6-й расы были вирулентными для всех испытываемых гибридов. Интересные результаты наблюдаются если сгруппировать реакцию изучаемых гибридов капусты на инокуляцию штаммами, выделенными до 2012 г. и после 2012 г. (Таблица 3.2.2 ) Таблица 3.2.1. Схема возможных ген-на-ген отношений для гибридов белокочанной капусты и штаммов Xanthomonas campestris.
Как следует из таблицы гибриды Циркон и Таурус показывали высокую устойчивость к штаммам, выделенным до 2012 г., но полностью поражались штаммами, выделенными в 2012 г. Можно предположить, что в этот период произошли изменения в популяции возбудителя, которые привели к усилению вирулентности. Вместе с тем следует отметить, что растения гибридов различно заражались штаммами, принадлежащими согласно реакции сортов дифференциаторов к одной расе. Т.е. другими словами у всех гибридов имелись гены устойчивости, которые дифференцировали расы по признаку вирулентности. Это, по нашему мнению, свидетельствует о несовершенстве существующей системы растений-дифференциаторов.
Для оценки относительной (нерасоспецифической) устойчивости растения гибридов капусты инокулировали совместимыми расами. Т.е. для инокуляции были выбраны штаммы Ram 1-1 и 276 NZ, вирулентные ко всем испытываемым сортообразцам. В качестве стандарта восприимчивости был выбран раннеспелый F1 гибрид Экспресс белокочанной капусты. Методика искусственного заражения с целью оценки относительной устойчивости этих гибридов описана в разделе 2.2. Результаты учета развития сосудистого бактериоза на 9 гибридах капусты после инокуляции четырьмя различными методами с различными путями проникновения патогена в растение представлены в таблице 3.2.3.
При инокуляции через гидатоды высокую устойчивость показали гибриды Браксан, Бронко и Синтекс. Эти же гибриды показали высокую устойчивость при проникновении через травмированные корни. При заражении через корни восприимчивыми были гибриды Экспресс и Тайфун (Рисунок 3.2.2). Выделились очень высокой стеблевой устойчивостью и устойчивостью при инокуляции травмированных жилок гибриды Браксан и Синтекс.
Таким образом, при всех методах оценки устойчивости в группу высокоустойчивых попали гибриды Браксан и Синтекс. Представляло интерес выявить степень связи между оценками устойчивости гибридов капусты полученными при использовании различных путей проникновения возбудителя в растения.
Статистический анализ показал тесную прямую корреляционную связь между оценками при инокуляции через корни и через стебель (Таблица 3.2.4). Коэффициент корреляции при этом составлял 0,82 при ошибке коэффициента корреляции 0,13. Вероятно, при этих методах инокуляции оцениваются сходные механизмы устойчивости.
Между остальными методами оценки устойчивости наблюдали среднюю степень связи. В работе Ф.С. Джалилова с соавторами (Джалилов и др., 1995) было показано, что корреляция оценки устойчивости в полевых условиях и при инокуляции гидатод была выше по сравнению со степенью связи полевой оценки с оценкой при инокуляции травмированных жилок. При этом следует иметь в виду, что проникновение через гидатоды в основном имеет место в годы с высокой влажностью воздуха, в то время как проникновение через травмы имеет место при массовом развитии в поле вредителей-фитофагов и наличии других повреждающих факторов (механическая обработка междурядий, ожоги при некорневом внесении удобрений и т.п.).
Для более подробного изучения связей между разными методами инокуляции был проведен факторный анализ полученных результатов, после их нормализации относительно средних величин для каждого метода инокуляции (Таблица 3.2.5, Рисунок 3.2.3).
Фактор 1 достоверно связан с реакцией растений на заражение через гидатоды – положительная связь. Есть достоверная отрицательная связь между Фактором 1 и реакцией при заражении через корень (для двух штаммов) и стебель (достоверно для штамма 276NZ). Нагрузка фактора 1 на реакцию растений при инокуляции жилки листа не достоверная. Фактор 1 показал штаммовую специфичность реакции растений при заражении через стебель.
Фактор 2 имеет отрицательную корреляцию с реакцией растений при заражении через гидатоды (невысокую для штамма Ram 1-1 и достоверную для 276 NZ), и положительную связь с реакцией растений при инокуляции через корень (невысокую для штамма 276 NZ и достоверную для Ram 1-1). Наибольшая корреляция для фактора 2 получена для инокуляции стебля (отрицательная связь). Фактор 2 также положительно коррелировал с реакцией растений при инокуляции жилки листа. Фактор 2 показал наибольшую отзывчивость на штамм для реакции растений при заражении гидатод и корня.
Оценка устойчивости различных гибридов капусты к сосудистому бактериозу
Как было показано в обзоре литературы, ни одно из рекомендованных в настоящее время средств не обеспечивает полного обеззараживания партий семян с высокой зараженностью возбудителем сосудистого бактериоза. Поэтому поиск таких препаратов продолжает оставаться актуальной задачей.
В настоящее время эфирные масла многих растений находят применение в медицине и пищевой промышленности ввиду наличия у многих из них антигрибной, антибактериальной и антивирусной активности (Маланкина, 2007; Петрушина, 2012; Nevas et al., 2004). Есть сведения об их перспективности для защиты растений от бактериальных инфекций (Nguefack et al., 2005; Pradhanang et al., 2003).
Цель нашей работы заключалась в поиске эфирных масел, способных эффективно подавлять зараженность семян сосудистым бактериозом. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: - скрининг в условиях in vitro антибактериальной активности эфирных масел различных растений по отношению к X. campestris pv. campestris; - оценка биологической эффективности эфирных масел, показавших наибольшую бактерицидную активность in vitro, в борьбе с семенной инфекцией.
В работе использовали штамм Хсс 276 NZ из коллекции лаборатории защиты растений, который относится к первой расе по классификации Kamoun с соавторами (Kamoun et al., 1992). Штамм был проверен на вирулентность инокуляцией восприимчивого F1 гибрида белокочанной капусты Экспресс уколом в жилку листа препаровальной иглой, предварительно смоченной в суспензии бактериальных клеток с концентрацией 108 колониеобразующих единиц в миллилитре (КОЕ/мл). Для тестирования использовали эфирные масла 31 вида растений производства ООО «Сириус» (Белгородская обл.), ООО «ТОССА» (Москва) и «Стикс натуркосметик» (Австрия).
Первичный скрининг эфирных масел на антибактериальную активность проводили методом дисков. Поверхность среды Кинг Б (Schaad, Jones, Chun, 2001) в чашке Петри диаметром 90 мм засевали 200 мкл суспензии клеток Xcc и после 15-минутного подсушивания в центр помещали стерильный диск фильтровальной бумаги диаметром 6 мм, на который наносили 6 мкл эфирного масла. Через 2 суток культивирования при +28 С измеряли диаметр стерильной зоны (в мм) с учетом диаметра диска.
Для более детальной оценки антибактериальных свойств масел, в опытах с которыми диаметр стерильной зоны был более 6 мм, определяли минимальную ингибирующую концентрацию (MIC).
Для получения стабильной эмульсии испытали Диметилсульфоксид (ДМСО), Tween 20, Tween 80, 0,15 % агар. В пробирке разводили масло в соотношении 1:1 в 2 % DMSO, 5 % DMSO, 10 % DMSO, 0,5 % Tween 20, 0,5 % Tween 80 и 0,15 %-ном агаре и перемешиваали на вортексе до получения однородной смеси. Выдерживали эти смеси в течение 2 часов, визуально оценивая стабильность суспензии. Для дальнейших тестов был выбран 0,15 %-й агар.
Для определения МIC в лунку стерильной 96-луночной плоскодонной микропланшеты для культуры клеток (Corning, USA) вносили 40 мкл 5 % эфирного масла в 0,15 %-м агаре и проводили серийные разведения в других лунках в соотношении 1:1 в 0,15 %-м агаре. Удаляли 20 мкл смеси из последней лунки для сохранения постоянного объема (20 мкл). Затем в лунки добавляли по 150 мкл суспензии клеток Xcc (107 клеток/мл) в жидкой среде Кинг Б, 10 мкл 0,1 %-ого резазурина, и доводили до 200 мкл 0,15 %-ным агаром. Содержимое лунок тщательно перемешали с помощью микропипетки. Имелось три контроля: без масла, без резазурина и без культуры бактерий. Планшет инкубировали при 26 С. Через 24 и 48 часов проводили учет изменения окраски в лунках. В лунках, где имело место размножение бактерий, синий цвет резазурина переходил к розовато-лиловой и потом к розовой окраске (Marina et al., 2010).
Показавшие наивысшую антибактериальную активность в условиях in vitro эфирные масла были отобраны для обработки зараженных сосудистым бактериозом семян. Эмульсии масел в воде в концентрациях 0,9 %, 0,45 % и 0,15 % были приготовлены обработкой ультразвуком на приборе Sartorius Labsonic M при экспозиции 20 секунд и амплитуде 70 %.
Инокуляцию семян возбудителем сосудистого бактериоза проводили в условиях вакуума, как было описано ранее (Мазурин, 2009). Затем семена подсушивали при комнатной температуре 24 часа и замачивали в эмульсиях эфирных масел на 30 минут. В положительном контроле зараженные семена замачивали в воде, а отрицательным контролем служили здоровые семена, замоченные в воде. После обработки и подсушивания на фильтровальной бумаге из семян экстрагировали возбудителя. Для этого семена по 250 штук помещали в конические колбы на 50 мл и заливали 2,5 мл стерильного физраствора (0,85 % NaCl) с добавлением твина-20 (20 мкл/10 мл) и встряхивали на орбитальном шейкере 2,5 часа при 250 об/мин. Переносили 100 мкл экстракта в пробирку с 900 мкл стерильного физраствора. Далее проводили серийные десятикратные разведения в стерильном физрастворе. Проводили посев 100 мкл суспензии из каждой пробирки на селективную среду с крахмалом (Schaad, Sitterly, Humaydan, 1980). Подсчет гидролизующих крахмал колоний проводили через двое суток. В сомнительных случаях использовали раствор Люголя. Рассчитывали количество колониеобразующих единиц бактерий в исходном экстракте (КОЕ/мл).
Для оценки биологической эффективности обработки эфирными маслами семена высевали в торфяной субстрат в 49-и ячеечные рассадные кассеты. Температура в период эксперимента в теплице составляла 20-26 С. Проводили учет лабораторной и оранжерейной всхожести семян, а также зараженности рассады сосудистым бактериозом. Опыт проводили в двух повторностях по 49 растений в каждой. В качестве эталона использовали рекомендованный для предпосевной обработки от сосудистого бактериоза Фитолавин, ВРК, 0,2
Выявлено, что стабильность эмульсии масел при добавлении ДМСО не превышала 5 минут, а при использовании Tween 20 и Tween 80 стабильность эмульсии сохранялась значительно дольше, но размеры стерильной зоны были существенно меньше, чем при использовании 0,15%-ого агара. На основании этого при приготовлении эмульсии для дальнейших испытаний антибиотической активности эфирных масел использовали в качестве стабилизатора 0,15 %-ный агар.
Из всех испытанных эфирных масел при тестировании методом дисков лишь масло сантала белого и табака обыкновенного не дали стерильной зоны (она была равна 6мм, т.е. диаметру самого диска). У остальных масел размер стерильной зоны варьировал от 10,2 мм у шалфея лекарственного до 52,4 мм у чабера садового (Таблица 4.2.1 и Рисунок 4.2.1).
Антибактериальная активность эфирных масел и их использование для обеззараживания семян капусты от сосудистого бактериоза
Появление в 2012 новой доминирующей генетической группы бактерии, возможно, указывает на наличие адаптации бактерий рода Xanthomonas к новому кругу растений-хозяев или условиям существования.
Таким образом, установлено, что на рубеже 2012 г. произошла смена генетического состава популяции возбудителя сосудистого бактериоза капустных.
По результатам молекулярно-генетического исследования коллекции штаммов возбудителя сосудистого бактериоза и других патоваров X. campestris можно заключить, что ПЦР анализ со специфичными праймерами показал применимость праймеров на мишени Xcc007onB, wxcO, cytl86 (cytP450) в качестве видоспецифичных маркеров. Для дифференциации эпидемических (эпифитотийных) штаммов возбудителя сосудистого бактериоза, выделенных в 2012 г. и штаммов, вызывающих листовые пятнистости капустных возможно использование патовар-специфичных праймеров Хсс 2f/2r и Xcr14f/14r (предложенных Leu et al., 2010).
ПЦР фингерпринтинг со случайными и консервативными праймерами показал разделение штаммов на группы, (2012 г. и до 2012), но кластеры выделялись с низким бутстрепом.
MLST анализ фрагментов генов gyrB, rpoD, суіІЗЗ, и avrXccC показал четкие межвидовые различия штаммов X. campestris. Анализ последовательностей генов gyrB, cytl33 и avrXccC не позволил выделить группу штаммов 2012 года выделения и родственных им по другим признакам штаммов с бутстрепом более
При анализе последовательностей гена rpoD, штаммы, выделенные в 2012 г., были сгруппированы с фрагментами гена штаммов ICMP6541, B100, FB1403, NZ276, NZ277 с достоверным бутстрепом. Внутригрупповое генетическое расстояние в данной группе штаммов было почти вдвое ниже, чем в группе штаммов, выделенных до 2012 г. а расстояние между этими группами было почти равно среднему межвидовому расстоянию для рода. При BLAST анализе последовательностей гена rpoD было обнаружено то, что все штаммы X. campestris, выделенные в 2012 г. и ряд родственных им имеют аллели гена наиболее близкие к штаммам вида (X. arbiricola), что позволяет использовать последовательности гена rpoD для разработки маркера для эпифитотийной группы штаммов 2012 г.
В последовательности генов avrXccC штаммов Tir1, Tir2, DK1, DK2, B2, Ram 2-3, Ram 2-2 была обнаружена инверсия фрагмента гена в районе 517-840 п.о. в координатах гена типового штамма Xcc ATCC 33913. Инвертированная часть отличалась значительной изменчивостью по сравнению с остальной частью гена, что предполагает сохранение экспрессии гена, несмотря на его мутацию.
Можно предположить, что появление в 2012 новой доминирующей генетической группы бактерии, указывает на наличие адаптации бактерий рода Xanthomonas к новому кругу растений-хозяев или условиям существования.
Биологические особенности X. campestris pv. campestris обусловливают необходимость комплексного подхода к защите капустных культур от сосудистого бактериоза. Размещение гибридов капусты с расово-специфической устойчивостью предполагает знание преобладающих в регионах рас возбудителя. В нашем исследовании при анализе 86 изолятов различного географического происхождения было показано, что возбудитель представлен расами 1, 3, 4 и 6. Эти сведения также важны при создании искусственного инфекционного фона при селекции на устойчивость. Полигенная устойчивость включает различные механизмы, выявляемые методами инокуляции, использующими разные пути проникновения возбудителя в растение. Нами, при факторном анализе полученных данных, показано наличие как минимум 2 факторов устойчивости, при сочетании которых в одном генотипе растения возможен эффект трансгрессии. Особое значение в защите капусты от заболевания имеет использование биологических препаратов. В работе на основе многочисленных вегетационных экспериментов дана сравнительная оценка биологической эффективности многих рекомендованных и перспективных биопрепаратов. Большим резервом средств защиты растений являются эфирные масла растений. Удалось выявить некоторые эфирные масла, не уступающие по эффективности рекомендованным средствам защиты растений. Эти вещества, вероятно, займут свое место в безпестицидных технологиях, однако для этого необходимо решить некоторые технологические вопросы, в первую очередь создание препаративных форм, обеспечивающих стабильные эмульсии этих веществ. Нами выделены изоляты бактериофагов, способные подавлять семенную инфекцию возбудителя сосудистого бактериоза. Однако с учетом специфичности этих фагов в отношении штаммов бактерии-хозяина, работа в этом направлении должна быть продолжена для создания «коктейлей» фагов, эффективных против всех штаммов патогена. Предложенные нами подходы к различению патовара campestris от других патоваров X. campestris, которые могут встречаться на капусте, молекулярно-генетическими методами будут способствовать повышению достоверности тестирования зараженности семян.
Проведенная экспериментальная работа позволила сделать следующие выводы: 1. Изучение вирулентных свойств коллекции изолятов патогена показало, что они представлены расами 1, 3, 4 и 6. Не выявлено рас 2 и 5. Штаммы, выделенные в 2006-2007 гг. были более изменчивы по признаку вирулентности по сравнению со штаммами, выделенными в 2012 г. 2. Среди испытанных гибридов капусты относительно высокий уровень расоспецифической устойчивости показали F1 гибриды Браксан, Бронко и Синтекс. 3. Растения гибридов Тайфун, Агрессор, Таурус и Синтекс различно заражались штаммами, принадлежащими согласно реакции дифференциаторов к расе 3. Растения гибрида Церокс отличались по реакции на инокуляцию изолятами расы 6. Это свидетельствует о несовершенстве существующего набора растений-дифференциаторов. 4. При использовании различных методов оценки нерасоспецифической устойчивости в группу высокоустойчивых попали F1 гибриды Браксан и Синтекс. Установлена тесная прямая связь между оценками при инокуляции через корни и через стебель (r=0,82). Не было обнаружено статистически значимой связи между оценками устойчивости, полученными при инокуляции через гидатоды и корни, а также между заражением через гидатоды и травмированные жилки.