Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Особенности helicobacter pylori и факторы, влияющие на эффективность эрадикационной терапии (обзор литературы) 10
Глава 2. Материалы и методы исследования 25
2.1. Объект исследования 25
2.2. Общая характеристика обследованных детей 29
2.3. Методы исследования 34
2.3.1 Клинико-лабораторные методы исследования 34
2.3.2. Методы диагностики H.pylori 35
2.3.3. Генотипирование H.pylori 42
2.3.4. Иммуноферментный метод определения уровней цитокинов 43
2.3.5. Определение чувствительности H.pylori к антибактериальным препаратам 43
2.3.6. Определение полиморфизма гена цитохрома Р450 2С19 45
2.3.7. Методы статистической обработки данных 47
Глава 3. Особенности макроорганизма и характеристика helicobacter pylori у детей с гастродуоденальной патологией 49
3.1. Клиническая характеристика исследуемых групп детей 49
3.2. Характеристика эндоскопических и морфологических изменений слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки у детей с хронической гастродуоденальной патологией 53
3.3. Результаты определения Helicobacter pylori у детей с гастродуоденальной патологией 60
3.4. Факторы вирулентности Helicobacter pylori 65
3.5. Изучение цитокинового статуса у детей с гастродуоденальной патологией 70
3.6. Резистентность Helicobacter pylori к антибактериальным препаратам 74
3.7. Полиморфизм гена цитохрома Р450 2C19 79
Глава 4. Эрадикационная терапия у детей и факторы, влияющие на ее эффективность 81
4.1. Оценка эффективности схем эрадикационной терапии Helicobacter pylori 81
4.2. Влияние полиморфизма гена CYP2C19 на эффективность эрадикационной терапии 87
Глава 5. Модель прогнозирования исхода эрадикационной терапии у детей 92
Глава 6. Обсуждение полученных результатов 98
Выводы 114
Практические рекомендации 115
Список сокращений 116
Список литературы 117
Список иллюстративного материала
- Методы исследования
- Определение чувствительности H.pylori к антибактериальным препаратам
- Результаты определения Helicobacter pylori у детей с гастродуоденальной патологией
- Влияние полиморфизма гена CYP2C19 на эффективность эрадикационной терапии
Введение к работе
Актуальность изучения H.pylori-ассоциированных заболеваний обусловлена высоким уровнем распространенности H.pylori – 4,5 миллиарда человек по всему миру инфицированы бактерией H.pylori (Hooi J.K.Y., 2017), а также доказанной связью с развитием таких заболеваний, как язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, MALT-лимфома и некардиальный рак желудка (International Agency for Research on Cancer, 1994; Helicobacter and Cancer Collaborative Group, 2001; Malfertheiner P. et al., 2017).
Инфицирование Н.pylori происходит в раннем детском возрасте (Sherman P.M., 2004; Chey W.D. et al., 2017) и может сохраняться в течение всей жизни, приводя к хроническому воспалению слизистой оболочки желудка, а впоследствии к развитию предраковых изменений слизистой оболочки – атрофии, кишечной метаплазии и дисплазии (Янкин А.В., 2010; Соломенцева Т.А., 2013; Correa P., 1996; Uemura N. et al., 2001; Malfertheiner P. et al., 2017).
Своевременно проведенная эрадикационная терапия инфекции H.pylori приводит к существенному снижению риска развития некардиального рака желудка, рецидивирования язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, язвенных кровотечений (De Martel C., 2013; Malfertheiner P. et al., 2017).
Несмотря на наличие разработанных международных и российских
рекомендаций по диагностике и лечению H.pylori-ассоциированных заболеваний
(Ивашкин В.Т. и соавт., 2016; Лазебник Л.Б. и соавт., 2017; Koletzko S. et al., 2011;
Malfertheiner P. et al., 2017; Chey W.D. et al., 2017), частота эффективной эрадикации в
клинической практике, в том числе и у детей, часто не достигает минимального
рекомендованного уровня 85-89% (Graham D.Y., 2014). Существенный вклад в
снижение эффективности эрадикационной терапии вносят резистентность
микроорганизма к антибактериальным препаратам (Gisbert J.P. et al., 2006; Li Y. et al., 2010; Fischbach L., 2010; Molina-Infante J. et al. 2012; Megraud F. et al., 2013; Gatta L. et al., 2013; Camargo M.C. et al., 2014), а также, возможно, генетические характеристики H.pylori и особенности организма человека, обусловленные полиморфизмом гена
2С19 цитохрома Р450 и определяющие различную скорость метаболизма ингибиторов протонной помпы (Маев И.В. и соавт., 2016; Uotani T. et al., 2015).
Согласно существующим рекомендациям, лечение должно осуществляться с учетом регионального уровня чувствительности H.pylori к антибактериальным препаратам. Наибольшее внимание при выборе схемы лечения рекомендуется уделять уровню резистентности H.pylori к кларитромицину (Malfertheiner P. et al., 2017).
В случае неуспешной эрадикационной терапии повышается вероятность
формирования резистентных к антибактериальным препаратам штаммов как H.pylori,
так и представителей кишечной микробиоты. Особенностью лечения
H.pylori-ассоциированных заболеваний у детей является более высокая скорость развития резистентности H.pylori к антибактериальным препаратам (Щербаков А.П. и соавт., 2011). Последнее подтверждает необходимость персонифицированного подхода к диагностике и лечению H.pylori-ассоциированных заболеваний гастродуоденальной зоны у детей с учетом определения чувствительности H.pylori к антибактериальным препаратам, генетических характеристик микроорганизма и организма человека, способных оказывать влияние на эффективность терапии.
Цель исследования
Оптимизация диагностики и лечения H.pylori-ассоциированной
гастродуоденальной патологии у детей на основании изучения полиморфизма гена 2С19 цитохрома Р450 и резистентности H.pylori к антибактериальным препаратам.
Задачи:
-
Провести сравнительную оценку методов диагностики H.pylori у детей с гастродуоденальной патологией.
-
Изучить генетические характеристики H.pylori и взаимосвязь его генотипов с заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки у детей.
-
Выявить особенности цитокинового статуса у детей с H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией.
-
Оценить уровень резистентности H.pylori к антибактериальным препаратам (кларитромицину, амоксициллину, метронидазолу, фуразолидону, левофлоксацину, тетрациклину).
-
Определить распределение частот генотипов и аллелей гена CYP2C19 у детей с H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией и оценить его влияние на эффективность эрадикационной терапии.
6. Разработать модель прогнозирования исхода эрадикационной терапии с учетом факторов, влияющих на эффективность эрадикации H.pylori.
Научная новизна исследования
Впервые получены результаты распространенности мутаций в гене 23S РНК, определяющих формирование резистентности H.pylori к кларитромицину, у детей с H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией в г. Казани.
Определен уровень чувствительности H.pylori к антибактериальным
препаратам (кларитромицину, амоксициллину, метронидазолу, фуразолидону,
левофлоксацину, тетрациклину) диско-диффузионным методом у детей
с хроническими гастродуоденальными заболеваниями.
Впервые у детей с H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией в г. Казани получены результаты по частоте встречаемости генотипов и аллелей гена CYP2C19. Получены новые данные о статистически значимо более высоком уровне цитокина MIF (фактора, ингибирующего миграцию макрофагов), ответственного за «переключение» хронического воспаления на канцерогенез, у детей с хронической гастродуоденальной патологией по сравнению с группой контроля H.pylori-негативных лиц, не имеющих заболеваний гастродуоденальной зоны.
Показано, что у детей с H.pylori-ассоциированной патологией чаще
встречаются штаммы, определяющие низкую вирулентность H.pylori:
cagA-негативные и штаммы с генотипом vacAs2m2.
Впервые разработана модель прогнозирования исхода эрадикационной терапии у детей с учетом резистентности H.pylori к антибактериальным препаратам; определен вклад наиболее значимых факторов в формирование исхода эрадикационной терапии.
Теоретическая и практическая значимость
Получены данные о распределении частот аллелей и генотипов по полиморфизму гена CYP450 2C19, ответственного за метаболизм ингибиторов протонной помпы и отсутствии его значимого влияния на эффективность эрадикационной терапии, а также об уровне резистентности H.pylori к антибактериальным препаратам среди детей с H.pylori-ассоциированной патологией в г.Казани.
На основании результатов определения чувствительности H.pylori к
антибактериальным препаратам предложен алгоритм ведения детей с H.pylori-
ассоциированными гастродуоденальными заболеваниями. Построена
прогностическая модель, учитывающая факторы, в наибольшей степени
определяющие эффективность эрадикации H.pylori (пол, отягощенная
наследственность по раку желудка и язвенной болезни, прием антибактериальных
препаратов в анамнезе, резистентность к антибактериальным препаратам) и позволяющая определить исход эрадикационной терапии. Внедрение предложенных алгоритма и прогностической модели в клиническую практику врачей-педиатров позволит осуществлять персонифицированный подход к ведению детей с Я.^у/оп-ассоциированной патологией.
Основные положения, выносимые на защиту:
Подавляющее большинство детей с Я.^у/оп-ассоциированной гастродуоденальной патологией имеет НоmЕМ генотип CYP2C19 и относятся к быстрым метаболайзерам ингибиторов протонной помпы.
Выбор схемы эрадикационной терапии первой линии необходимо осуществлять с учетом индивидуальной чувствительности H.pylori к антибактериальным препаратам.
Для детей с хронической гастродуоденальной патологией в г. Казани характерно инфицирование низкопатогенными штаммами H.pylori.
Степень достоверности и апробация результатов работы
Достоверность полученных данных обеспечивается достаточным объемом выборки, а также использованием современных методов статистической обработки. Основные результаты диссертационной работы были представлены: на международном Евразийском конгрессе по хирургии и гастроэнтерологии (Баку, 2011); XVII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2012); 87-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2013); ХIII Съезде Научного общества гастроэнтерологов России (Санкт-Петербург, 2013); ХХ Международном Конгрессе детских гастроэнтерологов России и стран СНГ (Москва, 2013); XIХ межгородской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2013); ХХ Международном Конгрессе детских гастроэнтерологов России и стран СНГ (Москва, 2014); XIII Российском конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2014); XXVIII Международном семинаре «Helicobacter & Microbiota in Inflammation & Cancer» (Кипр, 2015); 89-ой Всероссийской научно-практической конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2015); V международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2015); XIX Конгрессе педиатров России с международным участием (Москва, 2016); 90-ой Всероссийской научно-практической конференция студентов и молодых ученых (Казань, 2016); 91-ой Всероссийской научно-практической
конференции студентов и молодых ученых (Казань, 2017); XXX Международном семинаре «Helicobacter & Microbiota in Inflammation & Cancer» (Бордо, 2017).
Публикации по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных журналах, рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ, 1 статья – в журнале, включенном в международную базу цитирования Scopus.
Внедрение результатов диссертационной работы в практику
Результаты исследования внедрены в практическую работу педиатрического отделения ГАУЗ «Клиника медицинского университета»; отделения эндоскопии, клинико-диагностической лаборатории №3 Медико-санитарной части ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»; учебный процесс кафедры пропедевтики детских болезней и факультетской педиатрии с курсом детских болезней лечебного факультета и кафедры госпитальной педиатрии с курсом поликлинической педиатрии ФГБОУ ВО Казанский ГМУ Минздрава России; кафедры фундаментальных основ клинической медицины ИФМиБ ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».
Личное участие автора
Содержащиеся в работе данные получены при личном участии автора на всех этапах работы: анализ литературы по исследуемой проблеме, составление дизайна исследования, постановка задач, выбор методов, оформление публикаций по результатам исследований. Генетические исследования (изучение полиморфизма гена CYP2C19, ПЦР диагностика H.pylori, определение мутаций в гене 23S РНК) полностью выполнены автором. Диссертантом сформулированы основные научные положения работы, выводы и практические рекомендации.
Объем и структура диссертации
Методы исследования
Ген vacA (vacuolating cytotoxin gene) кодирует образование вакуолизирующего цитотоксина VacA, вызывающего вакуольную дегенерацию эпителиоцитов слизистой оболочки желудка и их апоптоз 102, 186]. Данный ген присутствует в геноме всех штаммов H.рylori и имеет два региона: S (сигнальный) и m (срединный). S и m регионы включают 2 аллельных варианта: S1/S2 и m1/m2. Генотип vacAs1m1обладает высоким уровнем цитотоксической активности и связан с более тяжелыми заболеваниями (язвенной болезнью, раком желудка), тогда как генотип vacAs2m2 не обладает существенным цитотоксическим потенциалом [80, 89, 96, 141, 172, 173]. В мета-анализе, проведенном Sugimoto M. и Yamaoka Y. (2009) среди латиноамериканских и африканских популяций, было выявлено, что генотип vacAs1m1 повышает риск развития язвы и рака желудка [193].
Активация гена iceA (induced by contact with epithelium) происходит непосредственно при контакте H.рylori с эпителиоцитами. Различают две аллельные формы этого гена – iceA1 и iceA2. Известно, что iceA1 чаще ассоциируется с язвенной болезнью, iceA2 – с развитием гастрита [83, 129,189,197].
Мембранный протеин Bab A (blood group antigen-binding adhesin), ответственный за адгезию H.рylori к Lewis b антигенам группы крови человека на эпителиоцитах желудка [153], кодируется геном babA2. На сегодняшний день идентифицировано три аллеля гена bab: babA1, babA2 и babB, однако функционально значимым из них является только ген babA2. В европейских странах данный ген чаще встречается у пациентов с язвенной болезнью и раком желудка [97, 126, 153, 185]. В то же время в ряде азиатских стран (Тайвань, Япония) ни наличие генотипа babA, ни комбинация генотипов cagA/ vacAs1 не влияли на исход инфицирования бактерией H.pylori [98, 145].
Таким образом, в многочисленных исследованиях было выявлено, что генотип H.pylori ассоциирован с исходом заболевания [6, 32, 47, 83, 127, 143].
Наряду с генотипами Н.pylori в развитии гастродуоденальных заболеваний немаловажное значение могут иметь и другие факторы, в частности, состояние иммунной системы. Длительное персистирование H.pylori в организме человека приводит к мобилизации иммунной системы макроорганизма. Клеточный иммунный ответ на инфекцию H.pylori протекает с преобладанием Тh1 лимфоцитов и с увеличением продукции соответствующих цитокинов. Гуморальный иммунный ответ на H.pylori выявляется практически у всех инфицированных людей. В сыворотке крови определяются IgA и IgG антитела, против различных антигенов H.pylori.
При инфекции H.pylori наблюдается значительная инфильтрация слизистой оболочки желудка воспалительными клетками, которые являются источником цитокинов. Цитокины представляют собой низкомолекулярные белки с молекулярной массой 5-50 кДа, эндогенные биологически активные медиаторы, регулирующие межклеточные взаимодействия [79]. Эти регуляторные пептиды составляют начальное звено активации иммунного ответа и определяют эффективность и тип иммунного реагирования на инфекционные и неинфекционные агенты. Цитокины не обладают антигенной специфичностью, вырабатываются различными клетками организма в разных тканях в ответ на активирующий стимул. Биологические эффекты их опосредуются через высокоспецифичные мембранные рецепторы. У здоровых людей цитокины образуются в малом количестве, а при патологических состояниях количество их значительно возрастает. Синтез цитокинов начинается в ответ на повреждение тканей или проникновение инфекции [55, 79].
Продукция цитокинов является частью клеточного ответа, который связан с распознаванием структурных компонентов патогенов, так называемых патоген ассоциированных молекулярных паттернов [79]. К так называемым паттернам относятся структурные компоненты внешней мембраны грамотрицательных бактерий - липополисахариды (LPS), мембранные компоненты грамположительных бактерий, пептидогликаны, вирусные РНК, бактериальные ДНК. Лейкоциты экспрессируют соответствующие паттерн-распознающие рецепторы, которые называются Toll-подобными рецепторами (TLR, Toll-like receptors) [92,194]. После взаимодействия микроорганизмов или их компонентов с TLR запускается внутриклеточный каскад передачи сигнала, приводящий к усилению функциональной активности лейкоцитов и экспрессии генов цитокинов [85, 90]. Активация TLR приводит к синтезу провоспалительных цитокинов и IFN-/. Провоспалительные цитокины стимулируют дальнейшее развитие воспалительной реакции [54].
В настоящее время изучены более 100 разновидностей цитокинов, которых подразделяют на следующие группы: интерлейкины (IL - 1-25) - факторы взаимодействия между лейкоцитами; факторы некроза опухоли (TNF-, -); колониестимулирующие факторы (CSF) - гемопоэтические цитокины, вызывающие размножение и дифференцировку клеток-предшественников различных ростков гемопоэза на разных стадиях их созревания; хемокины -хемотаксические цитокины (СС, СХС (IL-8), СХ3С, С), обеспечивающие активацию миграции лейкоцитов различных типов, и некоторые другие группы [54, 79].
В последние годы активно дискутируется роль цитокинов из семейства интерлейкина-1 - это IL-la и IL-ip. IL-1 - многофункциональный цитокин, инициирует и регулирует воспалительные, иммунные процессы, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, стимулирует синтез простагландинов, белков острой фазы, цитокинов (TNF-, IL-2, IL-6), повышает проницаемость сосудистой стенки, гемопоэз, а также фагоцитоз. Основными клетками, продуцирующими IL-1 в организме, являются моноциты и макрофаги, а также клетки, имеющие с макрофагами общее происхождение [72]. По данным литературы, роль IL-1 в развитии воспалительных заболеваний пищеварительного тракта неоднозначна. С одной стороны, он может повредить слизистую оболочку желудка и двенадцатиперстной кишки, с другой стороны, снизить влияние других неблагоприятных факторов и принимать участие в репаративных процессах слизистой оболочки гастродуоденальной зоны, что является важной функцией, так как от качества восстановления слизистой оболочки зависит вероятность рецидива болезни [59, 183].
Определение чувствительности H.pylori к антибактериальным препаратам
Генотипирование штаммов Н.pylori было проведено на базе Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета (совместно с к.м.н. Давидюк Ю.Н.). Для анализа были использованы наборы реагентов «Хеликопол СА», «Хеликопол VA», «Хеликопол ВА», «Хеликопол IA» («Литех», Россия). Выделение ДНК Н.pylori проводили традиционным способом (см. раздел 2.3.2). Пять мкл анализирующего очищенного образца (супернатант) добавляли к амплификационной смеси. Для каждой смеси праймеров готовилась отдельная амплификационная смесь, состоящая из 14,3 мкл деионизированной воды, ПЦР— буфера (3 мкл), раствора дНТФ (3 мкл), MgCl2 (2,5 мкл), Taq-полимеразы (0,2 мкл). Во все пробирки, подготовленные для амплификации, добавляли 25 мкл амплификационной смеси и 25 мкл минерального масла. Пробирки центрифугировали в течение 3-5 секунд при 3000 оборотов в минуту при комнатной температуре (+18–25С). Затем пробирки переносили в амплификатор для амплификации.
Амплификацию для «Хеликопол ВА» проводили при 94С длительностью 1 минута (1 цикл), затем при 94С - 1 минута, при 55С - 1 минута, при 72С -1 минута - 35 циклов, затем при 72С - 5 минут (1 цикл).
Амплификацию для «Хеликопол СA, IA, VA» проводили при 94С 1 минута (1 цикл), затем при 94С - 1 минута, при 52С - 1 минута, при 72С 2 минуты - 35 циклов для «СA», «VA», для «IA» - 40 циклов, затем при 72С -5 минут (1 цикл) на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Детекцию продуктов амплификации проводили по вышеописанной методике (см. раздел 2.3.2).
Визуализацию результатов электрофореза проводили на стекле УФ-трансиллюминатора «ETS VilberLourmat» (Франция). Амплифицированные фрагменты имели следующие размеры: набор «Хеликопол СА»- 404 пары оснований, набор «Хеликопол-VA» - VacASl - 259 пары оснований, VacAS2 - 286 пары оснований, VacAml -290 пары оснований, VacAm2 - 352 пары оснований, набор «Хеликопол ВА» - 800 пары оснований, набор «Хеликопол IA» - IсеА1-250 пары оснований, IсеА2-334 пары оснований.
Определение уровня цитокинов в сыворотке крови детей с гастродуоденальной патологией проводили с использованием набора Bio-Plex ProHuman Chemokine Panel (40-Plex; Bio-Rad, Hercules, CA) методом мультиплексного анализа с применением магнитных шариков на базе Института фундаментальной медицины и биологии Казанского федерального университета (руководитель лаборатории д.м.н., профессор Ризванов А.А.).
Панель цитокинов состояла из тестов на 40 цитокинов, включая CCL21, CXCL13, CCL27, CXCL5, CCL11, CCL24, CCL26, CX3CL1, CXCL6, CXCL1, CXCL2, CCL1,IFN-,IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8,IL-10, IL-16, CXCL10, CXCL11, CCL2, CCL8, CCL7, CCL13, CCL22,MIF, CXCL9, CCL3, CCL15, CCL20, CCL19, CCL23, CXCL16, CXCL12, CCL17, CCL25,TNF-. Анализ проводили согласно инструкции производителя.
Диско-диффузионный метод Выделение и культивирование Н.pylori проводили согласно методике, описанной в разделе 2.3.2. Далее на поверхность агара в чашки Петри помещали диски, содержащие определенное количество антибактериального препарата. Чашки инкубировали в термостате при температуре 35-37С в течение 12 часов. Диффузия антибиотика в агар приводит к формированию зоны подавления роста микроорганизмов вокруг дисков. Результат учитывали путем измерения диаметра зоны вокруг диска в миллиметрах согласно стандартной методике (2004 г.) [30].
Использовали стандартные диски: кларитромицин 15 мкг, амоксициллин 20 мкг, левофлоксацин 5 мкг, тетрациклин 30 мкг, метронидазол 30 мкг, фуразолидон 300 мкг.
На основании полученных количественных данных было выделено три группы изолятов: чувствительные, умеренно чувствительные и резистентные. Резистентными считали изоляты с диаметром зоны подавления роста 0-10 мм; умеренно чувствительными – 11-15 мм, чувствительными – 16 и более.
Определение наличия мутаций Helicobacter pylori в гене 23S РНК Helicobacter pylori
Экстракцию и очистку ДНК Н.pylori проводили по стандартной методике, описанной в разделе 2.3.2. Далее определяли наличие мутаций в 23S РНК (исследование проводилось по трем участкам в структуре гена 23S – A2142G, A2143G, T2717C), обуславливающих резистентность H.pylori к кларитромицину, методом гнездовой ПЦР. Первичная ПЦР проводилась со следующими праймерами: прямой праймер –5-CCACAGCGATGTGGTCTCAG-3, обратный праймер 5GTGTAGCTACCCAGCGATGCTC-3. В качестве матрицы использовали 5 мкл выделенного образца ДНК. Амплификация была выполнена в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия) по программе: первичная денатурация при 94С 2 мин, последующая амплификация в течение 30 циклов при 94С 30 с, 60С 30 с, 72С 40 с и стадия пост-синтеза 72С 10 мин. Вторичная ПЦР была выполнена с праймерами Hp4 (GTCGGTTAAATACCGACCTG) и Hp2 в объеме 50 мкл, где в качестве матрицы использовали 2 мкл амплификата из первичной ПЦР. Реакцию проводили при тех же условиях.
Результаты определения Helicobacter pylori у детей с гастродуоденальной патологией
До настоящего времени остается открытым вопрос, что предопределяет развитие той или иной формы гастродуоденальной патологии у детей, инфицированных H.pylori. Возможно, это обусловлено характеристиками макроорганизма, но не менее важную роль играют генетические особенности микроорганизма. В связи с этим на сегодняшний день остается актуальным изучение связи генетических особенностей H.pylori с заболеваниями верхних отделов желудочно-кишечного тракта у детей.
В настоящей работе исследованы генотипические особенности штаммов H.pylori у 49 детей (средний возраст 14,45±2,23 года) с хронической гастродуоденальной патологией, ассоциированной с H.pylori.
Полученные ДНК H.pylori были проанализированы методом ПЦР на одновременное присутствие генов cagA, babA, аллельных вариантов генов vacA и iceA.
Результаты распределения исследуемых генов вирулентности штаммов H.pylori, полученных у детей с ХГД и ЯБ ДПК, представлены в таблице 3.4.1.
Результаты генотипирования по генам сagA, ice A1 и ice A2, babA и субтипам гена vacA у детей с хроническим гастродуоденитом и язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки
Как следует из таблицы 3.4.1, в группе детей с ХГД по сравнению с пациентами с ЯБ ДПК достоверно чаще выявлялся ген iceA2 (р=0,05, ОШ = 1,94, 95% ДИ 1,1-7,76). В группе пациентов c ЯБ ДПК достоверно чаще встречался ген iceA1 по сравнению с детьми с ХГД (р=0,008, ОШ = 6,25, 95% ДИ 0,03-0,68).
При анализе особенностей клинических проявлений гастродуоденальной патологии у детей (болевой абдоминальный, диспептический, астеновегетативный синдромы) в зависимости от генотипов H.pylori статистически значимых различий выявлено не было (таблица 3.4.2).
Астеновегетативный синдром 35 9 34 8 34 8 37 10 35 9 36 9 35 10 34 8 36 p=0,31 p=0,18 p=0,18 p=0,40 p=0,31 p=0,21 p=0,65 p=0,18 p=0,59 По данным литературы, при оценке степени патогенности штаммов Н.pylori существенными являются различия по vacA-генотипу. Известно, что генотип vacAs2m2 проявляет незначительную токсическую активность, тогда как штаммы H.pylori с генотипами vacAs1m1 и vacAs1m2 имеют максимальный или средний уровень секреции цитотоксина, соответственно [133, 172, 173, 196].
В настоящем исследовании у детей с H.pylori–ассоциированной гастродуоденальной патологией преобладали штаммы с генотипом vacAs2m2 (22/49, 44,9%), определяющим низкую токсичность штаммов H.pylori. Генотип vacAs1m2 встречался у 30,6% (15/49) штаммов H.pylori. Комбинации генотипов vacAs1m1 и vacAs2m1 в нашем исследовании не встречались ни разу, что может быть следствием региональных особенностей распределения генотипов H.pylori у детей (таблица 3.4.3).
Отличительной особенностью нашего исследования стало выявление у одного (2,0%) пациента c хроническим гастродуоденитом штамма H.pylori с генотипом VacAs1m1m2, и у одного – c генотипом iceA1A2, что говорит об инфицированности одновременно более, чем одним штаммом H.pylori (таблица 3.4.3 и 3.4.5). Для оценки зависимости развития гастродуоденальной патологии (ХГД или ЯБ ДПК) от наличия генов вирулентности штаммов H.pylori использовали таблицы сопряженности с последующей проверкой гипотезы о независимости признаков: распределение по признаку наличия определенных генов не влияет на распределение по признаку «развитие ЯБ ДПК или ХГД». Для проверки гипотезы о независимости признаков использовались критерий Хи-квадрат (2) Пирсона (таблица 3.4.4).
Как видно из таблицы 3.4.4, статистически значимые различия установлены при наличии генов iceA1 и iceA2 у детей с ЯБ ДПК и ХГД (р=0,008 и р=0,05 соответственно). Таким образом, выявлено, что развитие гастродуоденальной патологии (ХГД или ЯБ ДПК) зависит от наличия гена iceA1 и гена iceA2, но не зависит от наличия генов cagA, vacAs1m2, vacAs2m2, babA.
Частота встречаемости обнаруженных комбинаций генов патогенности H.pylori у детей с H.pylori-ассоциированной гастродуоденальной патологией представлена в таблице 3.4.5.
Исходя из полученных результатов, из всех возможных комбинаций генотипов штаммов H.pylori (в отношении генов сagA, vacA, iceA и babA) в исследованных образцах было обнаружено 22 и установлено, что в группе больных ХГД преобладают штаммы с генотипами сagA-/vacAs2m2/iceA2 – у 11 (29,0%) детей, сagA-/vacAs2 – у 7 (18,5%) детей, сagA-/vacAs2m2– у 4 (10,5%) детей, сagA+/vacAs1m2/iceA2– у 4 (10,5%) обследованных детей.
Одной из наиболее существенных причин разнообразия штаммов Н.pylori является нестабильность генома этой бактерии.
Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что для обследованных детей с гастродуоденальной патологией в г. Казани характерно наличие преимущественно cagA- штаммов H.pylori и штаммов с генотипами, определяющими низкую вирулентность (vacAs2m2) микроорганизма. В ходе нашего исследования не установлено какой-либо связи между наличием генов cagA, vacA и babA Н.pylori и различными заболеваниями гастродуоденальной области у детей. Развитие язвенной болезни у пациента ассоциировано с наличием гена iceA1 H.pylori, хронического гастродуоденита – гена iceA2.
Цитокинам принадлежит важная роль в развитии и течении заболеваний гастродуоденальной зоны. При выявлении изменений показателей сывороточных концентраций цитокинов можно судить об активности воспалительных, иммунных процессов, прогрессировании заболевания и эффективности проводимой терапии [72].
Мы исследовали образцы сыворотки крови 62 пациентов (24 мальчика, 38 девочек; средний возраст 14±2,1 лет) с хроническим гастродуоденитом, в том числе 30 детей с наличием H.pylori (H.pylori был идентифицирован методом ПЦР биоптата) и 32 H.pylori-негативных детей –; контрольную группу составили 20 H.pylori-негативных пациентов соответствующего возраста и пола, не имеющих заболеваний гастродуоденальной области. Результаты исследования представлены в таблице 3.5.1.
Влияние полиморфизма гена CYP2C19 на эффективность эрадикационной терапии
С целью прогнозирования исхода эрадикационной терапии у детей с H.pylori–ассоциированной гастродуоденальной патологией нами была построена математическая модель – уравнение логистической регрессии.
Логистическая регрессия позволяет прогнозировать значение бинарной переменной в зависимости от выраженности определенного набора объясняющих признаков в виде качественных и количественных признаков. Эта задача решается уравнением: , (2) где: y–зависимый бинарный признак, который вне зависимости от коэффициентов регрессии и значений объясняющих признаков x находится в пределах от 0 до 1; b0 – свободный член, b1 и bn - регрессионные коэффициенты для признаков x1 и xn; exp – экспонента, число е (приблизительно равно 2,7182818284959045). Метод логистической регрессии применяется при соблюдении следующих условий: зависимая переменная (y) – качественный бинарный признак, объясняющие переменные – любые качественные или количественные признаки.
Для построения уравнения логистической регрессии нами использовались следующие факторы: мужской пол (да/нет), женский пол (да/нет), прием антибактериальных препаратов в анамнезе (да/нет), наследственность по язвенной болезни/раку желудка (отягощена/ не отягощена), резистентность к антибактериальным препаратам: фуразолидону (да/нет), амоксициллину (да/нет), метронидазолу (да/нет), кларитромицину (да/нет). Зависимый признак – исход эрадикационной терапии. После расчетов уравнение логистической регрессии для прогнозирования исхода терапии имеет следующий вид: где exp – экспонента, равная 2,7182818284959045; - свободный член уравнения логистической регрессии b0 = 1,456139; - объясняющие признаки, p 0,05; х1 – мужской пол (0,6562911) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 6,82%; - х2 – женский пол (0,8998481) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 9,44%; - х3 – прием антибактериальных препаратов в анамнезе (-1,842894) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 19,33%; - х4 – наследственность (-1,601422) значение показателя у пациента (отягощена – 1 / не отягощена - 0); 16,8%; - х5 – резистентность H.pylori к фуразолидону (-0,4254033) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 4,46%; - х6 – резистентность H.pylori к амоксициллину (1,00619) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 10,56%; - х7 – резистентность H.pylori к метронидазолу (0,2091001) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 2,19%; - х8 – резистентность H.pylori к кларитромицину (1,704057) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0); 17,88%. Нами была рассчитана доля влияния (%) каждого рассматриваемого фактора на исход проводимой эрадикационной терапии. Среди изученных факторов, оказывающих влияние на результаты эрадикационной терапии, доля приема антибактериальных препаратов в анамнезе составила 19,33%, отягощенной наследственности по язвенной болезни/раку желудка – 16,8%, резистентности к кларитромицину – 17,88%. оставляет 87,5%, то есть рассматриваемые нами факторы (прием антибактериальных препаратов, гендерные различия, отягощенная наследственность по язвенной болезни/раку желудка, резистентность к антибактериальным препаратам) определяют 87,5% исхода терапии, оставшиеся 12,5%, которые не рассматривались в рамках данного исследования, приходятся на другие факторы, которые могут повлиять на результат эрадикации; степень значимости уравнения логистической регрессии p=0,02042.
Для подтверждения значимости рассматриваемых факторов, влияющих на успех эрадикационной терапии, нами был произведен расчет уравнения логистической регрессии при шестой схеме лечения (эзомепразол (40 мг/сут) + амоксициллин (50 мг/кг/ сут) + кларитромицин (7,5 мг/кг/сут) + коллоидный субцитрат висмута (480 мг/сут)), где был выявлен неудовлетворительный результат лечения - эрадикация была достигнута лишь у 63,6% пациентов.
Уравнение логистической регрессии при данной схеме лечения имеет следующий вид: , (4) где exp – экспонента, равная 2,7182818284959045; - свободный член уравнения логистической регрессии b0 = 19; - объясняющие признаки, p 0,05; - х1 – мужской пол (-0,988317) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0), 1,29%; - х2 – женский пол (20,001) значение показателя у пациента (да – 1 / нет -0), 26,2%; - х3 – прием антибактериальных препаратов в анамнезе (-10,6907) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0), 14,00%; - х4 – наследственность (6,3404) значение показателя у пациента (отягощена – 1 / не отягощена - 0), 8,3%; - х5 – резистентность к амоксициллину (-15,4910) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0), 20,29%; - х6 – резистентность к кларитромицину (-20,7813) значение показателя у пациента (да – 1 / нет - 0), 27,21%.
Информативность модели составила 97,3%, степень значимости уравнения логистической регрессии p 0,001. Высокую диагностическую значимость в успехе эрадикационной терапии в данной группе занимали резистентность к кларитромицину (27,21%) и амоксициллину (20,29%), тогда как следующим по значимости фактором являлся прием антибактериальных препаратов в анамнезе (14,0%).
При детальном анализе исследуемой группы детей и оценке причин столь низкого процента эрадикации H.pylori нами было выявлено, что большинство детей, вошедших в данную группу, принимали антибактериальные препараты в анамнезе (амоксициллин - 6/11чел, кларитромицин - 5/11 чел.), выделенные штаммы H.pylori характеризовались резистентностью как к кларитромицину, так и к амоксициллину.
Использование разработанной модели может быть рекомендовано для практического здравоохранения. Подставляя в уравнение логистической регрессии значения перечисленных признаков (0 или 1), можно прогнозировать успех терапии. Целесообразность применения той или иной схемы эрадикационной терапии у конкретного пациента должна определяться критериями, предложенными Graham и соавт. (2014), в соответствии с которыми рекомендуется использовать схемы лечения, обеспечивающие уровень эрадикации не менее 85% [122]. Для оптимизации работы практикующего специалиста была разработана компьютерная программа (модель реализована в файле формата MS Excel), позволяющая после внесения индивидуальных показателей пациента рассчитать вероятность эрадикации H.pylori. Проверка работоспособности (оценка устойчивости и эффективности на разных наборах данных) уравнения логистической регрессии осуществлена на «экзаменационной» выборке.