Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Синдром Ниймеген у детей. Обзор литературы 11
1. 1. Синдром Ниймеген, общая характеристика 11
1.2. Патогенез и молекулярно-генетические особенности 12
1.2.1. Носительство мутации NBN 17
1. 3. Клинические проявления 18
1.3.1. Физическое, психомоторное и половое развитие при СН 19
1.3.2. Аномалии и пороки развития 19
1.3.2.1. Центральная нервная система 19
1.3.2.2. Скелетные аномалии 20
1.3.2.3. Кожа и волосы 20
1.3.2.4. Аномалии мочеполовой системы 20
1.4. Осложнения 21
1.4.1. Инфекционные осложнения 21
1.4.2. Аутоиммунные осложнения 22
1.4.2.1. Аутоиммунные цитопении 22
1.4.2.2. Интерстициальная лимфоцитарная болезнь легких 22
1.4.2.3. Гранулематозный дерматит 22
1.4.3. Онкологические осложнения 23
1.5. Лабораторные характеристики 26
1.5.1. Т- клеточный иммунитет 26
1.5.2. В-клеточный иммунитет 27
1.5.3. Функциональные дефекты лимфоцитов 27
1.5.4. Гуморальный иммунитет 27
1.5.5. Клональность 28
1.5.6. TREC (Т-клеточные эксцизионные кольца) и KREC (Каппа эксцизионные кольца) 28
1.5.7. Молекулярная диагностика 28
1.6. Диагностические критерии 29
1.7. Дифференциальная диагностика 29
1.8. Генетическое консультирование семьи и пренатальная диагностика 30
1.10. Лечение 31
1.11. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток 34
Глава 2. Материалы и методы исследования 36
2.1. Пациенты 36
2.2. Клиническая характеристика больных 36
2.3. Лабораторный анализ 38
2.3.1. Определение TREC / KREC 38
2.3.2. Генетическое исследование 38
2.3.3. Биопсия кожи и обнаружение вируса краснухи (метод ПЦР) 39
2.4. Прочие исследования 39
2.4.1. МСКТ легких 39
2.4.2. Биопсия легких, лимфатических узлов, субстрата опухоли 40
2.5. Лечение 40
2.6. Статистический анализ 40
Глава 3. Результаты исследования 42
3.1. Характеристика пациентов и клинические проявления СН 42
3.2. Особенности иммунологических показателей 44
3.3. Инфекционные осложнения 46
3.4. Аутоиммунные осложнения 47
3.5. Онкологические осложнения 50
3.6. Анализ TREC/ KREC 53
3.7. Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток 56
3.8. Выживаемость 57
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 67
Выводы 73
Практические рекомендации 74
Список литературы 75
Список сокращений 90
Приложение 91
- Патогенез и молекулярно-генетические особенности
- Лечение
- Аутоиммунные осложнения
- Обсуждение результатов исследования
Патогенез и молекулярно-генетические особенности
Cиндром Ниймеген относится к группе врожденных синдромов с хромосомной нестабильностью, которая включает синдром Блума, анемию Фанкони и атаксию-тельангиэктазию (АТ). Все эти нарушения характеризуются спонтанной хромосомной нестабильностью, иммунодефицитом и предрасположенностью к раку и имеют четкие цитогенетические особенности и чувствительность к специфическим агентам, повреждающим ДНК [7].
Ген NBN, мутации в котором приводят к развитию СН, картирован на хромосоме 8q 21 и имеет длину 50 т.п.н., состоит из 16 экзонов. Ген NBN кодирует белок нибрин, состоящий из 754 аминокислотных остатков с молекулярной массой 95 кДа. Нибрин – компонент ядерного комплекса белков Mre11/Rad50/NBN, который участвует в регуляции клеточного цикла и отвечает за репарацию двухцепочечных разрывов ДНК (выявление и коррекцию физиологических, в первую очередь возникающих при VDJ-рекомбинации в процессе формирования Т- и В-клеточных рецепторов, и патологических двухцепочечных разрывов ДНК [8] (Рисунок 1).
При синдроме Ниймеген имеется ряд особенностей, общих с AT: специфическая чувствительность к ионизирующему излучению, характерные хромосомные перестройки в культивируемых лимфоцитах и повышенная предрасположенность к злокачественным новообразованиям, особенно лимфоидным ракам. Основываясь на этих особенностях, ранее синдром Ниймеген классифицировали как вариант AT. После идентификации гена NBS (NBN) было показано, что мутация при синдроме Ниймеген отличается от АТ и клинические проявления и иммунологические нарушения имеют различия [9].
У пациентов с синдромом Ниймеген, наблюдаются хромосомные аномалии в культивируемых in vitro лимфоцитах [10]. Цитогенетические аберрации представляют собой перестройки с участием 7 и 14 хромосом [11]. Распределение точек разрыва на этих хромосомах является неслучайным и преимущественно определяется вокруг локусов иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора, где происходят процессы рекомбинации с двунитевыми нарушениями во время развития лимфоидных клеток. В норме двунитевые разрывы ДНК происходят в процессе V(D)J-рекомбинации генов иммуноглобулинов и Т-клеточного рецептора.
V(D)J-рекомбинация- механизм соматической рекомбинации ДНК, происходящий на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов и приводящий к формированию антиген-распознающих участков иммуноглобулинов и Т клеточного рецептора. Гены иммуноглобулина и Т-клеточного рецептора состоят из повторяющихся сегментов, принадлежащих к трем классам: V (variable), D (diversity) и J (joining). В процессе V(D)J-перестройки генные сегменты, по одному из каждого класса, соединяются вместе. Объединенная последовательность сегментов V(D)J кодирует вариабельные домены каждой из цепей рецептора или иммуноглобулина [12].
Именно с дефектами репарации ДНК связаны клинические и иммунологические проявления у пациентов с СН (нарушения со стороны синтеза иммуноглобулинов, нервной системы).
Клетки пациентов с СН характеризуются неспособностью активировать критические точки клеточного цикла и замедленным повышением уровня белка p53. Отличительными признаками при СН являются радиационная чувствительность, иммунодефицит и хромосомная нестабильность. Эта необычная комбинация фенотипов является характерным проявлением дефектного восстановления двухнитевых разрывов ДНК [13].
Комплекс MRE11-Rad50-NBS1 (MRN) задействован в обоих механизмах репарации (гомологичном и негомологичном) двухцепочечных разрывов. Комплекс определяет поврежденный участок ДНК и взаимодействует с концами поврежденной ДНК, удерживая их в непосредственной близости друг от друга для осуществления репарации.
Белок нибрин в составе комплекса белков Mre11/Rad50/NBN участвует в регуляции клеточного цикла. Как известно, клеточный цикл делится на 4 фазы: митоз (М) и синтез ДНК (S), разделенные двумя перерывами G1 и G2. Последовательность клеточного цикла выглядит следующим образом G1-S-G2-M. После воздействия ионизирующего излучения происходят двунитевые разрывы ДНК. Если происходит репарация ДНК, то клеточный цикл восстанавливается, если нет - происходит гибель клетки путем апоптоза или развивается мутантный клон. В норме клеточный цикл при воздействии радиации может быть блокирован в двух критических точках-перехода из G1 в S и/или из G2 в М фазу.
Онкогены играют важную роль в развитии опухолей. При СН утрата нормальной регуляции экспрессии протоонкогенов делает их активность бесконтрольной и превращает их в онкогены. Это происходит при пространственном перемещении протоонкогенов в процессе хромосомных перестроек или вследствие встраивания вирусных генов в геном клетки. Кроме активации протоонкогенов, происходит инактивация генов-супрессоров опухолевого роста [14].
Белок р53-ген, супрессирующий опухоли, участвует в передаче сигнала для регуляции клеточного цикла после повреждения ДНК различными агентами. Белок р53 замедляет переход клетки из G1 в S, чтобы произошла правильная репликация ДНК. Нарушение функции р53 приводит к неспособности клеток остановить пролиферацию или активировать апоптоз при повреждении целостности ДНК.
При синдроме Ниймеген нарушен контроль клеточного цикла в критических точках. Однако, у пациентов с СН функция АТМ-киназы, при активации которой происходит индукция р53, не нарушена, в отличии от пациентов с атаксией-тельангиэктазией. При СН р53 определяется в промежуточных количествах между нормальными клетками и клетками при атаксии-тельангиэктазии. Таким образом, при СН, несмотря на сниженный уровень р53, клетки способны блокировать клеточный цикл в G1 и G2 фазах [15].
Описано, что пациенты с мутацией c.657_661del5 имеют частичную активность белка нибрина из-за сохраненной остаточной функции его редуцированных фрагментов p26 и p70 (Рисунок 2), и это, вероятно, способствует частичной репарации ДНК при СН, в отличии от пациентов с атаксией– тельангиэктазией [16].
Лечение
При СН, как и при других комбинированных ПИДС, назначается регулярная заместительная терапия ВВИГ из-за дефицита IgG, на фоне которой поддерживается уровень IgG в сыворотке более 5,0 г/л (по меньшей мере 4-6 г/л) [90]. Использование иммуноглобулина для подкожного введения считается эффективным, удобным и хорошо переносимым методом введения иммуноглобулина, который значительно улучшает качество жизни пациентов с СН [91].
Важной проблемой является создание лекарственного средства для лечения кожных гранулем при СН, в настоящее время не описано доказанных эффективных методов лечения. Описано, что метотрексат, дексаметазон и циклофосфамид подавляют образование гранулем [47, 92].
Также, было показано, что терапия интерфероном-альфа-2b эффективна при лечении гипертрофических поражений кожи, связанных с вирусом герпеса 1-го типа, у пациентов с дефицитом DOCK8, что требует дальнейшего изучения как возможного метода лечения кожных гранулем у пациентов с СН [93].
При лечении интерстициальной лимфоцитарной болезни легких часто используют стандартную иммуносупрессивную терапию, однако это не эффективно. Исследователи показали, что у пациентов с ПИДС, в том числе и при СН, эффективным и безопасным методом лечения ИЛБЛ является назначение таргетной терапии Абатацептом или Ритуксимабом, в зависимости от характера патологической лимфоцитарной инфильтрации легочной ткани (преимущественно Т– или В–клеточной). Терапия Абатацептом и Ритуксимабом позволяет достичь как клинической, так и рентгенологической ремиссии ИЛБЛ и приводит к улучшению качества жизни пациентов [50].
В настоящее время не существует стандартных протоколов лечения опухолей у пациентов с СН, по аналогии с другим синдромом с повышенной ломкостью хромосом- синдромом Луи-Бар многие центры используют редуцированные протоколы полихимиотерапии (ПХТ) и избегают облучения [94]. Пациенты со зрелыми В-клеточными лимфомами получают ПХТ и ритуксимаб в соответствии с протоколом BFM-NHL [95].
Описано, что при СН, как и при АТ, имеется повышенный риск токсичности, связанной с ПХТ [96]. Смертность от лечения, описанная у пациентов с СН, в основном связана с сепсисом, но также сообщается о смерти из-за ранней антрациклиновой кардиомиопатии [97].
Исходя из этих наблюдений, общепринятой практикой является модификация лечения пациентов с СН путем ограничения доз некоторых химиотерапевтических агентов [98]. Скорее всего, изменение лечения путем снижения дозы или исключения некоторых противоопухолевых препаратов затушевывает конечные результаты. Сообщается о том, что введение химиотерапии с дозами более 80% предписанных лекарств было возможным. Рецидив НХЛ остается основной причиной неудачи лечения [64,98].
У детей с СН могут развиться злокачественные опухоли, отличные от лимфоидного происхождения. При лечении опухолей головного мозга (медуллобластома, глиома) у пациентов с СН применяется только ПХТ без лучевой терапии (описано 3 летальных случая пациентов с СН на фоне облучения ЦНС) [99, 100]. По данным группы исследователей протокола BFM-NHL у детей с НХЛ все исследуемые пациенты с СН получали полихимиотерапию в зависимости от опухолевого процесса, облучение не проводилось. Снижение дозы метотрексата и алкилирующих агентов применялось в зависимости от индивидуальной переносимости. Однако, необходимы дальнейшие многоцентровые исследования с использованием стандартизованных подходов [96,100].
Исследователи показали, что в группе пациентов с СН рекомендуется снижение химиотерапии до 50%, особенно в отношении антрациклиновых метотрексатов, алкилирующих агентов и эпиподофиллотоксинов, блеомицина и лучевой терапии. Более того, рекомендуется профилактика инфекции с использованием внутривенного введения иммуноглобулина вместе с противогрибковым и антибактериальным препаратом. Для замены радиотерапии или некоторых токсичных противоопухолевых препаратов в некоторых случаях следует рассматривать таргетную терапию с использованием моноклональных антител и ингибиторов киназы или трансплантацию костного мозга с кондиционированием с пониженной интенсивностью, однако это утверждение нуждается в дальнейших исследованиях. В целом, химиотерапия с пониженной интенсивностью не предотвращает развитие вторичных злокачественных новообразований [101, 102].
Аутоиммунные осложнения
Аутоиммунные осложнения отмечены у 12 пациентов (32,4%), медиана возраста дебюта составила 10,5 лет (4–14 лет). Аутоиммунные осложнения включали артрит – у одного пациента, тиреоидит – у 2, интерстициальную лимфоцитарную болезнь легких (ИЛБЛ) – у 4 пациентов, гранулематозный дерматит - у 5 пациентов (Таблица 3).
У 1 пациентки в возрасте 14 лет развился артрит с умеренной деформацией межфаланговых суставов пальцев кистей.
У 2 пациентов в возрасте 6 лет и 14 лет развился аутоиммунный тиреоидит, пациенты наблюдались в динамике эндокринологом, проводились контрольные исследования гормонального статуса и УЗИ щитовидной железы.
У 4 пациентов верифицирована интерстициальная лимфоцитарная болезнь легких (ИЛБЛ), медиана возраста манифестации первых симптомов составила 9,75 лет (6-13 лет). Верификация ИЛБЛ проведена на основании характерной МСКТ-картины в легких у всех пациентов (Рисунок 9), а также 2 пациентам выполнена диагностическая биопсия легких и по данным гистологического исследования также подтверждена ИЛБЛ.
Гранулематозное поражение кожи выявлено у 5 пациентов. Медиана возраста развития гранулематозного дерматита составила 9,4 года (4-13 лет). Во всех случаях для подтверждения диагноза проводили биопсию кожи, по данным гистологического исследования у всех пациентов выявлены признаки эпителиоидных гранулем с очагами некроза.
У 3 пациентов в биопсийном материале обнаружен вирус краснухи методом ПЦР. Пациенты с гранулематозным поражением кожи получали в лечении топические и системные антибиотики, противогрибковые препараты и топические стероиды с неудовлетворительным результатом. У 2 пациентов гранулематозное поражение кожи полностью разрешилось после проведения ПХТ, которая была в одном случае частью кондиционирования при ТГСК, в другом – лечения лимфомы (Рисунок 10).
Обсуждение результатов исследования
Синдром Ниймеген является первичным иммунодефицитом, распространенность которого имеет очень неравномерное распределение в мире. Возможно этим обусловлены небольшое количество публикаций по данной тематике и отсутствие международных стандартов терапии пациентов с СН. В самом крупном исследовании Wolska-Kusnierz и соавт. проведен ретроспективный анализ 149 пациентов с СН, зарегистрированных в базе данных ESID [70]. Ранее были опубликованы данные обследования несколько меньших когорт пациентов из Польши и других восточноевропейских стран [44,92]. Учитывая высокую частоту носительства «славянской» мутации гена NBN, это заболевание крайне актуально и для российских педиатров.
В нашем проспективном исследовании изучены 37 пациентов c СН, наблюдавшихся в Национальном медицинском исследовательском центре детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева. Таким образом, преимуществом данного исследования является единый подход к лабораторным тестам и лечению пациентов.
Как и следовало ожидать, большинство обследованных пациентов имели славянское происхождение – были русскими или украинцами. Интересно, что одна девочка со «славянской» мутацией происходила из близкородственной цыганской семьи. Кроме того, нами описаны брат и сестра из азербайджанской семьи с дефектом в гене NBN, отличном от славянской мутации, что говорит о необходимости настороженности в отношении СН при наличии соответствующего фенотипа, независимо от национальной принадлежности пациента и отсутствия у пациентов «славянской» мутации.
Казалось бы, учитывая характерные типичные фенотипические и синдромальные особенности, СН легко заподозрить уже в раннем младенческом возрасте. Однако в нашей группе средняя задержка постановки диагноза составила 6,5 лет и большинство пациентов были диагностированы не педиатрами или неврологами, которые постоянно наблюдали этих пациентов, а гематологами-онкологами в дебюте онкологического заболевания, а в некоторых случаях и позднее.
Основными клиническими проявлениями в нашей группе пациентов были онкологические и аутоиммунные осложнения. Среди последних было 4 пациента с интерстициальной лимфоцитарной болезнью легких – осложнением, которое лишь недавно стало выделяться из смешанной патологии легких при первичных иммунодефицитах [46, 57] и до настоящего времени не было описано при СН.
Интересно, что в отличие от других первичных иммунодефицитов, при которых цитопении являются основным аутоиммунным осложнением [46], в нашем исследовании у пациентов с СН их зафиксировано не было.
Еще одним редким осложнением ПИДС являются саркоидоподобные гранулематозные поражения кожи, которые были ранее описаны при различных ПИДС, в первую очередь у пациентов с атаксией–тельангиэктазией [52, 54], при этом лишь у 2 пациентов с СН [57,51].
В исследуемой нами группе это осложнение выявлено у 5 пациентов, диагноз верифицирован на основании гистологического исследования. По нашему опыту и согласно публикациям других авторов, гранулемы резистентны к различным способам терапии, и у части наших пациентов полностью разрешились только после проведения интенсивной ПХТ в рамках лечения опухолей или кондиционирования при ТГСК. При СН, как и при других ПИДС, патогенез гранулематозного поражения кожи до сих пор неясен. Интересной находкой было определение в кожных гранулемах части пациентов с ПИДС вакцинного штамма вируса краснухи RA27/3 [55, 56]. Мы обнаружили вирус краснухи в гранулемах кожи у 3 из 5 пациентов. Эта находка крайне интересна и требует дальнейшего изучения, так как возможно открывает новые пути терапии этих инвалидизирующих состояний. Так, было показано, что терапия интерфероном-альфа-2b эффективна при лечении гипертрофических поражений кожи, связанных с вирусом герпеса 1-го типа, у пациентов с дефицитом DOCK8 [93].
Известно, что высокая частота злокачественных новообразований является отличительной чертой многих комбинированных ПИДС, с вариабельностью между группами иммунодефицитов и наибольшей частотой среди синдромов хромосомных поломок [59]. Wolska-Kusnierz и соавт. сообщают, что в их исследовании частота опухолей достигла 42%, и почти половина этих случаев (44%) закончилась летально [70].
Мы наблюдали еще более высокую частоту онкологических осложнений (67,5%) при СН, однако смертность от опухолей в нашей когорте была намного ниже и составила 28% (Приложение, Таблица 3).
Частично это может быть объяснено тем фактом, что в отличие от исследования Wolska-Kusnierz и соавт. [70] наши пациенты были в основном моложе 18 лет, а педиатрические опухоли часто имеют лучший прогноз. Однако, по нашему мнению, основным фактором, способствующим высокой выживаемости в нашей когорте пациентов с лимфоидными опухолями, является применение ПХТ без редукции доз в соответствии с принятыми протоколами, наряду с регулярным введением ВВИГ, независимо от предшествующего инфекционного анамнеза и концентрации IgG. Несмотря на предположенную ранее непереносимость ПХТ в виде токсичности при синдромах с дефектами репарации ДНК [8], большинство этих исследований были проведены у пациентов с атаксией–тельангиэктазией или в смешанных группах больных с атаксией– тельангиэктазией и СН [96, 101–102, 94].
В нашем исследовании мы отмечали хорошую переносимость немодифицированных режимов ПХТ. Объяснением этому может служить тот факт, что, как было продемонстрировано ранее [16], пациенты с мутацией c.657_661del5 имеют частичную активность белка нибрина из-за сохраненной остаточной функции его редуцированных фрагментов p26 и p70, и это, вероятно, способствует частичной репарации ДНК при СН, в отличии от пациентов с атаксией–тельангиэктазией. Учитывая высокий риск развития рецидивов опухолей при СН, мы считаем, что при их лечении необходимо использование нередуцированных протоколов ПХТ. Безусловно, переносимость стандартных протоколов ПХТ опухолей при СН требует дальнейшего изучения в больших и однородных группах пациентов.
СН относится к комбинированным иммунодефицитам, основные иммунологические нарушения при котором были подробно описаны ранее [1]. В нашей группе 22 пациента (59,4%) имели снижение уровня одного или нескольких классов иммуноглобулинов, у 20 (54%) были низкие значения В-лимфоцитов, а 24 пациента (64,8%) имели низкие значения Т-лимфоцитов. Несмотря на то, что многие из наших пациентов начали заместительную терапию ВВИГ и профилактическую антимикробную терапию в старшем возрасте из-за поздней постановки диагноза, все они во время исследования, независимо от концентрации IgG, получали ВВИГ. Этот факт может объяснить меньшую частоту развития тяжелых и летальных инфекций в нашей когорте по сравнению с тем, что описано Wolska– Kusnierz и соавт. [70], и то, что у наших пациентов не отмечено развитие оппортунистических или грибковых инфекций. Эти данные подтверждают важность заместительной терапии ВВИГ при СН, особенно на фоне иммуносупрессивной терапии опухолей и аутоиммунных осложнений.
Определение и оценка TREC/KREC являются широко используемым тестом для раннего выявления ПИДС и их последующего наблюдения. Низкие показатели TREC и KREC были описаны ранее у нескольких пациентов с СН [79, 80].
При исследовании значений TREC и KREC в подгруппе из 28 пациентов с СН мы обнаружили, что 78% пациентов имели значительно сниженные значения TREC, а 85% – сниженные значения KREC.
Таким образом, мы продемонстрировали теоретическую основу для включения СН в список ПИДС, которые могут выявляться при неонатальном скрининге с использованием TREC/ KREC [80].
Кроме того, мы показали, что низкие значения KREC (в отличие от TREC), по-видимому, являются предикторами развития тяжелых инфекций, онкологических и, возможно, аутоиммунных осложнений при СН и, следовательно, предикторами тяжелого течения заболевания.
Интересно, что в то время как уровни TREC варьировали у пациентов разных возрастов, уровни KREC постепенно уменьшались с возрастом в противоположность здоровым людям, у которых KREC остаются примерно на одном уровне в течение жизни. Следует отметить, что, хотя Wolska-Kusnierz и соавт. не изучали показатели TREC/KRECs, они также продемонстрировали, что тяжесть заболевания при СН коррелирует в большей степени с дефектом B-клеток, но не с дефектом Т-клеток [70]. В совокупности, эти данные говорят о значительной роли дефекта В- лимфоцитов в патогенезе СН и требуют дальнейшего изучения.
Ранее проведение ТГСК пациентам с СН не применялось широко из-за потенциального риска токсичности, связанной с кондиционированием, и того факта, что восстановление иммунитета не в состоянии полностью устранить предрасположенность к злокачественным заболеваниям в этой группе пациентов. Имеется лишь несколько публикаций о проведении успешной ТГСК пациентам с СН: описывают около 30 пациентов из всех стран [107,72,106,108], однако выживаемость у них составила выше 70%. Наш довольно большой опыт ТГСК при СН согласуется с международным и говорит об успешности этого вида терапии при СН: из 15 пациентов, получивших ТГСК с TCR+/CD19+ деплецией трансплантата в ходе исследования, 12 живы и 10 имеют хороший химеризм и восстановление иммунитета.
Мы проанализировали вероятность выживания с момента постановки диагноза СН (когда принимается решение о ТГСК) и показали, что в группе пациентов, получивших ТГСК, она была намного выше.
Поскольку проведение ТГСК не устраняет полностью предрасположенности к злокачественным новообразованиям у пациентов с СН, требуется более длительное наблюдение за данной когортой больных после трансплантации.
Тем не менее, краткосрочное наблюдение говорит о том, что ТГСК с TCR+/CD19+ деплецией трансплантата является успешным куративным методом лечения пациентов с СН, и, по нашему мнению, должна рассматриваться в качестве метода лечения для всех пациентов с СН до развития злокачественных осложнений или тяжелых инфекций, особенно для лиц с низкими показателями TREC и KREC, которые свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе заболевания.